ST-12: Replicación por Círculo rodante

(pMV158). Origen de replicación de banda

temprana (dso) y banda tardía (sso).
Mecanismos moleculares de la replicación de
banda temprana y tardía. Regulación de la
replicación.
 Plásmidos RCR

• Replicación por mecanismo de círculo rodante RC

• Genera intermediarios de ssDNA que corresponde
solo a la banda continua
• Número promedio de copias de 20 a 30 copias por
genoma equivalente
• Tamaño desde 846 bp (plásmidos de Thermonaga
pRQ7, pMC24 y pRKU1) hasta 30 kb pCG4 de
Corynebacterium glutamicum
• Generalmente tamaño no mayor a 10 kb

2
 Replicación “círculo rodante” (RC)

• Estudios sobre los mecanismos moleculares de la

replicación RC principalmente de plásmidos de
bacterias gram-positivas Staphylococcus y
Streptococcus
• PcrA helicasa identificada en bacterias gram-positivas
• PcrA en la replicación de plásmidos RCR se une
tanto a ssDNA como dsDNA

3
 Organización genética de plásmidos RC

• Plásmidos RC tienen una organización modular común

• Tres módulos codificadores:
• Replicación y control (LIC)
• Resistencia a antibiótico
• Transferencia (Mob: movilización)

4
 Familias de plásmidos RCR
Microbiol Mol Biol Rev. 2022
En base al replicón básico :
• Rep_1
pC194 pUB110
• Rep_2
pMV158 pE194
• Rep_trans
pT181 pC221

5
 Tipos de orígen de la replicación de plásmidos RC

• Replicación de banda continua: orígen en dsDNA dso

• Replicación de banda discontinua: orígen en ssDNA sso
• ssoA
• ssoU (interacción con RNAP de bacterias de diversos
grupos)
• ssoT
• ssoW
6
 NC_010096.1

• Un orígen en dsDNA (dso)

• Dos orígenes en ssDNA (sso)
• ssoU
• ssoA 7
 Orígen en ssDNA sso de pMV158

5237 ctatttgacaa 5247

|||||||||||
5352 gataaactgtt 5342

• ssoA funcionalidad esta restringida a los estreptococos

• Contiene secuencias repetidas invertidas

8
 Orígen en ssDNA sso de pMV158

3243 tttttattttg 3253

|||||||||||
3354 aaaaataaaac 3344

3259 ttttgtccgtt 3269

|||||||||||
3348 aaaacaggcaa 3338

3488 tttctttttt 3497

||||||||||
3514 aaagaaaaaa 3505

• ssoU reconocido en la mayoría de bacterias del grupo

Firmicutes
• Contiene secuencias repetidas invertidas
9
 ssoU de pMV158
• Plásmido promiscuo: el ssoU es funcional en diversas
bacterias
• Firmicutes
• S. mutants, S. thermophilus, S. oralis, S. sanguis, S.
gordonii,
• Bacillus subtilis, B. stearothermophilus, B. cereus
• Listeria
• Staphylococcus aureus
• Lactococcus lactis
• Enterococcus faecalis
• Clostridium
• Actinobacteria
• Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium)
• Proteobacteria
• Escherichia coli. 10
 Replicón de pMV158

• ssoA orígen
• El sso para mecanismo alternativo de replicación de la
banda discontinua
• dso orígen de replicación de la banda continua
•dos secuencias invertidas repetidas
•Tres secuencias repetidas directas (“direct repeats”) de 11 nt
•copG: codifica proteína represora CopG
•repB "Rep_2" : codifica la proteína iniciadora de la replicación

11
 dso de pMV158

83 aaaagaaagacagtag 98 533 TCGGCGACTTT

|||||||||||||||| 1 TCGGCGACTTT
120 ttttctttctgtcatc 105
544 TCGGCGACTTT
1 TCGGCGACTTT

555 TCGGCGACTTT
1 TCGGCGACTTT
•dso contiene dos loci bien definidos:
•Locus “bind” de unión para la proteína RepB al ADN
plasmídico
•Locus “nic” de corte: la proteína RepB introduce el corte
inicial 12
 Replicación RC (RCR)
• Proceso asimétrico debido a que la síntesis de la banda
continua y discontinua se lleva a cabo en dos etapas
desde los orígenes de replicación dso y sso
• Replicación por el mecanismo RC es principalmente
unidireccional (dso)
• Un requisito estricto como sustrato para iniciar la
replicación es el DNA super-enrollado (SC)
• Replicación es iniciada por una proteína multifuncional
codificada por estos plásmidos
• RepB/RepC/RepD
• Tiene actividad de transferasa (corta y une ADN
plasmídico)
• Recluta la helicasa no replicativa PcrA

13
a) síntesis de la banda continua

• RepB corta una banda (nic) en el dso y genera el 3’ OH el

cual sirve como “primer” para que la DNA polimerasa III inicie
la replicación de la banda continua
• RepB permanece covalentemente unida al 5’PO4 por un
enlace de fosfotirosina
14
• RepB recluta a la helicasa no replicativa PcrA en el sitio de
corte
• 3’ OH que sirve como primer para DNA Pol III
• La elongación a partir del 3’ OH es simultaneo con el
desplazamiento de la banda unida a RepB
• La elongación termina en el dso , donde la proteína RepB
cataliza una reacción de transferencia de banda de ADN y se
libera RepB en forma inactiva
15
• Los productos finales de la replicación de la banda
continua son:
• Una molécula de doble banda (dsDNA) y la proteína
RepB inactiva
• Un intermediario de una banda (ssDNA) que
corresponde a una de las bandas parentales del ADN
del plásmido

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 b) Síntesis de la banda tardía

• El sso es reconocido por la ARN polimerasa del huésped

(RNAP)
• RNAP sintetiza un “primer” con una longitud promedio de 20
bases, el cual funciona como iniciador de la replicación de la
banda tardía
• El “primer” es extendido por las DNA polimerasas (Pol I y Pol
III)
17
18
 Control de replicación de los plásmidos-RCR

• El control de la replicación es por elementos

codificados en el replicón básico que actúan
negativamente para:
• limitar la frecuencia de replicación una
vez/copia/ciclo cellular
• corregir las fluctuaciones del número de copias
durante la duplicación de la bacteria huésped

19
Mecanismos de control de replicación de pMV158

(a) Represión transcripcional por proteína represora copG

(b) Represión post-transcripcional por asRNA II

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Represión transcripcional por proteína represora CopG

• Regulación negativa por la proteína CopG a nivel del

promotor copG-repB

21
 Represión post-transcripcional por asRNA II

• El asRNAII se une directamente desde el 5’ del

codón de inicio de mRNA-repB, ocluye el RBS
• Inhibición de la traducción de proteína iniciadora de
la replicación (RepB)
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