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Artículo
Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca
debido a una infección persistente por SARS-CoV-2 mediante
un modelo cardíaco tridimensional

Kozue Murata,
Akiko Makino,
Keizo Tomonaga,
Hidetoshi
masumoto

tomonaga@infront.kyoto-u.ac .
jp (KT)
hidetoshi.masumoto@riken.jp
(HM)

Reflejos
SARS-CoV-2 persistente
modelo de infección del tejido
cardíaco humano fue
establecido

El estrés hipóxico en el modelo

de infección persistente
provocó disfunción cardíaca

La expresión de la proteína
ACE2 y SARS-CoV-2 S se elevó
después del estrés hipóxico

Esta investigación puede predecir una

"pandemia de insuficiencia cardíaca" en

la era posterior a la COVID-19

Murata et al., iScience --,

108641
- - , 2023ª2023 Los Autores.
https://doi.org/10.1016/
j.isci.2023.108641
 Cite este artículo en prensa como: Murata et al., Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca debido a la infección persistente por SARS-CoV-2 utilizando un
modelo cardíaco tridimensional, iScience (2023), https://doi.org/10.1016/j .isci.2023.108641

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Artículo
Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca debido
a una infección persistente por SARS-CoV-2 mediante un
modelo cardíaco tridimensional
Kozue Murata,1,3Akiko Makino,2Keizo Tomonaga,2,*y Hidetoshi Masumoto1,3,4,*

RESUMEN
Los pacientes con miocardiopatía crónica pueden tener infecciones virales persistentes en sus corazones, particularmente con el SARS-
CoV-2, que se dirige al receptor ACE2 altamente expresado en los corazones humanos. Esto genera preocupación sobre una posible
pandemia mundial de insuficiencia cardíaca derivada de la COVID-19, una pandemia de SARS-CoV-2 en un futuro próximo. Aunque nos
enfrentamos a esta advertencia sanitaria, la investigación sobre las infecciones cardíacas virales persistentes es limitada y no se han
establecido modelos. En este estudio, creamos un modelo de infección persistente por SARS-CoV-2 utilizando microtejidos cardíacos (CMT)
derivados de células iPS humanas. Las infecciones leves mantuvieron la presencia viral sin disfunción significativa durante un mes, lo que
indica una infección persistente. Sin embargo, cuando se expusieron a condiciones hipóxicas que imitaban las enfermedades cardíacas
isquémicas, la función cardíaca se deterioró junto con la reactivación intracelular del SARS-CoV-2 en los cardiomiocitos y la formación de la
red vascular interrumpida. Este estudio demuestra que el SARS-CoV-2 infecta persistentemente el corazón de manera oportunista,
provocando una disfunción cardíaca desencadenada por estímulos perjudiciales como la isquemia, lo que potencialmente predice una
pandemia de insuficiencia cardíaca en la era posterior a la COVID-19.

INTRODUCCIÓN
El número acumulado de personas infectadas con el nuevo coronavirus (SARS-CoV-2) superó los 754 millones y el número de muertes alcanzó los 6,8 millones
en febrero de 2023. La cepa mutante dominante del SARS-CoV-2 sigue siendo la BA. 5 (cepa micron) en todo el mundo (OMS, Edición 130).1El riesgo de letalidad
y hospitalización se reduce en las cepas delta y omicron en comparación con las cepas anteriores debido a varios factores, como una reducción de la gravedad
inherente del virus, un aumento de los brotes espontáneos, la vacunación y el uso de agentes terapéuticos (UKHSA, 2022). ).2La tendencia ha pasado de la
"pandemia de COVID-19" a la "post COVID-19", lo que nos anima a centrarnos no sólo en los síntomas de la fase aguda, sino también en los problemas de salud
crónicos.3
Se informa que la expresión de ACE2 en el corazón es mayor que en otros órganos.4Además, varias publicaciones informaron que la expresión de ACE2 en
cardiomiocitos es mayor en pacientes con insuficiencia cardíaca que en controles sanos.5–7Esto sugiere que el corazón es susceptible a la infección por SARS-
CoV-2, que es más pronunciada en condiciones perjudiciales como la insuficiencia cardíaca. Más de 10 años antes de la pandemia de COVID-19, varias
investigaciones revelaron la detección de genomas virales en muestras de biopsias endocárdicas de pacientes con miocardiopatía crónica idiopática, lo que
sugiere que la infección viral está profundamente involucrada en la patogénesis de la enfermedad. Estas investigaciones también sugieren que la infección viral
crónica afecta la función cardíaca.8,9Aunque en ese momento se reconocía que la infección viral persistente estaba asociada con la aparición y el progreso de la
miocardiopatía crónica, antes de 2019 se habían informado investigaciones muy limitadas centradas en la infección cardíaca viral persistente, posiblemente
debido al desconocimiento de su importancia en la atención médica. La pandemia de COVID-19 puede haber cambiado drásticamente la situación, ya que se
espera que la población en riesgo de sufrir insuficiencia cardíaca en el futuro debido a una infección persistente por SARS-CoV-2 aumente exponencialmente.
Aunque hasta el momento no se ha informado evidencia clínica concluyente de que la infección persistente por SARS-CoV-2 esté asociada con una función
cardíaca disminuida, el estudio de prueba de concepto sobre la posibilidad de una infección persistente del corazón por SARS-CoV-2 y el potencial El riesgo de
progresión oportunista de la insuficiencia cardíaca debería validarse mediante un modelo tridimensional de tejido cardíaco humano que sirviera como alarma
de un riesgo sanitario global.

RESULTADO

Establecimiento de un modelo de infección persistente por SARS-COV-2 utilizando microtejidos cardíacos derivados de células iPS humanas

En el presente estudio, demostramos experimentalmente una infección cardíaca persistente con SARS-CoV-2 y una disfunción cardíaca desencadenada por una lesión
isquémica utilizando microtejidos cardíacos (CMT) derivados de células iPS humanas (Figura 1A,Vídeo T1). Los CMT están compuestos por cardiomiocitos.

1Programa de investigación clínica traslacional, Centro RIKEN de investigación de dinámica de biosistemas, Kobe, Japón
2Laboratorio de Virus ARN, Departamento de Investigación de Virus, Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón
3Departamento de Cirugía Cardiovascular, Facultad de Medicina, Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón
4Contacto principal
* Correspondencia:tomonaga@infront.kyoto-u.ac.jp (KT),hidetoshi.masumoto@riken.jp (HM)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.108641

iCiencia --, 108641, --, 2023ª2023 Los Autores. 1

Este es un artículo de acceso abierto bajo licencia CC BY (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
 Cite este artículo en prensa como: Murata et al., Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca debido a la infección persistente por SARS-CoV-2 utilizando un
modelo cardíaco tridimensional, iScience (2023), https://doi.org/10.1016/j .isci.2023.108641

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B
Macroscópico
vista CD31 cTnt Fusionar (+DAPI)

D
ÉL cTnt Proteína S TÚNEL

C IMITAR

100000 IMITAR
Leve
Moderado
90000
Alto

80000 SARS-
CoV-2
70000

60000
PIPM

50000 mi
cTnt/Proteína S/DAPI
40000 IMITAR SARS-CoV-2
pag＞0,999
pag₌0.516

30000
pag₌0,191

20000

10000

0
1 2 3 4 5
ppp

Figura 1. Modelo de infección persistente del SARS-CoV-2

(A) Esquema conceptual del modelo de infección persistente SARS-CoV-2.
(B) Estructura similar a una red vascular de la CMT. (Izquierda) Observación macroscópica de CMT. (Derecha) análisis de inmunofluorescencia (IFA) de CMT para cTnT (verde) y CD31 (rojo)
después de 7 días de cultivo oscilante.
(C) Evaluación de la función cardíaca a lo largo del tiempo durante una infección persistente. PIPM: Índice pulsátil por minuto. Las líneas claras indican valores individuales; las líneas oscuras
indican valores medios. MOCK (sin infección, azul: n = 4), Leve (naranja: n = 5), Moderado (verde: n = 3), Alto (línea discontinua: n = 3).
(D) Análisis histológico de CMT después de 28 días de infección por SARS-CoV-2 en títulos leves. HE: tinción con hematoxilina-eosina, cTnT: isoforma cardíaca de troponina-T, TUNEL: marcaje
de extremo de mella dUTP mediado por TdT.
(E) IFA de CMT para cTnT (verde) y proteína S (roja) después de 28 días de infección con SARS-CoV-2 en títulos leves.
(F) Títulos de SARS-CoV-2 en sobrenadante de medio de cultivo de 7 a 28 ppp n = 4. Las barras de error muestran barras de escala SD: 1 cm en B (izquierda), 200metrom en B (derecha), 100metrom en D y E.
Los núcleos se tiñeron con 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; azul).

y otras células del componente cardíaco (células endoteliales vasculares y células murales vasculares) diferenciadas de las células iPS humanas10y producen una
estructura similar a una red vascular que imita morfológica y funcionalmente el corazón humano11(Figura 1B). Los CMT se infectaron con SARS-CoV-2 (SARS-
CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo) y la función cardíaca se evaluó mediante un método basado en vídeo para evaluar la contractilidad del tejido.12A los 7
días posteriores a la infección (dpi), los títulos leves, moderados y altos mostraron un deterioro funcional en comparación con el del grupo no infectado (MOCK)
(Figura 1C); lo que indica que la infección viral puede conducir a la reducción de la contractilidad del tejido en la fase aguda de la infección viral. Curiosamente,
los títulos leves y moderados mostraron una tendencia de recuperación en la función cardíaca a 28 ppp, mientras que los títulos altos mostraron una
disminución sostenible de la contractilidad sin recuperación, lo que puede indicar un caso clínico de deterioro de la función cardíaca durante la fase aguda de
COVID-19 que requiere corazón. trasplante.13El análisis histológico y el análisis de inmunofluorescencia (IFA) para CMT infectados con títulos leves revelaron la
expresión de la proteína de pico derivada del SARS-CoV-2 (proteína S; reconocida por el receptor del huésped) que se co-localizaba con los cardiomiocitos a 28
ppp (Figuras 1D y 1E). Sin embargo, la apoptosis de los cardiomiocitos fue el mismo nivel que en MOCK y la estructura de la isoforma cardíaca de la troponina T
(cTnT), el complejo de troponina de los cardiomiocitos, se mantuvo (Figura 1D). Medida de

2 iCiencia --, 108641, --, 2023

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A D
cTnt Proteína S Fusionar (+DAPI)
IMITAR
SARS-CoV-2

Pretratamiento

normoxia

Después de 48h de reperfusión hipoxia

B Hipoxia simulada
Normoxia simulada mi Pretratamiento Después de 48h de reperfusión
Hipoxia por SARS-CoV-2
Normoxia del SARS-CoV-2

IMITAR

CD31/DAPI
pag₌0,135
pag₌0,048
pag₌0.006

pag₌0.912

SARS-
CoV-2
pag₌0,657

C cTnt ACE2 Fusionar (+DAPI) Fusión (cTnT/ACE2)

Pretratamiento

normoxia

hipoxia

iCiencia --, 108641, --, 2023 3

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Artículo

Figura 2. Deterioro de la función tisular del modelo de infección persistente de SARS-CoV-2 desencadenado por estrés hipóxico
(A y B) Evaluación de la función cardíaca. ''SARS-CoV-2'' indica un modelo de infección persistente del SARS-CoV-2. (A) Latidos por minuto (BPM) antes del tratamiento y después de 48 h de condición de
reperfusión (n = 6 cada uno). Las barras de error muestran SD B, PIPM a lo largo del tiempo (n = 6 cada una).
(C y D) IFA para el modelo de infección persistente de SARS-CoV-2 antes del tratamiento (Pretratamiento), 18 h de tratamiento con hipoxia (Hypoxia) o Normoxia seguido de tratamiento de
reperfusión de 48 h. (C) cTnT (verde) y ACE2 (rojo). (D) cTnT (verde) y proteína S (roja). (E) CD31 (Verde). Barras de escala: C,D,100metrometro. (E) 500metrometro. Los núcleos se tiñeron con
DAPI (azul).

El título viral utilizando células VeroE6 mostró títulos virales altos hasta 28 ppp, lo que sugiere que los virus infectados persistentemente conservaron su capacidad de
amplificación y mantuvieron la infectividad en los tejidos adyacentes.Figura 1F). IFA reveló que esta infección persistente está presente en parte en las células endoteliales,
así como en los cardiomiocitos, mientras que la formación de la red vascular se vio ligeramente alterada sólo cuando una fuerte colocalización con la proteína S y CD31, un
fabricante de células endoteliales cardíacas,14fue detectado (Figura S1). Estos resultados indican que una infección leve puede provocar una infección persistente del tejido
cardíaco por SARS-CoV-2 sin provocar un deterioro funcional.

El estrés hipóxico bajo una infección persistente por SARS-COV-2 causa disfunción cardíaca
El modelo de infección persistente indicó experimentalmente que puede existir un grupo de pacientes con antecedentes de infección leve por SARS-CoV-2 que
desarrollaron una disfunción cardíaca leve, y que la función cardíaca global se compensa y puede mantenerse superficialmente sin desarrollar insuficiencia
cardíaca. Sin embargo, estos pacientes tendrían un riesgo marginal de insuficiencia cardíaca y podrían desarrollar de manera oportunista disfunción cardíaca y
eventualmente insuficiencia cardíaca bajo estrés cardíaco adicional.Figura 1A). Para validar experimentalmente esta hipótesis, tanto el modelo CMT con (SARS-
CoV-2) como sin (MOCK) infección persistente fueron expuestos a estrés hipóxico que imitaba la cardiopatía isquémica. La condición hipóxica utilizada en este
estudio fue un ambiente con poco oxígeno (<0,1% de concentración de oxígeno) creado por un sistema de cultivo hipóxico. El tratamiento con estrés hipóxico
durante 18 h y la posterior condición normóxica durante 48 h dieron como resultado un aumento de la frecuencia pulsante y una recuperación funcional
contráctil en el MOCK. Sin embargo, los CMT persistentemente infectados con SARS-CoV-2 no mostraron un aumento en la frecuencia de pulsaciones y
mostraron un mayor deterioro de la función contráctil (Figuras 2A y 2BVídeos T2yT3). IFA reveló que la expresión intracelular de ACE2 en cardiomiocitos estaba
regulada positivamente por la hipoxia y la reperfusión (Figura 2C). En consecuencia, la hipoxia facilitó la colocalización de cTnT y proteína S, lo que indica una
reactivación intracelular del SARS-CoV-2 (Figura 2D). Sin embargo, el título viral no aumentó por la hipoxia, lo que puede implicar que la forma de reactivación
del SARS-CoV-2 no aumentaría la infectividad a otros tejidos, pero sí aumentaría la actividad intracelular del SARS-CoV-2 (Figura S2). IFA para CD31 reveló que la
formación de la red vascular estaba globalmente fragmentada en el modelo de infección persistente con SARS-CoV-2 después de isquemia y reperfusión,
mientras que se mantuvo en MOCK (Figura 2MI). Estos resultados indican que el estrés hipóxico interrumpió la formación de la red vascular posiblemente
debido a la reactivación del SARS-CoV-2 y confirió un deterioro funcional de los CMT infectados.

El estrés hipóxico bajo una infección persistente por SARS-CoV-2 no provoca la regulación positiva de las citoquinas inflamatorias
Para investigar si la regulación positiva de las citocinas inflamatorias desempeña un papel en la disminución de la función cardíaca cuando se aplica estrés
hipóxico adicional al modelo de infección persistente SARS-CoV-2, cuantificamos los niveles de citocinas en el sobrenadante del cultivo antes y después de
someterlos a estrés hipóxico utilizando ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Nos centramos específicamente en la interleucina (IL)-6, el factor de
necrosis tumoral (TNF)-a,IL-1b,e interferón (IFN)-gramocomo citocinas representativas asociadas con tormentas de citocinas en COVID-19.15,dieciséisNuestros
hallazgos revelaron que los niveles de expresión de IL-6, TNF-ay IL-1bno aumentó bajo estrés hipóxico en el contexto de una infección persistente (figura 3).
Además, la mayoría de las muestras mostraron valores cercanos o inferiores al límite de detección de IFN-gramo,independientemente de la presencia de
infección persistente por SARS-CoV-2, y no mostró ningún aumento bajo estrés hipóxico en tejidos persistentemente infectados (Figura S3). Estos resultados
sugieren que la función cardíaca reducida observada bajo estrés hipóxico en el contexto de una infección persistente, como se muestra enFiguras 2A y 2B, no
depende del nivel de expresión de las citocinas.

DISCUSIÓN
El modelo de tejido cardíaco basado en células iPS humanas establecido en el presente estudio es el primer informe que demuestra experimentalmente la infección
persistente del corazón humano por SARS-CoV-2 que muestra un deterioro funcional causado por la reactivación intracelular oportunista de la infección viral. Demostramos
experimentalmente que los tejidos cardíacos sometidos a infecciones persistentes con SARS-CoV-2 tienen un alto riesgo de disfunción cardíaca con estrés hipóxico adicional (
Figura 2B). En otras palabras, el aumento explosivo en el número de pacientes infectados por el virus debido a la pandemia de COVID-19 puede haber llevado a un enorme
aumento en el número de pacientes con riesgo potencial de sufrir insuficiencia cardíaca en el futuro. Se predice que estos pacientes mantendrán la función cardíaca
superficialmente a pesar de tener un riesgo marginal. En la práctica clínica, estos pacientes de alto riesgo deben identificarse mediante la detección del virus mismo o del
genoma viral en el tejido de una biopsia endocárdica o mediante el control de los niveles de troponina en sangre. Según nuestro estudio, la disfunción cardíaca asociada con
la infección persistente fue el resultado del aumento de la expresión de ACE2 en los cardiomiocitos en respuesta al estrés adicional (Figura 2D), reactivación del SARS-CoV-2
en cardiomiocitos (Figura 2C), y la alteración de la estructura similar a una red vascular (Figura 2MI). Por lo tanto, además de la eliminación viral del corazón, se están
considerando estrategias que puedan inhibir estos procesos como posibles enfoques terapéuticos.

En COVID-19, un factor común que contribuye a resultados graves es la aparición de una "tormenta de citocinas", caracterizada por un aumento anormal de citocinas
inflamatorias como IL-6, TNF-a,IL-1b,y IFN-gramo.15,dieciséisSin embargo, el modelo de infección persistente por SARS-CoV-2 establecido en este estudio, que carece de células
relacionadas con el sistema inmunitario, no pudo replicar completamente el impacto de las tormentas de citocinas típicamente mediadas por células inmunitarias.

4 iCiencia --, 108641, --, 2023

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Normoxia simulada
Hipoxia simulada
IL-6 TNF-α IL-1β Normoxia del SARS-CoV-2
Hipoxia por SARS-CoV-2
p = 0,5151
p = 0,0616
p = 0,1545
p > 0,9999 p = 0,0131
p = 0,2130 p > 0,9999
p<0,0001 p = 0,0555
p > 0,9999 p > 0,9999 p = 0,0256 p = 0,0743
p = 0,4712 p > 0,9999 p > 0,9999 p = 0,3837
15 p > 0,9999 p > 0,9999 p = 0,0046 p > 0,9999
0,5 8

0,4
6
10
/ml)

/ml)
(pg/ml) 0.3

(ppgg/ml
pg/ml
(ngg/ml

4
0,2
5
2
0.1

0 0.0 0
Pretratamiento Después de 48h de reperfusión Pretratamiento Después de 48h de reperfusión Pretratamiento Después de 48h de reperfusión

Figura 3. Medición de los niveles de citoquinas en el sobrenadante del cultivo antes y después del tratamiento de hipoxia-reperfusión en microtejidos cardíacos mediante ELISA Izquierda:
Medición de IL-6 en sobrenadante.Medio:Medición de TNF-aen sobrenadante.Bien:Medición de IL-1ben sobrenadante. norte = 3–5. Las líneas discontinuas grises representan los límites de
detección (IL-6: 0,7 pg/mL, TNF-a:0,049 pg/ml, IL-1b:1 pg/mL). Los valores por debajo de los límites de detección no se muestran.

Esta limitación enfatiza la necesidad de realizar más investigaciones para validar estos aspectos una vez que en el futuro se desarrolle un modelo de infección
persistente que involucre factores inmunes. Por otro lado, como se muestra enfigura 3, observamos que el estrés hipóxico no condujo a la regulación positiva
de citocinas inflamatorias representativas asociadas con tormentas de citocinas en nuestro modelo infectado persistentemente, a pesar de que el estrés
hipóxico causó un deterioro funcional cardíaco (Figuras 2A y 2B). Estos resultados sugieren que el deterioro funcional no fue impulsado por las citoquinas
involucradas en las respuestas inflamatorias, y pueden indicar la posibilidad de que la infección por SARS-CoV-2 afecte directamente la función cardíaca.
Curiosamente, observamos que el nivel de IL-6 era mayor en los casos de infección persistente por SARS-CoV-2 en comparación con el grupo de control no
infectado antes del inicio del tratamiento hipóxico (figura 3), mientras que otras citoquinas medidas no mostraron una regulación positiva debido a la infección
persistente. En modelos animales, como ratones y hámsteres, la infección por SARS-CoV-2 o la introducción de proteínas virales condujeron a una mayor
expresión de INF-gramo,IL-6, TNF-a,y IL-1b.17,18Además, grandes estudios de cohortes han revelado niveles elevados de IL-1b,IL-6 y TNF en el suero de
pacientes clínicos con un período promedio de 8 meses después de la infección.19Nuestros hallazgos pueden sugerir que el modelo de infección persistente por
SARS-CoV-2 establecido en este estudio replica parcialmente ciertos aspectos de la respuesta inmune.en vivo,aunque no esté completo, posiblemente debido a
la falta de células inmunes inflamatorias. En el futuro, es concebible que se pueda abordar esta insuficiencia en la replicación de la condición patológica
mediante el cocultivo con células inmunes, lo que conduciría a una comprensión más completa de la disfunción cardíaca inducida por el SARS-CoV-2.

Además, este sistema plantea desafíos al considerar la ruta de infección viral en el tejido cardíaco, ya que requiere considerar la interacción compleja entre
múltiples órganos. Actualmente, la investigación sobre organoides avanza rápidamente con el objetivo de recapitular la estructura y función de varios órganos,
incluidos el corazón, los nervios, los pulmones y el hígado.20El desarrollo de un modelo multiórgano, como la plataforma MultiCUBE,21que reproduce los
procesos biológicos que ocurren en el cuerpo humano como un órgano en un chip sería de gran ayuda en la investigación de las interacciones entre diferentes
órganos y potencialmente ayudaría a desentrañar la posible ruta de la infección por SARS-CoV-2 al corazón en el futuro. .
En conclusión, este informe puede servir como advertencia sobre la posibilidad de una pandemia de insuficiencia cardíaca en la era posterior a la COVID-19.
Como contramedida contra este riesgo sanitario global, este modelo serviría como una herramienta útil para investigar el mecanismo de aparición y progresión
de la miocardiopatía por SARS-CoV-2 y desarrollar opciones terapéuticas.

Limitaciones del estudio

Si bien este estudio proporciona información valiosa sobre la infección persistente por SARS-CoV-2 en los tejidos cardíacos, es crucial reconocer limitaciones específicas que
pueden afectar la interpretación de nuestros hallazgos. Los hallazgos se derivan dein vitroModelo creado a partir de células iPS humanas, que ofrece información importante
pero que potencialmente no representa completamente los diversos factores del cuerpo humano. Los fenómenos observados bajo estrés hipóxico pueden estar
influenciados por interacciones intrincadas entre diferentes tejidos y órganos, lo que requiere más investigación. Además, la necesidad de realizar toda la serie de
experimentos en un laboratorio de seguridad de nivel P3 dio como resultado un tamaño de muestra relativamente pequeño, lo que potencialmente limita la generalización
de nuestros resultados. Estas limitaciones subrayan la importancia de futuros esfuerzos de investigación para validar y ampliar aún más nuestros hallazgos.

MÉTODOS ESTRELLA+
Los métodos detallados se proporcionan en la versión en línea de este documento e incluyen lo siguiente:

dTABLA DE RECURSOS CLAVE

dDISPONIBILIDAD DE RECURSOS

iCiencia --, 108641, --, 2023 5

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BContacto principal
BDisponibilidad de materiales

BDisponibilidad de datos y códigos

dMODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DEL PARTICIPANTE DEL ESTUDIO
BLíneas celulares

dDETALLES DEL MÉTODO

BInformes de datos
BMantenimiento de células iPS humanas (iPSC) y diferenciación de líneas celulares cardiovasculares.
BGeneración de microtejidos cardíacos (CMT)
BPreparación de virus
BDesarrollo de un modelo de infección persistente.
BTratamiento del estrés hipóxico
BCitometría de flujo
BAnálisis histológico y tinción inmunohistoquímica.
BAnálisis de inmunofluorescencia (IFA)
BAnálisis MUSCLEMOTION (método basado en video para evaluar la contractilidad del tejido)
BEnsayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
dCUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

INFORMACIÓN SUPLEMENTARIA
Puede encontrar información complementaria en línea enhttps://doi.org/10.1016/j.isci.2023.108641.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Esta investigación fue apoyada por el Proyecto Organoide RIKEN BDR (para HM). Declaración de IA generativa y tecnologías asistidas por IA en el proceso de
escritura Durante la preparación de este trabajo, los autores utilizaron ChatGPT para mejorar el lenguaje y la legibilidad, con precaución. Después de utilizar
esta herramienta/servicio, los autores revisaron y editaron el contenido según sea necesario y asumen total responsabilidad por el contenido de la publicación.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR
KM y HM contribuyeron sustancialmente a la conceptualización del estudio. KM, AM, KT y HM contribuyeron significativamente al análisis e interpretación de los
datos. KM, AM y HM contribuyeron sustancialmente a la redacción del manuscrito. Todos los autores revisaron y revisaron críticamente el borrador del
manuscrito y aprobaron la versión final para su envío.

DECLARACIÓN DE INTERESES
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Recibido: 5 de abril de 2023 Revisado:

13 de noviembre de 2023 Aceptado: 1
de diciembre de 2023 Publicado: 22 de
diciembre de 2023

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iCiencia
Artículo
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iCiencia --, 108641, --, 2023 7
 Cite este artículo en prensa como: Murata et al., Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca debido a la infección persistente por SARS-CoV-2 utilizando un
modelo cardíaco tridimensional, iScience (2023), https://doi.org/10.1016/j .isci.2023.108641

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Artículo

MÉTODOS ESTRELLA+

TABLA DE RECURSOS CLAVE

REACTIVO o RECURSO FUENTE IDENTIFICADOR

Anticuerpos

anti-CD144, R-PE, Clon: 55-7H1, BD Biociencias N.º de catálogo 560410; RRID:AB_1645502

anti-CD140b, R-PE, clon: 28D4 BD Biociencias N.° de catálogo 558821; RRID:AB_397132

antitroponina T, isoforma cardíaca Ab-1, clon: 13-11 Termo Fisher Scientific N.º de catálogo MS-295-P0; RRID:AB_61807

Anticuerpo monoclonal de ratón contra la glicoproteína Universidad de Osaka N/A

de pico (proteína S) del SARS-CoV-2

Anticuerpo CD31/PECAM-1 humano; CD31 I+D Número de catálogo BBA7; RRID:AB_356960

(IgG1 monoclonal de ratón, clon 9G11)

Anticuerpo policlonal anti-ACE2 Bioss N.° de catálogo bs-1004R; RRID:AB_10856553

Anticuerpo de glicoproteína de pico anti-SARS-CoV-2 Abcam Número de catálogo ab272504; RRID:AB_2847845

Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG Termo Fisher Scientific N.º de catálogo A-11008; RRID:AB_143165
(H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488

Anticuerpo secundario de adsorción cruzada anti-IgG Termo Fisher Scientific Catálogo # A-11003; RRID:AB_2534071
de ratón (H+L) de cabra, Alexa Fluor 546

Anticuerpo secundario de adsorción cruzada anti-IgG Termo Fisher Scientific Número de catálogo A-11001; RRID:AB_2534069

de ratón (H+L) de cabra, Alexa Fluo 488

Cepas bacterianas y virales.

SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Humano/2020/Tokio La Universidad de Tokio N/A

(EPI_ISL_418809)

Productos químicos, péptidos y proteínas recombinantes.

StemFit AK02N mediano AJINOMOTO Catálogo #AK02N

seda iMatrix-511 FUJIFILM Wako N.º de catálogo 387-10131

CultureSure (R) Y-27632 (25 mg) FUJIFILM Wako Catálogo #034-24024

bFGF humano recombinante 100ug FUJIFILM Wako N.º de catálogo 060-04543

VEGF recombinante humano 10ug FUJIFILM Wako N.° de catálogo 223-01311

Factor de crecimiento reducido Matrigel Corning N.° de catálogo 356231

Suero Fetal Bovino (SFB) Corning N.º de catálogo 35-079-CV

RPMI 1640 Termo Fisher Scientific N.º de catálogo 21870092

Seleccione TrypLE Termo Fisher Scientific N.° de catálogo A1285901

Suplemento B27 menos insulina 10ml Termo Fisher Scientific N.º de catálogo A1895601

Medio esencial mínimo alfa Termo Fisher Scientific N.º de catálogo 11900024

DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) Termo Fisher Scientific N.º de catálogo D1306

Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) Termo Fisher Scientific N.º de catálogo 11885084

Suero fetal de ternera (FCS) Termo Fisher Scientific N.° de catálogo A5256701

Activina recombinante humana/ratón/rata (50metrogramo) I+D N.º de catálogo 338-AC-050

BMP4, recombinante (10metrogramo) I+D N.º de catálogo 314-BP-010

CHIR99021 10mg TOCRIS N° de catálogo 4423/10

IWP-4 2mg REPROCELAR N.º de catálogo 04-0036-base

XAV939 10mg merck N.º de catálogo 575545-10MGCN

Accutase Nacalai Tesque N.º de catálogo 1267954

saponina Nacalai Tesque N.º de catálogo 30502-42

Solución mixta de penicilina y estreptomicina Nacalai Tesque N.º de catálogo 26253-84

(Continúa en la siguiente página)

8 iCiencia --, 108641, --, 2023

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Continuado

REACTIVO o RECURSO FUENTE IDENTIFICADOR

Ensayos comerciales críticos

Sistema BIO-NIX SUGIYAMA-GEN CO. N.º de catálogo nBIONIX-3

Kit de tinción de células muertas Aqua reparable LIVE/DEAD Termo Fisher Scientific N.º de catálogo L34957

Kit de etiquetado Zenon-APC IgG1 de ratón Termo Fisher Scientific N.º de catálogo Z25051

en el lugarKit de detección de apoptosis Takara Bio Inc. N.º de catálogo MK500

Complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) Laboratorios de vectores N.º de catálogo PK-6103

Kit ELISA de IL-6 humana Quantikine I+D N.º de catálogo D6050

TNF-alfa humano Quantikine HS ELISA I+D Catálogo #HSTA00E

Kit ELISA Quantikine IL-1 beta/IL-1F2 humano I+D N.º de catálogo DLB50

Kit ELISA Quantikine de IFN-gamma humano I+D N.º de catálogo DIF50C

Modelos experimentales: líneas celulares.

Líneas de iPSC humanas 201B6 el Centro de Investigación y N/A

Aplicación de Células iPS (CiRA),
Universidad de Kioto, Kioto, Japón

VeroE6/TMPRSS2 Institutos Nacionales de N.º de catálogo JCRB1819

Innovación Biomédica, Salud y

Nutrición, Osaka, Japón

Software y algoritmos

Software CytExpert Beckman Coulter, N/A

Funciones de corte del BZ-X800E Keyence N/A

MOCIÓN MUSCLEAL Fuente abierta N/A

Imagen J Fuente abierta N/A

Prisma 9 Panel gráfico N/A

Otro
Placa UpCell Semilla celular N.º de catálogo CS3003

Balancín digital compacto DLAB N.º de catálogo 3-7044-09

iP-TEC- sistema de transporte de células vivas SANPLATECO CO N.° de catálogo 28460

CytoFLEX S Beckman Coulter, N/A

DISPONIBILIDAD DE RECURSOS
Contacto principal

Más información y solicitudes de recursos y reactivos deben dirigirse al contacto principal, Hidetoshi Masumoto, que será atendido por él (
hidetoshi.masumoto@riken.jp).

Disponibilidad de materiales

Este estudio no generó nuevos reactivos únicos.

Disponibilidad de datos y códigos

- Fecha: Los datos reportados en este documento serán compartidos por elcontacto principala pedido.
- Código: este documento no informa el código original.
- Todas las demás solicitudes: cualquier información adicional requerida para volver a analizar los datos reportados será compartida por elcontacto principala pedido.

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DEL PARTICIPANTE DEL ESTUDIO

Líneas celulares

Las líneas 201B6 de iPSC humanas se establecieron en el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA) de la Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón, a
partir de fibroblastos de piel de una mujer.22Los métodos de cultivo detallados se describen en Detalles del método. La línea celular VeroE6/TMPRSS2
(JCRB1819) se obtuvo del banco de células JCRB del Instituto Nacional de Innovación Biomédica, Salud y Nutrición, Osaka, Japón, y se cultivó en

iCiencia --, 108641, --, 2023 9

 Cite este artículo en prensa como: Murata et al., Riesgo previsto de pandemia de insuficiencia cardíaca debido a la infección persistente por SARS-CoV-2 utilizando un
modelo cardíaco tridimensional, iScience (2023), https://doi.org/10.1016/j .isci.2023.108641

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ACCESO ABIERTO
Artículo

Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Thermo Fisher Scientific) que contiene un 10 % de suero fetal de ternera (FCS) (Thermo Fisher Scientific) y un
1 % de penicilina-estreptomicina (Nacalai tesque, Kioto, Japón) en un 5 % de CO2atmósfera en 37-C.

DETALLES DEL MÉTODO

Informes de datos
No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra debido al número bastante limitado de experimentos con el nivel de bioseguridad P3 utilizando SARS-
CoV-2. Todos los resultados fueron confirmados con >2 experimentos independientes repetitivos.

Mantenimiento de células iPS humanas (iPSC) y diferenciación de líneas celulares cardiovasculares.

El presente estudio utilizó las líneas 201B6 de iPSC humanas establecidas en el Centro de Investigación y Aplicación de Células iPS (CiRA), Universidad de Kyoto,
Kyoto, Japón.22El mantenimiento de las iPSC humanas y la diferenciación de las células cardiovasculares se realizó de acuerdo con nuestros estudios previos.10,
11,23con modificaciones. En resumen, las iPSC se ampliaron y mantuvieron con el medio StemFit AK02N (AJINOMOTO, Tokio, Japón). En la confluencia, las células
se disociaron con TrypLE Select (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), se disolvieron en ácido etilendiaminotetraacético 0,5 mM en PBS (1:1) y se
pasaron como células individuales (5000 – 8000 células/cm2) cada 7 días en AK02N que contiene seda iMatrix-511 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp., Osaka,
Japón) (0,125metrogramos/cm2) (fragmento de laminina sin recubrimiento24) e inhibidor de ROCK (Y-27632, 10metroM, FUJIFILM Wako). Para la diferenciación
de células cardiovasculares, se sembraron iPSC individuales en placas recubiertas con Matrigel (dilución 1:60) a una densidad de 300.000 a 400.000 células/cm2
en AK02N con Y-27632 (10metroMETRO). En la confluencia, las células se cubrieron con Matrigel (Corning, Corning, NY, EE. UU.) (dilución 1:60 en AK02N) un día
antes de la inducción. Reemplazamos el medio AK02N con medio RPMI + B27 (RPMI 1640, Thermo Fisher; L-glutamina 2 mM, Thermo Fisher; 13Suplemento B27
sin insulina, Thermo Fisher) suplementado con 100 ng/mL de Activina A (R&D, Minneapolis, MN, EE. UU.) (diferenciación día 0; d0) y 5metroSe añadió M
CHIR99021 (Tocris Bioscience, Bristol, Reino Unido) durante 24 h, seguido de una suplementación con 10 ng/ml de proteína morfogenética ósea 4 (BMP4; R&D)
y 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF; FUJIFILMWako) (d1 ) durante 4 días sin cambio de medio de cultivo. En el día 5, el medio de
cultivo se reemplazó con medio RPMI1640 suplementado con 50 ng/ml de factor de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) 165 (FUJIFILM Wako),
2,5metroM IWP4 (REPROCELL, Beltsville, MD, EE. UU.) y 5metroM XAV939 (Merck, Kenilworth, Nueva Jersey, EE. UU.). El medio de cultivo se renovó con
RPMI1640 suplementado con 50 ng/ml de VEGF cada dos días. Las células latiendo aparecieron en el d11 al d15. En este protocolo, podríamos inducir
exclusivamente cardiomiocitos (CM) y células endoteliales vasculares (CE). Para controlar los porcentajes de células murales vasculares (MC) suficientes para
formar láminas celulares, utilizamos una parte del cultivo de diferenciación para la diferenciación de MC e indujimos la diferenciación de MC según fuera
necesario; después del d3, el medio de cultivo se reemplazó con medio RPMI + FBS [RPMI1640, 2 mM de L-glutamina, 10 % de suero bovino fetal (FBS)] y se
actualizó cada dos días.

Generación de microtejidos cardíacos (CMT)

Después de la diferenciación (d13), las células se disociaron mediante incubación con Accutase (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) y la población celular se midió
mediante citometría de flujo de la mezcla de células. La mezcla celular se sembró en una placa UpCell Multi-well de 12 pocillos recubierta con FBS (CellSeed,
Tokio, Japón) a 3.600.000 células/pocillo con 2 ml de medio de unión [AM; medio esencial mínimo alfa (aMEM) (Thermo Fisher) suplementado con 10% de FBS y 5
3105M de 2-mercaptoetanol] que contiene 25 ng/ml de VEGF y 10metroM de Y-27632. Después de dos días en cultivo, se añadieron 25 ng/ml de VEGF al medio
de cultivo. Después de dos días más en cultivo, las células se trasladaron a temperatura ambiente. En 15 minutos, las células se desprendieron y flotaron en el
medio como láminas monocapa de tejido cardíaco.10Se permitió que las láminas de tejido cardíaco recolectadas se volvieran a unir a placas recubiertas con
Matrigel y se incubaron con AM que contenía 50 ng/ml de Y-27632 durante 24 h para cultivar en un Compact Digital Rocker (DLAB, Beijing, China) a 60 rpm y 13
grados durante 14 horas. -28 días.11

Preparación de virus
Los CMT se prepararon en RIKEN, Kobe, Japón y se transfirieron a la Universidad de Kyoto, Kyoto, Japón, utilizando el sistema de transporte de células vivas iP-
TEC (SANPLATEC CO., Ldd., Osaka, Japón) en 2 horas. La cepa de SARS-CoV-2 utilizada en este estudio, SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokio
(EPI_ISL_418809), se aisló de un caso leve en la Universidad de Tokio.25El virus se propagó en células VeroE6/TMPRSS2 y se purificó mediante ultracentrifugación
con sacarosa al 20% a 27.000 rpm durante 2 h a 4-C. Los sedimentos se suspendieron en tampón Tris-EDTA (pH 8,0) y se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10
min a 4-C. El título de SARS-CoV-2 se determinó mediante una dosis infecciosa del 50 % en cultivo de tejidos (TCID50) de VeroE6/TMPRSS2. Todos los
experimentos con SARS-CoV-2 se realizaron en un laboratorio de contención de nivel 3 de bioseguridad en la Universidad de Kyoto, Japón, que estaba
registrado para su uso en el Ministerio de Agricultura, Silvicultura y Pesca de Japón.

Desarrollo de un modelo de infección persistente.

Para el establecimiento de una infección persistente por SARS-CoV-2, utilizamos un cultivo de balanceo dinámico como se informó anteriormente.3
Infectamos los CMT con SARS-CoV-2 con títulos MOI-30 (Leve), MOI-100 (Moderado) y MOI-300 (Alto) medidos en células VeroE6/TMPRSS2 y
cultivados en un Compact Digital Rocker (Thermo Fisher). a 60 rpm y 13 grados durante 14-28 días. El medio se actualizó con AM una vez cada 4 días.
El grupo no infectado se describió como MOCK en el que se utilizó AM sin virus para el tratamiento.

10 iCiencia --, 108641, --, 2023

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modelo cardíaco tridimensional, iScience (2023), https://doi.org/10.1016/j .isci.2023.108641

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Artículo ACCESO ABIERTO

Tratamiento del estrés hipóxico

El modelo CMT, que incluía un grupo con infección persistente por SARS-CoV-2 (denominado SARS-CoV-2) y otro grupo sin infección (denominado
MOCK), se sometió a una condición hipóxica con una concentración de oxígeno <0,1%. monitoreo con una O2medidor incluido en el sistema BIO-NIX
(nBIONIX-3, SUGIYAMA-GEN CO., Tokio, Japón) durante 18 horas, lo que se denominará hipoxia. El grupo de control se mantuvo bajo una
concentración normal de oxígeno, descrita como Normoxia. Después del tratamiento hipóxico/normóxico, ambos grupos volvieron a una
concentración de oxígeno normal y se incubaron durante 48 horas en cultivo oscilante.

Citometría de flujo
La citometría de flujo se realizó de acuerdo con nuestro estudio anterior con modificaciones.1Las células cardiovasculares diferenciadas y las láminas de tejido
cardíaco se disociaron mediante incubación con Accutase y se tiñeron con uno o una combinación de los siguientes marcadores de superficie: anti-PDGFRb
conjugado con ficoeritrina (PE), clon 28d4, 1:100 (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) para MC, y anti-VE-cadherina conjugado con ficoeritrina (PE), clon
55-7h1, 1:100 (BD) para las CE. Para eliminar las células muertas, las células se tiñeron con el kit de tinción de células muertas Aqua reparable LIVE/DEAD
(Thermo Fisher). Para los marcadores de superficie celular, la tinción se llevó a cabo en PBS con FBS al 5%. Para las proteínas intracelulares, la tinción se llevó a
cabo en células fijadas con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS. Las células se tiñeron con la isoforma anticardíaca de troponina T (cTnT) (clon 13-11) (Thermo
Fisher) marcadas con APC usando tecnología Zenon (Thermo Fisher) (1:50) para CM. La tinción se realizó en PBS con 5% de FBS y 0,75% de saponina (Nacalai
Tesque). Las células teñidas fueron analizadas por CytoFLEX S (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). Se recopilaron datos de al menos 10.000 eventos. Los datos
se analizaron con el software CytExpert (Beckman Coulter). El porcentaje de CM, EC y MC en láminas de tejido cardíaco utilizadas en el presente estudio fue el
siguiente: CM, 35,53GRAMO10,47 %, CE, 1,86GRAMO0,93 %, CM, 37,43GRAMO7,07 % (n=6).

Análisis histológico y tinción inmunohistoquímica.

Los CMT se fijaron en PFA al 4% y se incluyeron en parafina. Secciones (6-metrom de espesor) se prepararon y se tiñeron con hematoxilina-eosina y etiquetado
dUTP Nick-End mediado por TdT (TUNEL;en el lugarKit de detección de apoptosis) (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japón; según los protocolos del producto). Para la
tinción inmunohistoquímica, las secciones de parafina se tiñeron primero con anticuerpos para cTnT (Thermo Fisher) (1:100) y glicoproteína de pico (proteína S)
del SARS-CoV-2 [anticuerpo monoclonal de ratón proporcionado por el Dr. Hisashi Arase (Universidad de Osaka)] ( 1:50). Se incubaron con un segundo
anticuerpo biotinilado (1:300) y un complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) (ABC-Elite, Vector Labotarories, 1:100). La reacción de coloración se llevó a cabo
con DAB y los núcleos se tiñeron con hematoxilina. Todos los resultados fueron confirmados con >2 experimentos independientes repetitivos.

Análisis de inmunofluorescencia (IFA)

Para IFA, las CMT se tiñeron con anticuerpo cTnT (Thermo Fisher) (1:250), CD31 (IgG1 monoclonal de ratón, clon 9G11) (R&D) (1:250), ACE2 (anticuerpo
policlonal) (Bioss, Woburn, MA, EE. UU. ) (1:250), proteína S (ab272504), Abcam (1:250) o anticuerpo monoclonal de ratón proporcionado por el Dr. Hisashi Arase
(Universidad de Osaka) (1:50), con DAPI (4',6-diamidino-2 -fenilindol) (Thermo Fisher) (1:1000). Como anticuerpos secundarios se utilizaron anti-ratón Alexa 546
(Thermo Fisher), anti-conejo Alexa 488 (Thermo Fisher) y anti-ratón Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher). Los tejidos se fotografiaron con un sistema microscópico de
fluorescencia todo en uno, BZ-X800E (Keyence, Osaka, Japón), que combina funciones de sección y pila en Z. Todos los resultados fueron confirmados con >2
experimentos independientes repetitivos.

Análisis MUSCLEMOTION (método basado en video para evaluar la contractilidad del tejido)
MUSCLEMOTION es un software versátil de código abierto con un sistema basado en video que se utiliza para evaluar la función contráctil.12Utilizamos el software según las
instrucciones del proveedor. En resumen, utilizamos el software ImageJ e instalamos MUSCLEMOTION como complemento. La amplitud del movimiento se utilizó para el
análisis. El índice pulsátil por minuto (PIPM) representa el cambio en la fuerza pulsátil por minuto; calculado utilizando latidos por minuto (BPM) y cambio de píxeles.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Antes del ELISA, el medio de cultivo descongelado se centrifugó a 3000 rpm durante 5 min a 4-C para eliminar los restos celulares. Los niveles de IL-6, TNF-a,IL-1
by IFN-gramoen el sobrenadante del medio de cultivo se evaluaron utilizando el kit ELISA Quantikine IL-6 humano, el kit ELISA Quantikine HS TNF-alfa humano,
el kit ELISA Quantikine IL-1 beta/IL-1F2 humano y el kit ELISA Quantikine IFN-gamma humano (I+D) siguiendo el Instrucciones del fabricante. La absorbancia a
450 nm se midió utilizando el espectrofotómetro de absorbancia de microplacas iMark (Bio-Rad, Filadelfia, PA, EE. UU.).

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todo el análisis estadístico se realizó utilizando Prism 9 (GraphPad, Boston, MA, EE. UU.) mediante ANOVA unidireccional o prueba de Kruskal-Wallis con valores de P de dos
colas, asumiendo datos paramétricos para las muestras.R6 y datos no paramétricos para muestras <6. Las comparaciones múltiples se realizaron utilizando el método
Bonferroni. No se utilizaron pruebas ciegas para procesar las muestras.

iCiencia --, 108641, --, 2023 11