EXTRACCIÓN DE ACEITE ESCENCIAL DE EUCALIPTO POR

ARRASTRE DE VAPOR
Lerlly Tatiana Agronoa* Johan Sebastián Ballesterosb* Andrés Felipe Londoñoc* Jhoan Sebastián
Pinzónd* Juan Sebastián Reye* Angie Lorena Sánchezf*
ltagronom@unal.edu.co a, jsballesterosg@unal.edu.cob, aflondonos@unal.edu.coc jspinzont@unal.edu.cod,
jsreyv@unal.edu.coe , alsanchezn@unal.edu.cof
*
Estudiantes del programa de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería y Arquitectura,
Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales

Febrero de 2019

RESUMEN
La fermentación es la forma más común para la obtención de etanol e históricamente se ha
desarrollado con el fin primario de obtener bebidas alcohólicas. Sin embargo, ante la exigencia de
desarrollar fuentes de energía amigables con el medio ambiente el etanol es producido como aditivo
para aumentarla eficiencia de combustibles de origen fósil, por lo que su producción se ha
tecnificado e intensificado y hasta las materias primas de las cuales se obtiene han variado. El
siguiente trabajo presenta el estudio de una fermentación a partir de melaza de caña de azúcar la
cual es un subproducto del proceso azucarero utilizando sepas de Saccharomyces cerevisiae para
producir etanol, señalando las variables de seguimiento de proceso y la influencia de estas sobre la
fermentación, además de predecir el rendimiento total del proceso y finalmente proponer sistemas
de tratamiento para los residuos generados posterior a la obtención de etanol como planteamiento de
un proceso con un impacto ambiental reducido.
Palabras clave: Fermentación, Etanol, Saccharomyces Cerevisiae

ABSTRACT

Keywords:
INTRODUCCIÓN
La fermentación ha sido señalada, por algunos autores, como aquel proceso que utiliza
microorganismos para la generación de productos de alto valor agregado; sin embargo, su
definición ha sido restringida para procesos anóxicos (ausencia de oxígeno), aunque por extensión
puede ser aplicado a diferentes condiciones [1]. Por ende, estos procesos pueden ser clasificados de
acuerdo a las condiciones en que actúa el microorganismo: fermentación aerobia y anaerobia,
ejecutadas en presencia y ausencia de aire, respectivamente; y anóxica, requiriendo la ausencia de
oxígeno. De esta última, la fermentación etanólica es la más aplicada a nivel industrial [2].
La fermentación etanólica es un proceso anóxico en el que las levaduras y algunas bacterias, a
través de vías metabólicas caracterizadas por reacciones bioquímicas y enzimáticas, descomponen
cierto conjunto de carbohidratos para obtener etanol y dióxido de carbono (CO2). Los
microorganismos descarboxilan el piruvato obtenido de la glicólisis para obtener acetaldehído, y
posteriormente se reduce a etanol. Este producto es de gran demanda en el mercado debido a su
diversa aplicación en las industrias de alimentos, combustible y química. Además, sus
características fisicoquímicas le otorgan propiedades tales como su alto calor de combustión, su
potencial bactericida, y grandes ventajas como su facilidad para ser transportado y mezclado con
algunos aditivos [1].
De las materias primas utilizadas en una fermentación etanólica se incluyen granos, almidones,
azúcares y melazas de remolacha azucarera o de caña de azúcar. En Colombia se usa principalmente
la melaza de caña de azúcar [2]. La melaza es un líquido denso y viscoso de color oscuro,
subproducto del proceso de refinación de la sacarosa a partir de la caña de azúcar. Sus principales
aplicaciones radican en la fabricación de alimentos concentrados de ganado vacuno, como
suplemento alimenticio para el ser humano, fertilizante para suelos, combustible y para la
preparación de pavimentos. La melaza se clasifica según su contenido de azúcar y humedad total:
Blackstrap, que contiene de 48.5% a 53.5% en sacarosa y 23.5% a 26.4% de agua; Superior a
Blackstrap, compuesta por 53.5% o más en sacarosa y menos del 23.5% en agua; y High Test, con
un 85% en peso de materia sólida [3].
El microorganismo de preferencia para este tipo de fermentación es la levadura Saccharomyces
cerevisiae, eucariota unicelular cuya colonia es de color crema o blanco, de apariencia húmeda y
brillante con bordes irregulares; tiene de 2.5 a 10 µm de ancho y 4.5 a 21 µm de largo;
microscópicamente se observan redondas, ovoides, elipsoides, cilíndricas y filamentosas. Para su
reproducción apropiada, la S. cerevisiae requiere de nutrientes como carbono, nitrógeno y fósforo;
se ve favorecida por un pH entre 4.0 y 5.0, y su temperatura óptima de crecimiento se encuentra
entre 28 y 30°C. El espectro de sustratos que asimila este microorganismo comprende azúcares tales
como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa [1]. Las constantes
cinéticas reportadas en la literatura para la S. cerevisiae son Ks=2.5x10-4 g/L para una concentración
celular inicial y final de 3 y 5.8 UFC/mL, respectivamente, y un tiempo de duración de la fase
exponencial de 3.5 horas, además de la velocidad máxima de crecimiento µ máx = 0.188 h-1 [4]. Cabe
destacar que la glucólisis es el mecanismo mediante el cual se oxida la glucosa hasta piruvato,
seguida de la generación de acetaldehído y otros compuestos de fermentación, para posteriormente
ser transformado en etanol. También conocida como ruta Embden Meyerhof en atención a sus
descubridores, es la ruta metabólica empleada por la levadura Saccharomyces cerevisiae. Los
detalles de esta ruta se muestran en la Figura 1.

Figura 1. Ruta metabólica de la producción de metanol en S. cerevisiae. HK: Hexoquinasa, PGI: Fosfoglugosiomerasa,
PFK: Fosfofructoquinasa, FBPA: Fructosa bifosfato aldolasa, TPI: Triosa fosfato isomerasa, GAPDH: Gliceraldehído-
3-fosfato aldolasa, PGK: Fosfoglicerato quinasa, PGM: Fosfogliceromutasa, ENO: Enolasa, PYK: Piruvato quinasa,
PDC: Piruvato descarboxilasa, ADH: Alcohol deshidrogenasa.

Para este tipo de fermentación no existe un estándar en cuanto a las condiciones de operación, pues
hay una gran variabilidad en las características tanto del sustrato como del microorganismo.
Además, algunas de estas condiciones dependen de su aplicación y, por ende, de los tratamientos
específicos empleados. No obstante, las condiciones suelen estar en un rango de temperaturas de 23
a 36 °C y un pH entre 3.9 y 4.6 como las más óptimas [2].

El objetivo de este estudio radica en el análisis de las condiciones de fermentación a través de la

ejecución de un seguimiento controlado de toma de medidas directas e indirectas de las variables de
operación, además de proponer tratamientos alternativos de los residuos (vinazas) generadas
durante la fermentación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación del medio de fermentación: Se prepararon 144 L de medio de fermentación o mosto

diluyendo 30 kg de melaza de caña de azúcar en agua hasta una concentración de solidos solubles
de 17°Bx en un contenedor tipo batch llamado marmita de 200 L de capacidad. El pH del medio se
ajusta con una solución de ácido sulfúrico (H 2SO4) al 60%. La temperatura se ajustó mediante
calentamiento a través de la chaqueta de la marmita usando vapor de agua como fluido de servicio.
Preparación del pre inóculo e inóculo: Para la activación del microorganismo, se disuelven 80 g
de levadura S. cerevisiae seca y granulada marca Levapan® en 500 mL de mosto. Posteriormente,
la mezcla anterior se disuelve en aproximadamente 2 L de mosto y se sometió a agitación constante
durante 30 minutos a __ rpm. Una vez activada la levadura, el mosto fue inoculado agregando la
mezcla agitada a la marmita.

Seguimiento de la fermentación: Se tomaron muestras del medio de fermentación en intervalos de

tiempo de 2 horas. Las variables medidas fueron el pH, la concentración de sólidos solubles y de
azúcares reductores totales (ART), la producción de biomasa, la temperatura y la altura del mosto.
El pH fue medido usando un pH-metro; la concentración de sólidos solubles fue determinada
utilizando un brixómetro digital ____ con calibración de temperatura incorporada; los ART se
midieron a través del método DNS (Anexo 1); la producción de biomasa fue determinada usando la
técnica de conteo directo de cámara de Neubauer (Anexo 2); la temperatura fue medida con ayuda
de un termopar y un lector digital ______; la altura fue determinada usando la paleta de mezclado,
usando como punto de referencia el fondo central de la marmita. Para el seguimiento de la
producción de etanol en la fermentación, se realizaron destilaciones diferenciales a dos muestras de
mosto de 500 mL cada una (Anexo 3).

Condiciones de operación: La fermentación comienza cuando el mosto es inoculado con S.

cerevisiae. En este punto, el mosto se ajusta a una temperatura entre 27 y 36 °C, pH igual o cercano
a 4.0 y una concentración de sólidos solubles iniciales entre 17 y 21°Bx. La finalización de la
fermentación se dará cuando el mosto alcance una concentración de etanol entre 7 y 8 °GL.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla 1 presenta el seguimiento de la fermentación de melaza de caña de azúcar para la
obtención de etanol usando la levadura S. cerevisiae. El tiempo total de fermentación fue de 47
horas.
Tabla 1. Seguimiento de las variables de fermentación en el tiempo. ART: Azúcares reductores totales.
Concentración
Tiempo Sólidos Temperatura Altura mosto ART
pH celular x107
[h] solubles [°Bx] [°C] [cm] [%]
[células/mL]
Día 1: 28 de agosto de 2018
0 17 35.6 4 1.18 31.5 4.7
2 16.4 33.7 3.9 1.28 31.5 6.9
4 16 32.7 3.82 1.61 31.4 7.88
6 16.3 33.1 4.046 2.35 31.1 9.97
7.5 16.2 31.1 3.95 2.8 31.1 5.36
Día 2: 29 de agosto de 2018
21.5 9.4 35.2 4.02 6.6 31.6 1.99
23.5 9.3 29.8 4.147 6.9 31.3 1.61
25.5 9.6 29.3 4.05 6.87 31.8 1.63
 27.5 9.7 28.4 4.07 6.92 31.6 1.94
29.5 9.7 27.7 4.12 6.93 31.5 3.01
31.5 9.7 31.7 4.175 6.73 31.5 3.39
Día 3: 30 de agosto de 2018
45 9.7 27.4 4.14 4.25 31.5 1.64
47 9.9 26 4.14 6.82 31.5 3.14

Comportamiento de la temperatura y pH.

El perfil de temperatura del mosto en el tiempo de la Figura 2 fue construido a partir de los datos de
la Tabla 1. En este, se observa que la temperatura se mantiene entre 26 y 36 °C, rango óptimo que
beneficia la producción de etanol sobre el crecimiento de la concentración celular de la S.
cerevisiae, a pesar de que ambos procesos se den de forma simultánea y paralela [1]. El
comportamiento de la temperatura fue relativamente estable, y se debe a un proceso conocido como
Rebobinación Metabólica de la levadura. En él, la levadura logra mantener las condiciones
favorables de temperatura en el medio de fermentación para propiciar su crecimiento a pesar de los
cambios ambientales a los que está expuesta. Este fenómeno está asociado a ciertos mecanismos de
respuesta al estrés que ha desarrollado el microorganismo para permitir su supervivencia en
condiciones previamente favorables que evolucionan a un evidente estado inestable y desfavorable,
impulsado por el equilibrio térmico que estos sistemas buscan alcanzar [5,6]. Dichos mecanismos
son conocidos como Protección Cruzada. De forma similar, el pH se mantuvo en un rango que
permite el adecuado desarrollo de la actividad metabólica de la levadura [5]. Este comportamiento
puede observarse en el eje secundario de la Figura 2.

40 4.2

38

35
Temperatura [°C]

32
pH

4
29

26
Temperatura [°C]
pH
23

20 3.8
0 10 20 30 40 50
Tiempo [h]

Figura 2. Comportamiento de la temperatura y pH en la fermentación.

Consumo de sustrato y producción de biomasa.

El consumo del sustrato en la fermentación fue evaluado mediante el monitoreo continuo de la
concentración de solidos solubles en solución [7], en este caso de sacarosa presente en el mosto. De
 acuerdo con reportes previos, cuando S. Cerevisiae se encuentra cultivada a concentraciones de
sustrato entre 30 y 40% se incrementa la producción de etanol [8].
La Figura 3ª y 3b muestran el comportamiento de los sólidos solubles y de los ART y su
acoplamiento a la evolución del crecimiento celular en el mosto respecto al tiempo,
respectivamente.

107 107
17 Concentración de sólidos soubles [°Bx]
11 Concentración de azúcares reductores totales [%]

Concentración de azúcares reductores totales [%]

Concentración celular [células/mL]
Concentración celular [células/mL]
16 10
Concentración de sólidos soubles [°Bx]

Concentración celular [células/mL]

Concentración celular [células/mL]

15 9

8
14 5
7 5
13
6

12 5

4
11
3
10
2

9
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo [h] Tiempo [h]

(a) (b)
Figura 3. Seguimiento de la concentración de (a) los sólidos solubles en solución y (b) los azúcares reductores totales
(ART) en relación con el crecimiento celular y su evolución en el tiempo.
La relación entre los sólidos solubles y los ART en el tiempo reflejan de forma más clara la
identificación de fases de consumo y crecimiento y otros aspectos descritos a continuación, en
concordancia con lo esperado para una fermentación etanólica a las condiciones estudiadas.

Partiendo de una concentración equivalente a 17°Bx al inicio de la fermentación (Figura 3ª), se

evidenció la evolución progresiva tendiente a su decrecimiento considerable debido a la acción del
microorganismo, indicativo de que el respectivo proceso metabólico de la fermentación se
desarrolló de manera satisfactoria [8]. El seguimiento de los datos indica por lo menos tres etapas
donde el comportamiento de la concentración de los sólidos solubles en solución refleja un patrón
determinado que, si se correlacionan con el crecimiento celular, coinciden claramente con las fases
del crecimiento y muestran el comportamiento esperado para este proceso fermentativo:
1. Etapa de decrecimiento de los sólidos solubles poco pronunciada que coincide con la fase de
latencia de la levadura, posterior a la inoculación.
2. Fase de decrecimiento acelerado de los sólidos solubles durante las primeras 24 horas de la
fermentación que coincide con la fase de crecimiento exponencial de las células, lo que
evidencia la mayor actividad metabólica durante la fermentación.
3. Una fase estacionaria de los sólidos solubles que se relaciona con la fase estacionaria del
crecimiento celular. Aunque en este periodo de tiempo sólidos solubles permanecen casi
 constantes, esto no es indicativo de un detenimiento de la actividad metabólica del
microorganismo; la fermentación aún sigue en curso durante este periodo, pero la medida de los
sólidos solubles se puede ver afectada por la presencia de otros componentes en el mosto,
incluida la biomasa (que también son sólidos solubles en solución), por lo que el seguimiento
de los grados Brix deja de ser un indicador objetivo en el seguimiento de la fermentación.

El contenido de azucares reductores totales (ART) del mosto (Figura 3b) se monitoreó
continuamente por el método de DNS (Anexo 1) debido a que este también es un indicador del
desarrollo de la fermentación. La levadura no posee la capacidad de asimilar los disacáridos
(sacarosa) que son dispuestos como sustrato mayoritario en el medio de fermentación. Sin embargo,
el microorganismo desarrolla un mecanismo enzimático para la obtención de glucosa a partir de
sacarosa. La enzima que participa en este proceso es llamada sacarasa, perteneciente a la familia de
las disacaridasas, enzimas que catalizan la separación del enlace glucosídico de los disacáridos para
formar monosacáridos [5,8]. Este mecanismo explica las diferencias entre las concentraciones de
sólidos solubles y de los azúcares reductores totales.

Partiendo desde una concentración de 4,7% de ART (tomando una base porcentual con respecto a la
cantidad total de azucares) el comportamiento observado durante la fermentación se relaciona
directamente con el crecimiento celular similar a como ocurre con los sólidos solubles: Una etapa
inicial de la fermentación, donde ocurre un aumento de los ART, señal de una acción enzimática
por parte de las levaduras relacionada a una fase de latencia y una exponencial temprana donde el
consumo de sustrato es poco; disminución considerable de la cantidad de ART ligada a la fase
exponencial del crecimiento celular donde se da la mayor actividad metabólica y el mayor consumo
de sustrato; y un pequeño aumento de la cantidad de ART con una estabilización, indicativo de una
fase estacionaria donde la rata de la acción enzimática es igualada por la rata de consumo por parte
de la levadura.

Posteriormente, para evaluar el rendimiento de la fermentación se realizó una destilación batch con
una cantidad inicial de 500 ml de mosto del cual se obtuvo una cantidad igual a 113ml de destilado
a una concentración de 26 oGL (26 % V/V). Se calculó la concentración de etanol en la muestra de
la siguiente manera:
mL Destilado∗◦GL destilado
◦GL muestra= =5,876 % (1)
mL Muestra

Suponiendo que la muestra tomada representa el comportamiento en el fermentador podemos

considerar que los oGL de la muestra son iguales a los obtenidos en el fermentador y teniendo un
volumen total de mosto de 144 L se estima a partir de estos datos que el volumen total de etanol
producido es igual a 8,46 L teóricamente.
Finalmente, el seguimiento de la altura del mosto se utilizó como parámetro cualitativo, el cual
definía qué tanto cambiaba el volumen del mosto en el tiempo, en medida de la generación de capas
de espuma en la superficie del medio de fermentación y de la acumulación y transformación de
componentes orgánicos en él.

Tratamiento de los residuos: Vinaza

La inadecuada disposición final y la poca evaluación de la vinaza como subproducto del proceso de
producción de etanol con utilidad económica y social [25], son problemas latentes en cuanto a la
generación de estos residuos. Estudios han propuesto métodos fisicoquímicos, químicos y
biológicos para su tratamiento, siendo los biológicos los más apropiados, debido a la gran cantidad
de compuestos orgánicos biodegradables que presentan en su composición [2]. El tratamiento de las
vinazas radica en la reducción del contenido de materia orgánica y nutrientes en ella para cumplir
con los niveles estipulados por la normativa local en términos de su disposición final [DYNA]. Así
pues, el proceso que se propone para el tratamiento de las vinazas obtenidas de la producción de
etanol se compone de 4 etapas:
1. Filtro Anaerobio de Flujo Ascendente (FAFA): También llamado reactor anaerobio, el
FAFA es un equipo utilizado como subunidad de plantas de tratamiento de agua. En este, la
vinaza se alimenta por la parte inferior del equipo, construido de forma que permita distribuir el
flujo en forma uniforme en toda la sección del filtro. La vinaza entra en contacto con una
superficie porosa, y luego con una fina biopelícula de microorganismos adheridos a la
superficie donde se realiza el proceso de degradación anaerobia [FAFA]. Los gases que se
generan en este proceso pueden ser retenidos por absorción en agua u otro compuesto líquido
que se ajuste a las características fisicoquímicas y termodinámicas de los gases generados en el
FAFA para su posterior separación selectiva. Los filtros anaerobios generalmente operan en el
rango mesófilo de temperaturas, es decir, entre 25 y 38ºC [FAFA]. Este proceso es descrito de
forma esquemática en la Figura 4.

Figura 4. Esquema de un Filtro Anaerobio de Flujo Ascendente [FAFA].

2. Biodisco: También conocido como Contador Biológico Rotatorio (CBR), el biodisco es uno de
los sistemas más recientes para el tratamiento de aguas residuales a través de la remoción de la
 Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) y para el pulido de efluentes nitrificados. Consiste de
una serie de discos de plástico colocados en un eje horizontal e instalados en un tanque de
concreto. Los discos giran a velocidades entre 1 y 2 rpm y aproximadamente el 40% del área
superficial de los discos está sumergida en el agua residual que está contenida en un tanque de
concreto. Los microorganismos presentes en el agua residual comienzan a fijarse y
multiplicarse en la superficie de los discos que se cubre con una película de biomasa. Durante la
rotación, el reactor acarrea una película de agua residual, la cual absorbe oxígeno del aire. La
biomasa, descompone la materia orgánica soluble aeróbicamente hasta sustancias más simples.
El consumo de oxígeno y la remoción de la materia orgánica se efectúa mientras que el sistema
gira a través del agua residual, contenida en el tanque de concreto. Las fuerzas de fricción
ejercidas sobre la biomasa al girar los discos dentro del agua residual, provocan que el exceso
de microorgnismos se desprenda. Esto evita la producción excesiva de la película biológica
manteniéndola con un espesor casi constante. La rotación del sistema mantiene en suspensión a
la biomasa desprendida hasta que el flujo de agua la saca del sistema. La Figura 5 muestra la
vista frontal de un sistema de biodiscos en perpendicular al eje de rotación [BIODISCOS].

Figura 5. Vista frontal de un sistema de biodiscos perpendicular al eje de rotación [BIODISCOS].

3. Humedales: La remoción de contaminantes dentro de estos sistemas se da por medio de

interacciones complejas de carácter fisicoquímico y microbiológico que ocurren al hacer pasar
lentamente el agua residual a través de un lecho arena, grava, arcilla con raíces y rizomas de
vegetación emergente. Algunos de los mecanismos que intervienen en la remoción de los
compuestos orgánicos fosforados, azufrados y nitrados son la biodegradación microbiana, la
captación por las plantas, la adsorción en el lecho y la volatilización. En la Figura 6 se muestra
una imagen de la aplicación de humedales para el tratamiento de aguas residuales [11,12].
 Figura 6. Esquema del tratamiento de aguas residuales con humedales [HUMEDAL].

4. Filtro prensa: Es uno de los métodos por filtración más usados. Consisten en una serie de
placas y marcos alternados con una tela filtrante a cada lado de las placas, las cuales poseen
incisiones con forma de canales para drenar el filtrado en cada placa. Es un proceso de bajo
consumo energético y de alta eficiencia de compactación, obteniendo tortas semisólidas de fácil
disposición y agua clarificada de excelente calidad. Así, en este proceso se hará retención de
compuestos simples en solución que no fueron eliminados en las etapas anteriores La Figura 7
describe de forma esquemática un filtro prensa común [FP].

Figura 7. Esquema del sistema de filtro prensa.

Una vez se aplique el tratamiento propuesto, se espera que los efluentes estén compuestos por
cantidades muy pequeñas de componentes orgánicos simples o productos de su descomposición,
ajustándose a la reglamentación de vertimientos local asociada a cuerpos de agua industriales y
emisión de gases y vapores. Otros tratamientos secundarios pueden ser utilizados para disminuir la
carga en solución de la corriente residual en mayor medida.
CONCLUSIONES
 Existe una gran variación de las condiciones de operación de una fermentación dependiendo de
la naturaleza de la materia prima y microorganismos involucrados, así como los tratamientos
específicos que se apliquen para la obtención de determinado producto. Aun así, se logró
determinar de forma experimental que las condiciones óptimas para la fermentación etanólica
de melaza de caña de azúcar para la producción de etanol usando la levadura Saccharomyces
cerevisiae corresponden a un rango de temperaturas entre 27 y 36°C, pH cercano a 4.0 y una
concentración de sólidos solubles iniciales entre 17 y 21°Bx.
 El comportamiento de la temperatura fue relativamente estable debido la Rebobinación
Metabólica de la levadura y a mecanismos de respuesta a estrés conocidos como Protección
Cruzada, logrando mantener las condiciones favorables de temperatura en el medio de
fermentación para propiciar su crecimiento a pesar del cambio de condiciones que evolucionan
a un evidente estado inestable y desfavorable.
 El pH presentó un comportamiento similar al de la temperatura, manteniéndose en un rango que
permite el adecuado desarrollo de la actividad metabólica de la levadura.
 La evolución de la concentración de sólidos solubles en el tiempo indica por lo menos tres
etapas donde se refleja un patrón determinado que, si se correlacionan con el crecimiento
celular, coinciden claramente con las fases del crecimiento y muestran el comportamiento
esperado para este proceso fermentativo. Este mismo comportamiento se presentó al
correlacionar los azúcares reductores totales con el crecimiento celular.
 A pesar de que la Saccharomyces cerevisiae no asimila disacáridos o carbohidratos más
complejos (teniendo en cuenta que estos carbohidratos son las más comunes en la naturaleza),
el microorganismo ha logrado desarrollar mecanismos que le permite aprovechar sustancias
complejas para su desarrollo y reproducción, la obtención de energía y de metabolitos de gran
importancia comercial.
 En la fase final de fermentación, el reducido pero relevante incremento en la concentración
celular genera errores en la determinación de la concentración de sólidos solubles. En esta etapa
del proceso, el seguimiento de los sólidos solubles deja de ser un indicador objetivo en el
seguimiento de la fermentación.
 La altura del mosto fue monitoreada para la definición del cambio de volumen de la mezcla
fermentadora en medida de la generación de capas de espuma en la superficie del medio de
fermentación y de la acumulación y transformación de componentes orgánicos.
 El proceso propuesto para el tratamiento de las vinazas, residuo de la fermentación,
teóricamente permitiría la descomposición gradual de compuestos orgánicos a sustancias más
simples y la eliminación de componentes nitrados, fosforados y nitrados de la corriente residual
a través de métodos biológicos, y consiste en cuatro etapas fundamentales: Filtro anaerobio de
flujo ascendente (FAFA), biodiscos, humedales y filtro prensa.

AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al profesor Sebastián Pineda Pineda y al estudiante Darío Fernando Yepes
Vela por la orientación del módulo de fermentación y al Laboratorio de Procesos Productivos por
facilitarnos la melaza de caña de azúcar que fue utilizada como materia prima.

BIBLIOGRAFÍA

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%20Prensa.pdf

ANEXOS

ANEXO 1. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES POR

MÉTODO DE DNS.
Inicialmente se hace una preparación de los reactivos que han de ser empleados en la elaboración de
la curva patrón. Los reactivos son glucosa anhidra, NaOH, tartrato de sodio y potasio, DNS y agua
destilada.
Preparación de solución (stock) de glucosa (0.4%):
 Tomar 0.4 g de glucosa.
 Disolver en agua destilada y aforar a 100 ml.
 Preparación del DNS:
Solución 1
 Pesar 1.6 g de NaOH.
 Pesar 30 g de Tartrato de sodio y potasio.
 Disolverlos con 50 ml de agua destilada.
Solución 2
 Pesar 1 g de DNS.
 Disolver con 30 ml de agua destilada.
 Agregar lentamente y con agitación la solución de DNS (Solución 2) a la solución de tartrato y
NaOH (Solución 1).
 Aforar a 100 ml.
 Filtrar.
 Envasar en frasco ámbar. Duración de 3 meses.

Datos de la curva de calibración.

En la Tabla a2 y la Figura A1 muestran los resultados de la curva de calibración construida durante
la práctica.
Tabla 2. Datos curva de calibración
Concentració Absorbanci
n de ART a a 540 nm
[g/L]
4 1.382
2 0.693
1 0.395
0.5 0.176
0.25 0.083

Determinación de azúcares en la muestra problema

 Preparar diluciones con el fin de que su concentración se encuentre en el rango de detección
del método (curva patrón).
 0.5 ml de muestra problema ó 0.5 ml de solución patrón con 0.5 ml de agua destilada.
 Adicionar 0.5 ml de DNS.
 Agitar todos los tubos con vórtex.
 Llevar a ebullición por 5 min en baño maría.
 Enfriar hasta temperatura ambiente.
 Adicionar a cada tubo 5 ml de agua destilada y agitar con vórtex. En este punto se tiene que
distinguir una gama de tonalidades entre muestras que van desde la más oscura (la muestra con
más contenido de azúcar) hasta la más tenue (la muestra con menor contenido de azúcar).
 Dejar en reposo 15 min. y leer a 540 nm en el espectrofotómetro.

TOMADO DEL PREINFORME DE PINEDA

ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR EL CONTEO

DIRECTO DE CÁMARA DE NEUBAUER.
Los métodos a implementar en esta práctica son el conteo de células viables y la determinación de
peso seco.

Conteo de células mediante una cámara de recuento

La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado para realizar conteo de células en un medio de
cultivo líquido. Consta de dos placas de vidrio, entre las cuales se puede alojar un volumen
conocido de líquido. Una de las placas posee una cuadricula de dimensiones conocidas que es
visible al microscopio óptico.
La cuadricula consiste en un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas
consecutivas de 0.25 mm (ver Figura A2). Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1
milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la
superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro
cúbico.
 Figura A2. Zona de conteo de celulas en la camará de Neubauer

Para contar las células de un cultivo líquido, se agrega una gota de este entre estas dos placas y
observar al microscopio óptico la cantidad de células presentes en un campo determinado de la
cuadricula.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas,
la concentración en la suspensión celular será:
Concentración en la suspensión (células / ml) = 10000 (x/4) * Factor de dilución
Donde x = Nº de células contadas en la cámara de Neubauer

Procedimiento para recuento en cámara de Neubauer

 Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
 Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
 Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada.
 Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las
células. Es recomendable llenarla con micropipeta o con una jeringa ya que la cámara se llena
con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
 La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado
se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido
abundante en las terminaciones del recuadro. Esperar 5 minutos a que las células en suspensión
(si las hay) sedimenten.
 Lleve la cámara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X.
 Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y
con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los
cuadros. El conteo en estos campos de la cámara se conoce como AP (alto poder).
 Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo
siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten.
Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son
fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales
están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la
tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta
de conteo (ver Figura A3). Las células que tiene una X son las que no se deben contar.

Figura A3. Orden sugerido de conteo

 Después de contar las células se procede a calcular la el número de células por unidad de
volumen.
TOMADO DEL PREINFORME DE PINEDA

ANEXO 3. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL POR

DESTILACIÓN DIFERENCIAL
La muestra problema se somete a una destilación simple para separar el componente más volátil, en
este caso el etanol, de la mezcla de interés.
Procedimiento para la destilación
 Tomar 500 mL de la muestra problema y llevar a un balón.
 Realizar el montaje de un equipo de destilación simple, como se muestra en la figura A4.

Figura A4. Montaje equipo para destilación simple. (https://10conceptos.com/concepto-

de-destilacion-simple/)
 Someter a calentamiento hasta alcanzar una temperatura por encima del punto de ebullición
del componente de interés.
 Encender el sistema de enfriamiento del cual se disponga.
 Recoger en un beaker el destilado obtenido, caracterizar y determinar la cantidad de etanol,
para así determinar un supuesto o estimado del etanol que se puede obtener en total de todo el
fermentado. Falta como se hace cálculo

Tomado de ningún lado (experiencia)