Cultivo in vitro

Definición. Es un conjunto de técnicas mediante las cuales un

explante se cultiva asépticamente en un medio de composición
química definida, y se incuba en condiciones ambientales controladas.

Objetivos.

- Propagación de plantas.
- Obtención de plantas libres de patógenos.
- Conservación e intercambio de germoplasma.
- Aumento de la variabilidad genética.
- Producción de compuestos útiles.
- Estudios de bioquímica y fisiología vegetal.
EXPLANTE

1. Objetivo del estudio

Estudios
básicos

Semillas geminadas Callo

Ovarios de tomate Estudios de desarrollo de fruto
Óvulos de algodón Estudios de calidad de fibra
 Obtención de plantas
con sanidad controlada

Yemas (el domo y un par

de primordios foliares)
Segmentos uninodales de Micropropagación de Eucalyptus sp
ramas jóvenes, ápices
Ovarios u óvulos fecundados Obtención de híbridos
interespecíficos

Nirembergia ericoides Nirembergia linariafolia

Ej: se busca vigor híbrido y nuevos

caracteres en estas especies nativas de
Argentina, con potencial uso en
floricultura,
Semillas de Cattleya mendelii Obtención de plantas de semillas
(Orquideaceae) (c: testa, e: con embriones rudimentarios
embrión, la barra indica
1 mm)
 Obtención de haploides, para que se
manifiesten caracteres recesivos (Ej:
Anteras, óvulos
trigo, maíz, papa, arroz, etc.). Se obtienen
individuos homocigotas.
Cultivos de
raíces

Taxus: taxol
Catharanthus: vimblastina
Panax: ginsenósidos
Digitalis: glicósidos cardíacos
Valeriana: valeriatos
Fusión de protoplastos obtenidos, Obtención de híbridos
obtenidos de mesófilos de hojas somáticos
Meristemas Criopreservación
Otros factores a tener en cuenta al elegir el explante:

- Edad fisiológica: tejidos jóvenes

En especies
forestales (Ej:
Eucalyptus
grandis)

Rejuvenecimiento
mediante el apeo de los
pies seleccionados
 Otros factores a tener en cuenta al elegir el explante:

- Tamaño del material:

Los explantes muy pequeños

suelen requerir medios de
cultivo más complejos.
A mayor tamaño, mayor
probabilidad de inducir
formación de callos u
organogénesis directa. También
mayor riesgo de contaminación.
ASEPSIA

a) Fuentes de contaminación:

Explante y material de disección Medio de cultivo y recipientes

 DESINFECCIÓN DEL EXPLANTE

Doble desinfección: etanol 70% v/v (20-60 segundos), hipoclorito

de sodio 1-3% durante 3 a 30 segundos, seguido por lavados con
agua destilada estéril.
HgCl2 0,2 % (5 minutos) vs NaClO 2% (5 minutos)

(Comino). Según Beltrán y López, 2014.

Desventajas del HgCl2: tóxico y difícil de remover del explante

Desinfección de yemas de vid (Según Lazo-Javalera, 2016)
Uso de detergentes (Tween 20, Triton 100) y fungicida (Benomilo)
ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y RECIPIENTES DE VIDRIO

Medios de cultivo

Autoclave a 1,46 kg cm-2 durante 20 min

Recipientes de vidrio

Estufa a 180-200oC durante 2-4 h

Sustancias termolábiles: filtración mediante filtros bacteriológicos
Cultivar los explantes en cámara de flujo laminar
MEDIOS DE CULTIVO: formulación de sales inorgánicas, compuestos
orgánicos, requeridos para la nutrición y manipulación de los cultivos

- Fuente de carbono: principalmente sacarosa (relación costo/beneficio)

- Nutrientes minerales: macro y micronutrientes

- Vitaminas: tiamina (vitamina B1)

- Reguladores de crecimiento: principalmente auxinas (ANA, AIA, IBA), y citocininas (BAP, KIN,
ZEA). Giberelinas , especialmente GA3, en pocos casos (meristemas, para elongación de
brotes)

- Agente gelificante: agar (0,6 a 1%)

- Otras sustancias: carbón activado (0,1 a 5%)

Oxidación fenólica en
cultivo de tejidos
plátano.
Composición de tres medios básicos usados en cultivo in vitro (Murashige & Skoog, N6 y B5)
 CONDICIONES AMBIENTALES DE INCUBACIÓN

Temperatura: 25-28oC, fotoperíodo: 16/8 h, irradiancia: 500-200 mmol m-2s-1

Morfogénesis

Callo

Organogénesis
indirecta

Organogénesis
directa

Embriogénesis
Cultivo de tejidos de guatambú, según Duarte et al., 2015)
 FACTORES QUE DETEMINAN LA RESPUESTA MORFOGENÉTICA

- Genotipo
- Reguladores de crecimiento
- Antibióticos:
Ej. en Malus domestica

Cefotaxime (250 mg L-1) ORGANOGÉNESIS

Cefotaxime (500 mg L-1) CALLOGÉNESIS

Kanamicina (varias dosis) INHIBE ORGANOGÉNESIS

- Carbón activado EMBRIOGÉNESIS

 ACLIMATACIÓN

Túneles de polietileno Invernáculos

(plantas con buen control
estomático)
FACTORES QUE DETEMINAN LA RESPUESTA MORFOGENÉTICA (cont.)

- Agar.

Chubut- Organogénesis
agar

Agar
Callogénesis
Sigma

Actinidia chinensis
Variación somaclonal
 Variación somaclonal vs cambios epigenéticos

Variación somaclonal:

Son los cambios ocurridos en las plantas regeneradas in vitro, y que son
transmitidos a la progenie.

Cambios epigenéticos:

Son cambios reversibles en la expresión de algunos genes.

Los cambios producidos son generalmente indeseables. Sin embargo la

aparición ocasional de variaciones no encontradas en las poblaciones
naturales, y que representa una ventaja desde el punto de vista forestal, puede
ser utilizada en mejoramiento genético.
 Cantidad de
variación
inducida

Desde el punto de vista Mantenimiento

práctico no es una de caracteres
técnica eficiente, ya que de
no se puede dirigir ni importancia
predecir el tipo de forestal
variación.
Cultivares obtenidos mediante variación somaclonal

Cynodon dactylon resistente a la oruga militar

Cultivares tolerantes estrés salino

Arroz

Trigo

Alfalfa
P. nigra var. betulifolia X - P. nigra volga resistente a Septoria musiva (cancrosis)
Explanto

El cultivo de meristemas
minimiza el riesgo de
variación somaclonal.

El cultivo de
protoplastos induce
inestabilidad genética
(tiempo de cultivo).
Vía de regeneración

La organogénesis directa
produce mayor variación.

La embriogénesis
somática produce menor
variación somaclonal
(mayor presión de
selección).

Las plantas regeneradas

a partir de callos suelen
tener mayor variación
somaclonal.
Medio de cultivo

Tensión de oxígeno (el

etanol sería mutágeno).

Auxinas: metilación de
citosina; la 5-metilcitosina
resulta en un cambio de C
por T.

Deficiencia o exceso de
macronutrientes (ej: lino).

Más allá del medio de

cultivo, considerar la edad
del cultivo, y número de
subcultivos.