MICROPROPAGACION DE ORYZA SATIVA –TRANSGENESIS  Se sumerge en la solución con la bacteria.

(Agrobacterium
tumefaciens transformada)
INDIRECTA  Tiempo de inmersión 10-15 min
FASE 0 SELECCIONAR CÉLULAS TRANSFORMADAS
SELECCION DE LA PLANTA MADRE  Se realiza pruebas de laboratorio,
 Prueba de tinción
 Proveniente de invernadero XGLUG, Metanol 80/20
37 C y 48 h de oscuridad
(Es difícil su forma de propagarse Resultado con puntos azules.
en campo) Prueba de cuantificación, mediante estereoscopio
 Sana, y no presente signos de  ELISA
Para identificar anticuerpos, por el gen de resistencia a
enfermedad visible kanamicina
 Plantas con crecimiento vigoroso Conjugado de las partículas las cuales son orocoloideal
 Si la proteína transgénica se encuentra presente, reacciona
con el anticuerpo detectado para formar una banda
FASE 1 colorida.
 PCR
SELECCIÓN DEL EXPLANTE/PROTOCOLO DE DESINFECCIÓN Se identifica el gen GUS, con una coloración azul
Serie de ciclos repetitivos térmicos
 Yemas apicales (5 explantes) La célula tiende a tornarse de color azul.
 Tween 20 + A. cítrico 10%
 Lavar con agua estéril REGENERAR CÉLULAS DEL EXPLANTE
 Fungicida (2 gotas)
 Curar el explante de la bacteria
FASE EXTRA CO-CULTIVO  Incubación a 42 C
 Después este puede ser cultivado.
CONSTRUCCION ADN RECOMBINANTE
FASE 2
 Transgénesis indirecta
 Plásmido TI INDUCCION AL MEDIO DE CULTIVO
 Agrobacterium tumefaciens
 Ácido ascórbico 100mg/L Antioxidante)
 AIA 13 mg/L + Sacarosa 40%
ADN-T  BAP 100 mg/L + MS + Medio BKA
 Gen reportero GUS  2,4 D 100 mg/L
 Gen de selección resistencia a kanamicina (Levitus, 2010)
 Vectores (heridas, enjuagar una sustancia antioxidante)
 Periodo de luz largo
INFECCIÓN DE CÉLULAS  Entra: yemas apicales con resistencia a kanamicina
 Sale: caules transgenicos
 Medio M.S liquido
 Se provoca heridas a los explantes, con el bisturí
  Pre-cultivar los ápices para el desecado con agentes
Osmóticos.
FASE EXTRA: CAULOGÉNESIS
 Tratamiento con soluciones crio protectoras
 Explantes: caules transgénicos DMSO 10 %
 BAP y ANA suplementado con 40 mg/L de PVP, el pH fue GLICEROL 5 %
ajustado en 5,8 y se adicionó 2,5 g/L de Phytagel®.  Deshidratar por exposición a una solución de vitrificación
 Los ensayos de caulogénesis se mantuvieron durante 45 con una disminución de temperatura de 25 – 0 C.
días  Inmersión en nitrógeno liquido
 Fotoperíodo de 16/8 horas  Descongelamiento rápido
 Intensidad lumínica a 3.000 Lux y a una  Promover la solución de vitrificación
 Temperatura de 25°C  Poner los ápices en condiciones apropiadas para su
 Entra: caule transgénicos recuperación.
 Sale: caule desarrollado OGM  Duración 18 -24 MESES

FASE 3
 
MULTIPLICACIÓN DE CAULES TRANGENICOS
(Levitus, 2010)
 MS + Agar 150 mg/L sacarosa 100 mg + ABA
 Organogénesis directa: brotacion
 Lo normal de los Subcultivos es de 3-5, un límite
máximo seria 6 debido a que excediendo el límite de los
Subcultivos puede perder la identidad genética
 18 días de crecimiento

CONSERVACION

Crio conservación

 Método de vitrificación
 Aplicamos congelamiento rápido a la planta
 Nitrógeno líquido a -100 C por min.
 Preparar y seleccionar los ápices