Universidad Dr. José Matías Delgado.

Facultad de Agricultura e Investigación Agrícola

“Julia Hill de O’ Sullivan”

Biorreactores y aclimatación

Integrantes:
Jorge Alberto Rodríguez Benítez
Eduardo Antonio Aguillón Torres

Catedrático: Ing. Gilmar Calderón

Fecha: Lunes 4 de Marzo, 2019

Introducción.
La tecnología relacionada con el cultivo ha evolucionado notablemente desde su
descubrimiento, identificación taxonómica y los trabajos realizados, el
establecimiento de una plantación vigorosa y uniforme, en muchas ocasiones para
las plantas que son de gran importancia en la industria es demasiado difícil
multiplicarlas por medio de la reproducción sexual debido a la pequeñez de la
semilla, o por la alta mortalidad de las plántulas en la germinación y a la limitada
capacidad de sobrevivencia en ambientes de extrema humedad.
En muchas ocasiones por tratarse de plantas de polinización cruzada (alógamas),
las plantaciones naturales presentan una alta variabilidad fenotípica (apariencia) y
genotípica. Para poder tener un alto rendimiento en ciertos cultivos solo es posible
si existe abundante material vegetal, por lo que dicha variabilidad afecta. Esta alta
variabilidad se reduce mediante técnicas alternativas de reproducción vegetativa
como la propagación in vitro, seleccionando y multiplicando plantas
morfológicamente idóneas y con niveles elevados de substancias deseadas que
garanticen la rentabilidad del cultivo.
Sin embargo, el enraizamiento in vitro presenta, al igual que la aclimatación de las
vitroplantas, uno de los principales problemas de la micro-propagación.

Importancia del estudio

 En cultivos que son de alto interés económico en el país que utiliza estas
tecnologías, la micro-propagación se presenta como una alternativa de
diversificación debido a las condiciones favorables que ofrece para la
producción y exportación del cultivo.
 Los cultivos in vitro y la aclimatación de vitroplantas, se utilizan con el fin de
obtener una producción comercial de mayor alcance de plantas para proveer
a los consumidores interesados.
 Las aplicaciones correctas de un protocolo adecuado según el cultivo que
permita el enraizamiento in vitro de la planta servirá para su micro-
propagación.
 El desarrollo de un método adecuado para la aclimatación de cualquier
cultivo ayudará a la producción comercial influyendo positivamente en la
economía.
Objetivos de investigación.
Objetivo general.
Investigar sobre los biorreactores y la posterior aclimatación de cultivos.

Objetivos específicos.
1. Conocer sobre la función y los diferentes tipos de biorreactores que se utilizan
en el cultivo de tejido vegetal.
2. Analizar los materiales necesarios y posibles métodos de construcción para un
biorreactor con las necesidades de un cultivo específico.
3. Definir cuál es la importancia de los procesos de aclimatación en cultivos in vitro.
4. Averiguar cuáles son los métodos de aclimatación según las necesidades de
un cultivo específico.
Revisión de literatura.
Biorreactores.
Un biorreactor se define como un recipiente que mantiene un ambiente
biológicamente activo. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que
se lleva a cabo un proceso químico que involucra organismos o sustancias
bioquímicamente activas derivadas de dichos organismos. Este proceso puede ser
aeróbico o anaerobio. Estos biorreactores son comúnmente cilíndricos, variando en
tamaño desde algunos mililitros hasta metros cúbicos y son usualmente fabricados
en acero inoxidable. Su aplicación a la industria se puede observar en la producción
de enzimas, proteínas, anticuerpos y otra infinidad de recursos que podemos
obtener de organismos como bacterias, hongos, levaduras, algas o simples células
en suspensión, además pueden ser utilizados para la depuración de aguas
residuales.

Fig. 1: producción de biodiesel a

base de algas en biorreactores.
Extraída de:
www.science.howstuffworks.com

Sin embargo cuando se menciona de la aplicación de los biorreactores con el

propósito de propagar plantas se hace referencia a un equipo diseñado para el
cultivo de diferentes tejidos vegetales como segmentos de hojas, tallos, brotes y
hasta callos (grupos de células sin diferenciación celular), de los que previamente
se han establecido las condiciones y medios de cultivo para la formación de
plántulas. Consta de un recipiente, que puede ser de vidrio o de plástico claro
(policarbonato transparente que pueda ser esterilizado), que proporciona un
ambiente controlado de luz y temperatura, y que de forma automática provee el
medio de cultivo en tiempo y cantidad óptimas.
Dependiendo del tipo y forma del contenedor y del sistema de agitación, se han
diseñado biorreactores por agitación rotatoria, por burbujeo, de difusión o perfusión,
y de sistema de inmersión temporal (SIT). Este el ultimo es el más utilizado ya que
se caracteriza por sumergir parcialmente los tejidos vegetales durante periodos
iterativos por un sistema automatizado.

Sistemas de inmersión temporal (SIT)

Los biorreactores de sistema de inmersión temporal se distinguen por utilizar un
método que consiste en humedecer de manera intermitente y por un corto periodo
de tiempo el tejido de una planta con medio de cultivo, seguido por el secado por
gravedad o automatizado. Estos sistemas de propagación de plantas utilizan
mecanismo de adición y remoción del medio de cultivo líquido, lo que evita
problemas de asfixia e hiperhidricidad, daños mecánicos, con lo que se logra un
aumento en la eficiencia de la micropropagación, dado por el incremento en los
ritmos de producción y la calidad de plantas propagadas.
El tiempo y frecuencia de inmersión tiene una gran importancia, tanto para la
asimilación de los nutrientes por los tejidos vegetales, como en la renovación de la
atmosfera interna del recipiente de cultivo. Son determinantes para el éxito de la
propagación: el tamaño del biorreactor, el volumen del medio de cultivo y la
densidad de los tejidos cultivados.

Fig. 2: Biorreactores utilizados en la propagación

de papas (Solanum tuberosum). Extraída de:
www.biotecnología-agricola.com
En general los biorreactores de sistema de inmersión temporal se clasifican en
diferentes modelos según su principio de operación:

Fig. 3: Clasificación de los biorreactores de

inmersión temporal. Extraída de:
www.sabermas.com

Recipiente de Inmersión Temporal Automatizado (RITA): Los primeros biorreactores

de inmersión temporal fueron los tipos RITA, comercializados en Francia, utilizados
tanto en laboratorios de investigación como en los grandes laboratorios de
propagación comercial de numerosas especies de plantas. El sistema RITA consta
de envases de un litro que comprenden dos compartimentos, uno superior con las
plantas y uno inferior con el medio. La sobrepresión aplicada en el compartimento
más bajo empuja el medio hacia el superior. Las plantas están sumergidas tanto
tiempo como la presión es aplicada. Durante el período de inmersión el aire es
insuflado a través del medio, agitando los tejidos suavemente y renovando la
atmósfera dentro del frasco, con la sobrepresión escapando a través de salidas en
la parte superior del aparato. Este sistema fue desarrollado para propagación
masiva vía embriogénesis somática.
 Fig. 4: Funcionamiento de un biorreactor tipo
RITA. Extraída de: www.monografias.com

Sistema de inmersión temporal por gravedad (BIG): consta de 2 frascos ubicados a

diferentes alturas, en el de mayor altura se pondrán los explantes y en el de menor
altura el medio de cultivo, Ambos frascos están conectados por mangueras de
silicona. Luego según el tiempo deseado, la válvula y el aire proveniente del
compresor se abren para impulsar el medio del cultivo hacia la parte superior que
contiene los explante. Durante este periodo de inmersión el flujo de aire genera
burbujas del medio que a su vez remueva los explantes. Pasado el tiempo de
inmersión, el líquido regresa por gravedad al reservorio de medio de cultivo. La
frecuencia y el tiempo de inmersión se regulan mediante el empleo de un
temporizador o controlador lógico programable (PCL).

Fig. 5: diseño de un sistema de inmersión por

gravedad (BIG) Extraída de: www.researchgate.net
Sistema de inmersión temporal de columna por burbujeo o por aire hibrido (air lift):
Se da por el desprendiendo de brotes en crecimiento, como consecuencia directa
de la turbulencia ejercida sobre los tejidos (brotes), por efecto de la formación de
Edies (movimiento de agua o aire en una forma de espiral), en la superficie de
contacto entre la columna de burbujeo de aire y la base del brote en crecimiento.
Funciona de un difusor de aire que a través de un movimiento ascendente y
descendente en solo un frasco donde está el explante y el medio, en constante
movimiento lo que le permite no estar siempre cubierto por el medio.

Fig. 7: esquema de un biorreactor de air lift.

Extraída de: www.dialnet.com

Sistema de inmersión temporal de vasos gemelos (BIT): En este sistema se utiliza

un frasco que mantiene las plantas y otro como reservorio de medio de cultivo. Los
vasos se conectan entre sí mediante una manguera de silicona que se inserta en la
tapa de cada recipiente que desciende hasta el fondo, de modo de permitir el
intercambio de medio de cultivo. La conexión se realiza a través de filtros hidrófobos
de 0,2 micras que garantiza la esterilidad del aire de entrada. La presión del aire es
controlada por un manómetro y el ritmo de inmersión está regulada por un
temporizador, el cual controla válvulas solenoides que al abrirse indistintamente
permiten la circulación del aire y por consiguiente del medio de cultivo de un
recipiente a otro.
 Fig. 8: Funcionamiento de un biorreactor tipo
BIT. Extraída de: www.monografias.com

Ventajas de utilizar biorreactores en comparación con la

micropropagación tradicional.
 El contacto directo con el medio de cultivo renovado durante cada inmersión
garantiza una forma más eficiente de suministro de los nutrientes en
comparación con la forma estática en la que se toman los mismos en el cultivo
convencional (semisólido o líquido).
 Los tiempos de inmersión son cortos, la mayoría del tiempo los explantes están
solamente recubiertos de una película de medio de cultivo líquido y de esta forma
se evita la desecación de los mismos.
 La resistencia a la difusión de gases es baja y existe una mínima ruptura del
intercambio gaseoso entre los tejidos y la atmosfera, por tal razón está dentro
del vaso de cultivo se renueva en intervalos regulares de tiempo.
 La agitación por flujo de aire durante la fase de inmersión causa expansión de
los tejidos y se facilita un mayor contacto de estos con el medio de cultivo.
 Mayor optimización biológica por los altos coeficientes de multiplicación que se
obtienen.
 Fig. 10: Comparación de un sistema de inmersión temporal y el cultivo en
medio semisólido. Donde se observa más brotes, mayor altura y un mayor
coeficiente de multiplicación de Anthurium andraeanum. Extraida de:
www.revista.ibp.com.edu

 Reducción importante de los costos por vitroplantas.

 Reducción del número de frascos y estantes en las cámaras de cultivo y por
tanto mayor producción en metro cuadrado de cámara.
 Eliminación de la fase de enraizamiento in vitro.
 Mejor comportamiento de las vitroplantas ex vitro por mayor metabolismo
autotrófico durante la fase in vitro.
 Se evita la hiperhidricidad ya que se incluye un constante y mejor intercambio
de gases con la atmosfera, el cual es un desorden fisiológico que puede ocurrir
en el cultivo de tejido de las plantas. Esta puede ocurrir con un alcance más bajo
o más alto. Cuando ocurre con un bajo alcance los problemas principales de sus
efectos no exceden por encima, de los encontrados en la etapa de
establecimiento. Cuando se manifiesta con una alto alcance, serios problemas
pueden ser visto en diferentes etapas del cultivo in vitro. Los tejidos hiperhídricos
se caracterizan por una apariencia vidriosa, tallos y hojas traslucidas y una
distorsión de sus órganos. El desarrollo y supervivencia de tejidos hiperhídricos
es muy bajo.

Fig. 9: Tejidos que sufren de

hiperhidricidad. Extraída de:
www.ecured.net
Según un estudio realizado en Chile por R. Cruzat (2004) en la micropropagacion
de fresas (Fragaria sp.) Se comparó los precios y la participación relativa de los
ítems (mano laboral, materiales, insumo, etc.) de un sistema de micropropagación
in vitro convencional y por medio de un biorreactor SIT donde se obtuvieron los
siguientes resultados:

Fig. 10: Comparación de precios y participación relativa en

producción in vitro y en SIT de fresas (Fragaria sp). Extraída de:
www.opical.cl

Se observa que el precio de personal, el precio total de laboratorio, la preparación

de medios y supervisión bajan drásticamente en comparación a la producción en
SIT, sin embargo una de las desventajas en términos monetarios que poseen los
biorreactores es su alto precio inicial de inversión que necesitan para su instalación,
aunque está perdida de dinero se recupera cuando se produce en grandes
cantidades cultivos. Los precios de construcción de un biorreactor de SIT de calidad
de producción masiva son los siguientes:

Fig.11: Costos ($) de la instalación, equipos y materiales requeridos para la

implementación de la técnica de sistemas de inmersión temporal en biorreactores
(20 unidades SIT compuestas por 40 botellas/frascos). Extraída de: www.opical.net
Se pueden optar por biorreactores más accesibles con diferentes materiales más
baratos y artesanales como el diseñado por Reinhardt Acuna (2008), que consta de
un biorreactor por air liftin cuyo costo de materiales y total fue el siguiente:

Fig. 12: costos de materiales para elaborar un

biorreactor por air lift. Extraida de: www.dialnet.com

La micropropagación en biorreactores de SIT se ha establecido en diversas

especies como plátano, cítricos, café, piña, árbol de caucho, vainilla, estevia, yuca,
papaya, boniato, especies medicinales, forestales y un gran número de plantas de
valor ornamental. Algunos sistemas se utilizan también para promover la
germinación de diversas plantas, con gran éxito en la propagación exponencial de
microtubérculos de papa y ñame.

Ensayo de multiplicación en un biorreactor de SIT en piña (Ananas

cromosus).
En la Universidad Nacional de Trujillo, Richard Solórzano (2016) diseño un
biorreactor de inmersión temporal de diseño de frascos gemelos de un bajo costo
con 24 tanques de 2 L cada uno. Donde determino que el material más apto fue el
de plástico que presenta una duración similar al aluminio sin oxidarse, las formas
estructurales fueron cuadradas ya que presentan más resistencia, el color se
seleccionó como blanco ya que refracta la luz, permitiendo mayor eficiencia lumínica
y regulación de temperatura. Estos envases fueron puestos en un estante de tres
niveles de 160 cm de altura y 90 cm de ancho, donde cada nivel tenía 45 cm de
ancho y 40 cm de alto.
 Fig. 13: Estante con los frascos que
se utilizaron. Extraída de:
www.unitru.edu.com

El tipo de iluminación fue una luz tipo fluorescente que corresponde a una luz blanca
fría y fue un tubo horizontal de 65 cm de longitud, la cantidad de luz fueron entre
1000 y 4000 lux y el tiempo de iluminación fue de 16 horas luz y 8 horas de
oscuridad, se hizo con un timer digital que permitió el cambio según el criterio del
especialista.
El sistema de aireación se realizó con un compresor de aire que entregaba una
caudal de 10 L por minuto y transfería 3000 mL de medio en 20 segundos, la presión
de aire fue de 2.0 atm regulado por un manómetro, el compresor fue de aire libre de
aceite con una capacidad de presión máxima de 0.8 MPa, que comprimió el aire y
lo entregó a presión a los biorreactores. Este sistema transfiere desde 500 mL de
cultivo en 10 segundos hasta 6 litros de medio de cultivo cuando se emplearon los
12 frascos gemelos en 20 segundos un caudal de 116 L por minuto. Este aire
comprimido se distribuyó a los biorreactores a través de una red de tuberías de
media pulgada cuyo flujo está regulado por llaves de paso al inicio y final de cada
nivel, cuyos terminales en cada nivel son en total de ocho y su diámetro de 10 mm.
 Fig. 14: Compresor de aire a 0.8 MPA. Extraída
de: www.unitru.edu.com

El aire comprimido se distribuye en una red de tuberías de media pulgada cuyo flujo
es regulado por llaves de paso al inicio y final de cada nivel, cuyos terminales en
cada nivel son en total ocho y su diámetro 10mm.
Para la filtración del aire Se optó por los filtros de venteo de membrana de PTFE
(politetrafluoroetileno) sobre soporte de polipropileno, autoclavable, ideal para la
filtración de gases. La propiedad principal de este material es que es prácticamente
inerte, no reacciona con otras sustancias químicas excepto en situaciones muy
especiales. Esto se debe básicamente a la protección de los átomos de flúor sobre
la cadena carbonada. Los filtros fueron conectados entre los biorreactores y la salida
del sistema de aireación en manguera de silicona de autoclave de 10 mm de ancho

Fig. 15 filtro de venteo de 0.22 micras de

poro. Extraída de: www.unitru.edu.com
La siguiente variable a tomar en cuenta fue la del tiempo de inmersión que
decidieron por un minuto por cada inmersión, siendo en total una inmersión cada 8
horas o 3 veces al día.
Todos los parámetros antes mencionados fueron controlados mediante un circuito
temporizador fabricado para accionar el compresor y cuatro electroválvulas,
dispuestas dos en las entradas y dos en las salidas de las tuberías del sistema de
aireación.

Fig. 16: Todo el sistema ya

instalado y automatizado. Extraída
de: www.unitru.edu.com

La variedad que se cultivo fue la roja trujillana donde se sembraron los hijuelos
(yemas con protocormo). Los hijuelos introducidos fueron proporcionados por el
laboratorio de biotecnología vegetal de la Escuela Académico Profesional de
Agronomía de la Universidad Nacional de Trujillo en un total de 90 hijuelos o
unidades propagativas provenientes de un subcultivo en frascos en medio líquido
los cuales fueron incubados en tres biorreactores (30 hijuelos por biorreactor) para
la prueba de eficiencia. Para ello se empleó como medio de cultivo el propuesto por
Murashige y Skoog:
Se agregaron vitaminas como acido nicotínico, tiamina hidrocloruro y piridoxina
hidrocloruro, Dicho medio básico se suplementó con las vitaminas MS, que
estuvieron preparadas en disoluciones concentradas stock y adicionalmente con
sacarosa como fuente carbonada y con los reguladores de crecimiento ácido
naftalen acético (ANA) y bencil amino purina (BAP) a una concentración en ambos
casos de 2 mg·L^-1.
Para la introducción de los explantes en los Biorreactores se empleó una cabina de
flujo laminar, se seccionó el material parental por hijuelos, se introdujeron 15 hijuelos
por biorreactor previamente autoclavado y conectó al sistema de aireación para su
incubación por inmersión temporal.
En la prueba de eficiencia lograron más que triplicar la cantidad de unidades
propagativas ya que empezaron 30 pasados los 15 días este número subió a 60 y
pasados los 30 días establecidos el número de unidades propagativas llego a 125,
indicando una taza de multiplicación de 6.5.
Esto es contrastado con una producción in vitro convencional que solamente logra
producir 2 o 3 unidades productivas por planta sembrada y tienen una tasa promedio
de 2.6.

Fig. 17: unidades propagativas obtenidas

en un biorreactor en 30 días. Extraída de:
www.unitru.edu.com
Trasplante, aclimatación y/o enraizamiento in vivo.
El trasplante de las vitroplantas del medio aséptico de cultivo al ambiente natural en
el invernadero y luego a su sitio final involucra que deban pasar por un período de
aclimatación para que puedan sobrevivir. Durante este período las plantitas se ven
obligadas a formar raíces y brotes funcionales para volverse autótrofas El éxito de
esta etapa radica en el cuidado que se tenga controlando la susceptibilidad de las
vitroplantas a la deshidratación ya que a pesar de que se tengan condiciones
controladas de temperatura, luminosidad y humedad, se puede obtener pérdidas
muy cuantiosas.
La duración de esta etapa depende principalmente de la rusticidad de las especies,
pero en general es de 45 a 60 días aproximadamente, A continuación, se describen
ciertas modificaciones anatómicas y fisiológicas gracias a las cuales la vitroplanta
tiene un gran potencial de supervivencia ex vitro:
 La cutícula: Es una capa de cera que cubre la epidermis de las hojas
protegiéndolas de la pérdida excesiva de agua. La cutícula no se encuentra
bien desarrollada en las plantas que han sido producidas en tubos de ensayo
debido a la alta humedad relativa in vitro (90-100%), provocando una pérdida
rápida de agua en las vitroplantas cuando son trasplantadas al invernadero
 Las estomas: Son pequeñas aberturas localizadas en las hojas, encargadas
del balance hídrico en las plantas, así como del intercambio de gases
necesario para el proceso fotosintético y la respiración. Las mayores pérdidas
de agua en las vitroplantas se deben al relativo mal funcionamiento de las
estomas que permanecen abiertos hasta que las plantas puedan ajustarse a
un ambiente de baja humedad y mayor intensidad lumínica.
 Fotosíntesis: Las plantas han sido criadas bajo un ambiente heterotrófico,
por lo cual, la energía y carbohidratos necesarios son obtenidos inicialmente
a través de la sacarosa presente en el medio de cultivo.
 Las raíces: La masa radical delicada generada in vitro se ve afectada in vivo
debido al cambio brusco de condiciones a la que se ve expuesta al momento
del trasplante ex vitro, debiendo ser reemplazadas rápidamente por otras
raíces subterráneas. Es aconsejable estimular la producción de pelos
radicales in vitro lo que puede ser logrado algunas veces exponiendo las
raíces en un medio líquido, mediante el uso de hormonas de crecimiento y la
alternancia de períodos de luz y oscuridad.
 Intensidad lumínica: La formación de raíces adventicias depende mucho de
la época del año a ciertas latitudes.

Uso de cámaras plásticas, riego por nebulización y micro túneles para la

aclimatación
Se trasplantaron al invernadero 1080 vitroplantas de Stevia que estaban en
laboratorio y que tuvieran sus raíces bien formadas con el fin de encontrar el método
óptimo de aclimatación, en el segundo experimento de este estudio se evaluó este
total de vitroplantas en seis substratos, con tres sistemas de manejo de humedad y
dos tipos de contenedores para un total de 36 tratamientos.
Los sistemas evaluados durante la etapa de aclimatación fueron: Cámaras
plásticas, Sistema de nebulización y Micro túneles.
Los substratos evaluados fueron seis:
1. Arena (A), compost (Co) y suelo (Sue) en una proporción de 2:1:1
2. Arena (A), bocashi (Bo) y suelo (Sue) en una proporción de 1:1:1
3. 100% Promix (P) con 0% Arena (A)
4. 75% Promix (P) con 25% Arena (A)
5. 50% Promix (P) con 50% Arena (A)
6. 25% Promix (P) con 75% Arena (A)
Los tipos de contenedores evaluados fueron:
- Bandejas multiceldas (50 celdas) de poliestireno Pro TraysTM de 2 ¼
pulgadas de profundidad
- Bolsas plásticas de 5×4 pulgadas En total para el segundo experimento se
evaluaron 36 tratamientos.
Evaluación de sistemas de manejo de humedad:
Aplicación de Micro-túnel y su esterilización.
sobre dos camas, cada una de 7.0 m de largo por 1.4 m de ancho conteniendo un
substrato de 75% arena y 25% casulla de arroz. Estas camas estaban ubicadas bajo
un sarán que retiene el 40% de la luz que entra .

Cámaras plásticas
Las cámaras plásticas, son armazones construidos con tiras de madera que forman
un rectángulo de 2.0 m. de largo por 1.2 m. de ancho y 0.5 m. de altura. Estas
cámaras están cubiertas de plástico transparente en todas sus caras. Las cámaras
plásticas fueron ubicadas bajo un sombreadora cubierto con un sarán que retiene
el 60% de la luz solar. Las tres cámaras plásticas que se utilizaron en este
experimento fueron previamente lavadas y desinfectadas con cloro al 20% y
finalmente con alcohol al 70%. Posteriormente fueron colocadas sobre plataformas
de metal a 30 cm. de altura del suelo.
Sistema de riego por nebulización
Para este sistema, las vitroplantas fueron expuestas a un régimen de riego de 20
segundos cada cinco minutos desde las ocho de la mañana hasta las cuatro de la
tarde. Este es el método que actualmente utiliza el Laboratorio de Cultivo de Tejidos
para la aclimatación de la mayoría de especies que se producen.

Preparación y pasteurización de substratos

De cada tipo de substrato se preparó cuatro pies cúbicos a excepción del Pro-mix®
Bx (Premier Brands Inc. Canadá) que fue importado y se compone de: turba de
musgo esfagníneo Canadiense (Canadian Sphagnum Peat Moss), perlita,
vermiculita cal dolomítica, piedra caliza y agente humectante.
Todos los substratos fueron pasteurizados durante 45 minutos a una temperatura
de 200°C. De cada substrato pasteurizado se tomaron muestras representativas a
las cuales se les realizó una prueba de pH y se analizó la cantidad de Nitrógeno,
Fósforo y Potasio. Los substratos fueron distribuidos en las bandejas multi-celdas
(50 celdas) y en bolsas. Los tratamientos debidamente identificados se fueron
ubicando en cada uno de los sistemas de aclimatación bajo los invernaderos y el
sarán.
Procedimiento utilizado para la transferencia de vitroplantas
Las plantitas fueron extraídas de cada frasco con la ayuda de pinzas. Luego se
lavaron muy bien con agua de la llave para remover los residuos del medio de
cultivo. Seguidamente se sumergieron en una solución funguicida-bactericida
(Benomil 1 gr/l y Agrimicin 0.6 g/l) por 20 minutos y se sembraron en los distintos
contenedores con los diferentes substratos que fueron previamente humedecidos.
De cada tratamiento se sembró una réplica por día durante tres días.
Fase de aclimatación para la piña.
Para iniciar la fase de aclimatación se utilizaron muestras de 10 vitroplantas por
repetición, es decir 60 vitroplantas por tratamiento, haciendo un total de 180
vitroplantas por los tres tratamientos provenientes del ciclo de enraizamiento; estas
fueron extraídas de sus respectivos frascos y sometidas a un lavado para retirar el
exceso de medio de cultivo en las raíces.

Posteriormente las vitroplantas fueron trasplantadas en bandejas plásticas negras

de 200 celdas y se distribuyeron e identificaron en sus respectivos tratamientos.

El sustrato utilizado para el llenado de las bandejas fue una mezcla para
germinación con la siguiente composición turba de esfagno (grande), perlita
hortícola, lana de roca, cal dolomítica y calcítica, carga fertilizante inicial y agente
humectante, luego fueron trasladadas al macrotunel y colocadas en un microtunel
utilizado como propagador, en donde días antes de su utilización este fue preparado
y cubierto con plástico especial que ayudo a mantener la humedad relativa alta y
este fue destapado a los ocho días después de haberse colocado las bandejas al
interior del propagador. La duración de esta fase fue de 30 días a partir del
trasplante, el manejo que se les dio a las vitroplantas fue únicamente la aplicación
de riego tres veces por semana, una vez al día.

La evaluación semanal de la sobrevivencia de las vitroplantas. Al finalizar la toma

de datos de esta fase las vitroplantas fueron trasplantadas en bolsas negras de
polietileno 4¨x6¨ con una mezcla de sustrato de tierra negra, piedra pómez, granza
de arroz quemada y aplicación de Carbofuran (C12H15NO3) como insecticida y
nematicida.

Porcentaje de sobrevivencia (%).

Los resultados de esta variable, se obtuvieron de una muestra de sesenta
vitroplantas, por tratamiento, y fue realizada en base a la observación y
cuantificación semanal de las vitroplantas, determinándose de esta forma la
sobrevivencia de las muestras. Para este caso no fue necesario aplicar una prueba
estadística, debido a que las muestras seleccionadas para dicho estudio en fase de
aclimatación, presentaron el 100% de sobrevivencia, para todos los tratamientos en
un periodo de 30 días (Figura 10). Cabe mencionar que los excelentes resultados
obtenidos en la sobrevivencia de las vitroplantas de piña, de la variedad Golden,
pudo deberse al tipo de sustrato utilizado, ya que fue una mezcla para germinación.
Conclusiones.
1. Los biorreactores presentan una mejor solución a problemas que se encuentran
presentes en el cultivo in vitro convencional, ya que se producen plantas en
mayor cantidad, con una mejor capacidad de adaptarse y de menor precio.
2. Los aspectos más importantes cuando se implementa un sistema de
biorreactores es el diseño a utilizar, el aire filtrado, el tipo de medio, la frecuencia
de inmersión y la respuesta que el cultivo pueda tener.
3. El proceso de aclimatación es fundamental para los procesos posteriores a los
biorreactores ya que de este depende la supervivencia de las especies
reproducidas.
4. El tipo de sustrato, el tratado que se le dé al invernadero, el riego y el tratado a
posibles plagas que se puedan presentar en un invernadero donde se mantenga
el proceso de aclimatación son vitales para que se minimicen las perdidas.
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