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PROPAGACION DE GUAYABA AGRIA Psidium araca L.

A PARTIR DE YEMAS
TERMINALES Y AXILARES EN CONDICIONES IN VITRO

EDUARDO EMIRO CORREA CONTRERAS


JAIVER ENRIQUE PINTO ROCHA

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ


ESCUELA DE INGENIERIA AGRONÓMICA
PROGRAMA INGENIERIA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2014
PROPAGACION DE GUAYABA AGRIA Psidium araca L. A PARTIR DE YEMAS
TERMINALES Y AXILARES EN CONDICIONES IN VITRO

EDUARDO EMIRO CORREA CONTRERAS


JAIVER ENRIQUE PINTO ROCHA

Trabajo presentado como requisito parcial para obtener una nota en la


asignatura de Cultivo de Tejidos u Órganos Vegetales In Vitro

Docente

Ing. DARIO GARAVITO GARAVITO

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ


ESCUELA DE INGENIERIA AGRONÓMICA
PROGRAMA INGENIERIA AGRONÓMICA
BARRANCABERMEJA
2014
TABLA DE CONTENIDO
PAG
1. INTRODUCCION 4
2. RESUMEN 5
3. ANTECEDENTES 6
3.1 Efecto de tres antioxidantes en el cultivo in vitro de ápices de 6
guayaba (psidium guajava l.).
3.1.1 Uso de diferentes agentes antioxidantes para controlar la 6
fenolización
3.2 Jiquilpan, Michoacán. Marzo 2010, ORGANOGÉNESIS in vitro DE 6
ARÁNDANO Vaccinium corymbosum L."
3.2.1 Comparación del medio WPM y WPM modificado 6
3.3 Propagación in vitro de Psidium guajava L. mediante 7
organogénesis directa a partir de segmentos nodales.
3.4 Problemas de oxidación y oscurecimiento de explantes cultivados 8
in vitro.
3.4.1 Problemática y su desarrollo in vitro 8
3.4.2 Uso de adsorbentes Carbón activado (CA) 8
4. OBJETIVOS 9
4.1 Objetivo general 9
4.2 Objetivo específicos 9
5. MATERIALES Y METODOS 10
5.1 MATERIAL VEGETAL 10
5.2 MATERIALES DE LABORATORIO 10
5.2.1 EQUIPOS 10
5.2.1 REACTIVOS 10
5.2.3 VIDRIERIA 10
5.2.4 FUNGIBLES 10
5.2.5 OTROS 11
5.3 ESTABLECIMIENTO IN VITRO 11
5.3.1 Aseo profundo en el laboratorio 11
5.3.2 Preparación de las soluciones madre 12
5.3.3 Métodos de desinfección del material vegetal 13
5.3.4 Esterilización de vidriería y Preparación del medio de cultivo 14

6. RESULTADOS 17
7. DISCUSION DE RESULTADOS 24
8. CONCLUSIONES 25
9. RECOMENDACIONES 26
10. BIBLIOGRAFIA 27

1. INTRODUCCION

La guayaba agria (Psidium araca L.) Es un fruto que tiene su procedencia en


Centroamérica pero se cultiva en los países tropicales como Colombia, Brasil y
Ecuador. En Colombia se ha extendido su cultivo en la región del eje cafetero y en
la región de la costa del norte específicamente de Córdoba, en municipios como
Cerete, Canalete, San Carlos y otros. La guayaba agria es un producto que se
clasifica según su color y tiene características importantes y aceptables para la
nutrición. La dimensión de este fruto es de aproximadamente de 9 cm de largo por
7 cm de diámetro y pesa en promedio 150 g. Su mayor utilidad está en la
producción  de jaleas.

El cultivo in vitro, incluye muchas técnicas destinadas a introducir, multiplicar y


regenerar, entre otros recursos, material vegetal o animal en condiciones
controladas y asépticas. El cultivo in vitro constituye un paso fundamental en la
obtención y regeneración de plantas genéticamente modificadas o transgénicas,
mediante técnicas de ingeniería genética, es decir, que existe una estrecha
relación entre el cultivo de tejidos vegetales y la biotecnología moderna. Cultivo de
tejidos vegetales es una descripción genérica que involucra diferentes técnicas de
cultivo de material vegetal diverso, células, tejidos, órganos y plantas completas.
Mediante éstas y otras técnicas de cultivo, es posible obtener plantas libres de
microbios en un medio nutritivo aséptico (estéril) en condiciones ambientales
controladas.
Con este trabajo se busca la propagación de material vegetal en condiciones in
vitro de guayaba agria (Psidium araca L.) a partir de yemas terminales y axilares,
como alternativa para solventar los problemas de germinación en cultivos in vivo
para conservar y aumentar la población de plantas en el Centro de Investigación
Santa Lucia.

2. RESUMEN
Este trabajo se basa en la búsqueda de la propagación de guayaba agria Psidium
araca L. a partir de yemas terminales y axilares en condiciones in vitro, así como
encontrar el método de desinfección óptimo para evitar la contaminación de las
yemas. Los niveles más bajos de contaminación se obtienen con el método de
desinfección, donde las yemas se someten a un proceso de imbibición durante
diez minutos, y posteriormente son sumergidas en una solución de hipoclorito de
sodio al 1%. Por otro lado, se demostró que adicionar 30 mg de carbón activado al
medio de cultivo, reduce los problemas de fenolización característico de esta
especie, por lo cual se recomienda como el mejor tratamiento para reducir los
fenoles y polifenoles liberados por el explante. Esto comparado con el otro
tratamiento donde se adiciono 10 ml de ácido ascórbico al medio de cultivo.

3. ANTECEDENTES
3.1 EFECTO DE TRES ANTIOXIDANTES EN EL CULTIVO In Vitro DE ÁPICES
DE GUAYABA (Psidium guajava L.). RELACIÓN ENTRE EL ORIGEN DEL
EXPLANTE Y EL CONTENIDO DE COMPUESTOS FENÓLICOS. O.
Concepción, Lelurlys Nápoles, Aurora T. Pérez, Martha Hernández, Ninel
Peralta y R. Trujillo. Cultivos Tropicales, vol. 26, núm. 1, 2005, pp. 33-39,
Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas, Cuba.

3.1.1 Uso de diferentes agentes antioxidantes para controlar la fenolización

Colecta del material vegetal. Se utilizaron brotes de aproximadamente 5-6 cm de


longitud con tres pares de hojas visibles, provenientes de la copa de árboles de
guayaba seleccionados en el campo, los cuales una vez separados de la planta
donadora se colocaron en diferentes frascos que contenían 500 mL de una
disolución estéril de antioxidantes. Se utilizó: 1) L-cisteína a 25 mg·L-1,2) PVPP a
500 mg·L-1 y 3) una mezcla de ácido ascórbico (150 mg·L-1) + ácido cítrico (200
mg·L-1), teniendo en cuenta que son los antioxidantes y las concentraciones más
empleadas en este cultivo (20).

Desinfección e implantación in vitro. En el laboratorio los brotes se lavaron con


abundante agua corriente y detergente. Luego en el flujo laminar se realizó la
desinfección superficial con bicloruro de mercurio al 0.05 % durante 20 minutos,
después de los cuales se enjuagaron con abundante agua destilada estéril. Al
finalizar cada uno se colocó nuevamente en sus respectivas soluciones estériles
antioxidantes y luego se aisló la yema apical para su implantación.

La inoculación de las yemas apicales se realizó en tubos de ensayo que contenían


10 mL de medio de cultivo de establecimiento constituido por las sales MS (7)
suplementado con BAP (4.44 μmol·L-1), AIA (8.56 μmol·L-1) y el respectivo
antioxidante añadido a igual concentración que en la disolución de colecta,
excepto para el PVPP, el cual se utilizó a 250 mg·L-1. Los cultivos se incubaron en
la cámara de luz artificial a temperatura de 26±1°C e intensidad de luz de 35.7
μmol·m-2·s-1 con fotoperíodo de 16 horas luz. Se implantaron un total de 30
yemas por tratamiento.

3.2 Jiquilpan, Michoacán. Marzo 2010, ORGANOGÉNESIS in vitro DE


ARÁNDANO Vaccinium corymbosum L."

3.2.1 Comparación del medio WPM y WPM modificado

Se cultivaron yemas axilares en medio de cultivo WPM y WPM modificado con 2


mg L-1 2iP, 0.4 mgL-1 de tiamina, 100 mg de mioinositol, 10 g L-1 de azúcar y 6 g
L-1 de agar. Se realizaron cinco repeticiones por tratamiento, la unidad
experimental consistió en un frasco con cuatro explantes. A los 28 días se
evaluaron las variables: número de explantes que produjeron callo, el lugar en el
que se produjo el callo (hojas o extremos) y el número de masas con callo.
La modificación del medio WPM consiste en una reducción de la cantidad total de
sales minerales del medio original, componentes que pueden ser tóxicos para los
tejidos de Vaccinium corymbosum, sobre todo por la poca tolerancia que
presentan las plantas a los suelos salinos durante su cultivo en campo (Li et al
2004). Villegas y Parada (2009) señalan que con el WPM modificado 43.4 % de
los explantes cultivados del híbrido almendro x durazno H1 producen en promedio
más brotes (20.4), de mayor longitud (13.7 mm) y sin problemas de
hiperhidratación, que los cultivados en medio WPM normal.

3.3 Propagación in vitro de Psidium guajaba mediante organogénesis directa


a partir de segmentos nodales. Fabiola Ocampo y Víctor Manuel Núñez.
Revista Corpoica – Ciencia y Tecnología Agropecuaria (2007). P 22-27.
Se ha demostrado la posibilidad de propagar in vitro la guayaba en varios estudios
utilizando ápices (Papadadatou y Pontikis, 1990), segmentos nodales (Amin y
Jaiswal, 1988; Mohamed-Yasseen et al., 1995), hojas jóvenes (Kosky,
comunicación personal), hipocotilos (Loh y Rao, 1989; Singh et al., 2002) y
embriogénesis somática (Vilchez et al., sin publicar; Manoj, Akhtar y Jaiswal,
2007). Kaundal y Deol (1990), compararon el desarrollo de grupos de yemas con
un anillo modificado de yemas durante dos años, con éxito muy bajo. Prasad,
Rabbani y Ram (1988) lograron un 80% de prendimiento aplicando calor y auxinas
a la base de los cortes. Mohamed-Yessen et al. (1995), cultivaron nudos de
plántulas de semillas germinadas en medio MS suplementado con
bencilaminopurina (BAP) y lograron producir brotes con enraizamiento. Singh et al.
(2002) informaron sobre la obtención de plantas a partir de hipocótilos con una
frecuencia muy baja. Recientemente, Vilchez et al. (sin publicar) y Manoj, Akhtar y
Jaiswal, (2007) señalan que obtuvieron exitosamente plantas completas mediante
embriogénesis somática.
En la actualidad, el establecimiento y estandarización de protocolos in vitro con
tejidos de alta respuesta de regeneración en especies leñosas se considera
fundamental para procesos de micropropagación masiva y para facilitar la
tecnología de transformación genética. En varias especies frutales y forestales se
han hecho estudios para obtener plantas in vitro por medio de organogénesis
indirecta (Pérez-Tornero et al., 2000) y por embriogénesis somática (Toribio et al.,
2004). Investigaciones efectuadas por Loh y Rao (1989), Amin y Jaiswal (1988),
Ramírez y Salazar (1997), Pérez-Tornero et al. (2000) indican que la propagación
in vitro de guayaba por brotes adventicios es posible. Sin embargo, aún no existen
estudios que demuestren los efectos de la micropropagación en plantaciones
comerciales.
3.4 PROBLEMAS DE OXIDACIÓN Y OSCURECIMIENTO DE EXPLANTES
CULTIVADOS in vitro. Álvaro Azofeifa. Agronomía mesoamericana 20(1):
153-175. 2009
3.4.1 Problemática y su desarrollo in vitro
El establecimiento in vitro de tejidos vegetales de algunas especies de plantas,
especialmente leñosas, está, en gran medida, limitado por la ocurrencia de
oscurecimientos letales en los explantes y en el medio de cultivo. Esto constituye
uno de los problemas más serio y frecuente, desde el inicio y durante el mante-
nimiento de un tejido cultivado in vitro (George1996, Laukkanen et al. 2000,
Murkutey Shanti-Patil 2003, Tang y Newton 2004). El desarrollo de este problema
está estrechamente relacionado al estrés oxidativo y nitrosativo que sufren las
células del explante cultivado. Este fenómeno se produce por el desbalance entre
las reacciones pro-oxidación (excesivaformación deROSy, o RNSo de naturaleza
enzimática) y los mecanismos antioxidantes para detoxificar (antioxidantes
enzimáticos y no enzimáticos), generalmente causado por una generación
incrementada de radicales libres (Novoaet al. 2001, Turrens 2003).
3.4.2 Uso de adsorbentes Carbón activado (CA)
Mediante la adición de CA al medio de cultivo es posible remover compuestos
fenólicos. Evitando o disminuyendo el deterioro del explante.
El efecto benéfico del CA se atribuye a su capacidad para remover sustancias
inhibitorias o tóxicas del medio de cultivo que son producidas durante el
autoclavado del medio o liberadas por el explante. Dentro de las sustancias
producidas durante el autoclavado, se ha reportado la presencia del 5-
(hidroximetil)-2-furaldehído (HMF). Este es un compuesto inhibitorio, formado
primeramente a partir de la fructuosa, ya sea agregada al medio de cultivo, o
formada por hidrólisis de la sacarosa durante el proceso de autoclavado. Otras
sustancias removidas son producidas por el mismo explante. Por ejemplo las
quinonas (Ebert et al. 1993, Petersen et al. 1999, Bhatiay Ashwath 2008).

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Propagar bajo condiciones in vitro guayaba agria (Psidium araca) a partir de
yemas terminales y axilares en el laboratorio de la escuela de ingeniería
agronómica del Centro de Investigación Santa Lucía del Instituto Universitario de
la Paz.

4.2 Objetivo específicos


 Brindar condiciones asépticas en el área de laboratorio para el desarrollo y
crecimiento de la siembra.
 Aplicación de hormonas reguladoras de crecimiento (BAP) que induzca la
formación de brotes laterales.
 Producir plantas libres de patógenos.
 Determinar el mejor antioxidante para reducir la fenolización.

5. MATERIALES Y METODOS
5.1 MATERIAL VEGETAL

Se colectaron yemas de dos árboles de guayaba agria Psidium araca L., ubicados
en la universidad para establecer los cultivos in vitro.

5.2 MATERIALES DE LABORATORIO

5.2.1 EQUIPOS
 Autoclave
 Cámara de flujo laminar
 Destilador y desionizador de agua
 Balanza de precisión
 Nevera
 Estufa de cocina

5.2.2 REACTIVOS
 Soluciones Madre de M&S
 Sacarosa
 Agar
 Carbón activado
 Ácido indolácetico
 Ácido ascórbico

5.2.3 VIDRIERIA
 Frascos de compota
 Frascos de cuello largo
 Erlenmeyers de 1.000, 500, 300 y 100 ml
 Beakers de 1.000, 500, 300 y 100 ml
 Agitadores
 Probetas de 100,200 y500 ml
 Pipetas de 0.1, 1, 2, 5 y 10 ml.

5.2.4 FUNGIBLES
 Alcohol al 70%
 Agua destilada
 Detergente
 Alcohol industrial
 Hipoclorito de sodio
 Etanol
 Fungicida
 Aluminio
 Guantes
 Pinzas
5.2.4 OTROS
 Papelería
 Toallas
 Marcadores de tinta indeleble
 Estantería

5.3 ESTABLECIMIENTO IN VITRO

Con el objetivo de propagar plantas de guayaba Psidium araca L. a partir de la


siembra de yemas terminales y axilares, se eligió el método de asepsia más
eficiente comúnmente utilizado. Las semillas se cultivaron en el medio de cultivo
MS (Murashige y Skoog, 1962) (Tabla 1.) posteriormente se ubicaron en la
estantería con temperatura controlada y sometida a oscuridad.

5.3.1 Aseo profundo en el laboratorio

La limpieza profunda empezó con:

1. La eliminación de todos los materiales innecesarios en el laboratorio.


2. Limpieza con la ayuda de trapos húmedos en una solución de blanqueador
y jabón en polvo, empezando en las partes más altas de laboratorio hacia
abajo.
3. Limpieza del estante donde se encuentra ubicados los frascos con
explantes.
4. Limpieza de mesones.
5. Clasificación de la vidriería.
6. Trapeado para evitar la dispersión de partículas de polvo en el laboratorio.
7. Barrido.

Figura1. Aseo profundo en el laboratorio.

5.3.2 Preparación de las soluciones madre.


Para la preparación de la solución madre fueron necesario los reactivos presentes
en la tabla 1

Tabla 1. Constituyentes del medio de cultivo MS (Murashige y Stoog, 1962).

REACTIVOS REQUERIMIENTOS CONVERSIÓN ALICUOTA


DEL MEDIO X L 1L A 200 ML A TOMAR
DE LA
S.M. PARA
200 ML
#1 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
1000 ml
#2 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
1000 ml
#3 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
1000 ml
#4 5 ml 5 ml x 200 ml 1 ml
x:
1000 ml
#5 5 ml 5 ml x 200 ml 1 ml
x:
1000 ml
#6 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
1000 ml
#7 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
1000 ml
# 8 Vitaminas 10 ml 10 ml x 200 ml 2 ml
x:
conjugadas 1000 ml

Pasos a tener en cuenta para la preparación de las soluciones madres:

1. Calibración y tara de la balanza de precisión.


2. Organización de los reactivos según su preparación.
3. Pesaje de los reactivos y aforo de las soluciones a 200ml, en una concentración
para diez litros.
4. Almacenamiento de las siete soluciones madre, en botellas ámbar (protección
a la fotolabilidad y la termolabilidad), previamente identificadas y bajo
refrigeración.
Figura 2. Soluciones madres envasados en frascos de ámbar

5.3.3 Métodos de desinfección del material vegetal

Preparación de tres tratamientos de desinfección de yemas de guayaba acida.

TRATAMIENTO 1

1. Solución de Alcohol al 70%, las yemas fueron sumergidas durante 1 minuto


2. Solución de hipoclorito de sodio al 5.25 % las yemas fueron introducidas
durante 30 minutos.
3. Se hacen tres lavadas con agua destilada esterilizada, y posteriormente la
siembra.

TRATAMIENTO 2

1. Aplicación de fungida al material vegetal, se realizó un solución de 2g de


Benlate en 200ml de agua, las yemas fueron introducidas durante 10
minutos.
2. Solución de Alcohol al 70%, las yemas fueron sumergidas durante 1 minuto
3. Solución de hipoclorito de sodio al 5.25 % las yemas fueron introducidas
durante 20 minutos.
4. Se hacen tres lavadas con agua destilada esterilizada, y posteriormente la
siembra.

TRATAMIENTO 3

1. Solución de hipoclorito de sodio al 5.25 % las yemas fueron introducidas


durante 10 minutos.
2. Se hacen tres lavadas con agua destilada esterilizada, y posteriormente la
siembra.
NOTA: Debido al estrés sufrido por las yemas de guayaba acida con los
tratamientos anteriores, se decide utilizar solo hipoclorito de sodio al 5.25 % y
reducir el tiempo de contacto.
5.3.4 Esterilización de vidriería y Preparación del medio de cultivo

Esterilización de material inerte

1. Se preparó una solución de agua con un poco de jabón en polvo para lavar
los frascos.
2. Se enjuagaron en agua.
3. Se introdujeron en agua destilada hirviendo por unos segundos.
4. Se dejaron almacenados boca abajo en el mesón.
5. Antes de adicionar el medio los frascos son pasados por una solución de
hipoclorito de sodio al 1%.

Figura 3. Limpieza de frascos de compota con agua jabón y luego pasadas por
agua hirviendo.

Preparación de medios de cultivo

Tratamiento 1

Preparación de 200 ml Murashige y skoogl


1. En un beaker de 500 ml adicionar 100 ml de agua destilada.
2. Se adicionan las respectivas cantidades de soluciones madre en orden de
numeración.
3. Se afora el beaker con agua destilada esterilizada hasta completar 200 ml.
4. Se le agrega 6gr de azúcar y se mezcla.
5. El beaker se pone en la estufa hasta que llegue al punto de ebullición.
6. Finalmente se le agrega el agar y se revuelve.
7. Los frascos previamente esterilizados en una solución de 2000 ml al 1% de
hipoclorito de sodio, son llenados con el recipiente del medio de cultivo.
Figura 4. Preparación del medio del medio de cultivo Tratamiento 1.

Tratamiento 2

Preparación de 200 ml Murashige y skoogl:


1. En un beaker de 500 ml adicionar 100 ml de agua destilada.
2. Se adicionan las respectivas cantidades de soluciones madre en orden de
numeración.
3. Se afora el beaker con agua destilada esterilizada hasta completar 200 ml.
4. Se le agrega 6gr de azúcar y se mezcla.
5. Se agrega 30 mg de carbón activado con recogedor de la oxidación.
6. El beaker se pone en la estufa hasta que llegue al punto de ebullición.
7. Finalmente se le agrega el agar y se revuelve.
8. Los frascos previamente esterilizados en una solución de 2000 ml al 1% de
hipoclorito de sodio, son llenados con el recipiente del medio de cultivo.

Figura 5. Preparación del medio de cultivo Tratamiento 2.


Tratamiento 3

Preparación de 200 ml Murashige y skoogl:


1. En un beaker de 500 ml adicionar 100 ml de agua destilada.
2. Se adicionan las respectivas cantidades de soluciones madre en orden de
numeración.
3. Se afora el beaker con agua destilada esterilizada hasta completar 200 ml.
4. Se le agrega 6gr de azúcar y se mezcla.
5. Se agrega 30 mg de carbón activado con recogedor de la oxidación.
6. Se adicionan 2gr de Benlate (fungicida) para controlar la contaminación del
medio.
7. El beaker se pone en la estufa hasta que llegue al punto de ebullición.
8. Finalmente se le agrega el agar y se revuelve.
9. Los frascos previamente esterilizados en una solución de 2000 ml al 1% de
hipoclorito de sodio, son llenados con el recipiente del medio de cultivo.

6. RESULTADOS

SIEMBRA 2 DE SEPTIEMBRE 2014


TRATAMIENTO 1 TRATAMIENTO 2
FECHA
Solución de Alcohol al 6.96% durante 1 Explantes sometidos a 20 minutos en 10 ml
minuto, posteriormente 30 minutos de de NaClO al 5.25%.
hipoclorito de sodio al 3%.

REPLICAS(2 yemas / frasco) REPLICAS (2 yemas / frasco)


R1 R2 R R1 R2 Rñp3
3
04/09 Presencia de micelio blanco alrededor del Presencia de micelio blanco alrededor del
explante. explante y un cuerpo ceroso brillante.
08/09 Se observó una coloración café oscura ubicada Se observó una coloración café oscura ubicada
alrededor de la yema. alrededor de la yema, con menor intensidad que
en el tratamiento 1.
9/09 *El oscurecimiento alrededor de las semillas es debido a la oxidación
*Necrosamiento del tejido vegetal en los 2 tratamientos.

Tratamiento (T1-R1,R2,R3; T2-R1,R2,R3)

R1 R2
16/09 El explante se encuentra totalmente Presenta el micelio del hongo pero en menor
contaminado por el micelio del hongo y presenta desarrollo que la R1.
necrosis, ese material es descartado del
laboratorio.

16 de septiembre 2014
16/09 Tratamiento 1 carbón activado Tratamiento 2 ácido ascórbico.
Se sembraron yemas de guayaba acida en Se sembraron yemas de guayaba acida en un
un medio enriquecido con 30 mg de medio enriquecido con 10 ml de ácido
carbón activado.(R1, R2) ascórbico.(R1, R2)
22/09
El explante se encuentra totalmente El explante presenta el micelio del hongo y
contaminado por el micelio del hongo, pero oxidación en les R1 y R2.
ha disminuido su proceso de oxidación en Este material es descartado de laboratorio.
todas las réplicas (R1, R2).
Este material es descartado del laboratorio.

*
Se elige el tratamiento 1 con carbón
activado por los efectos que este brinda
para la reducción de la oxidación en las
yemas.

SIEMBRA 23 DE SEPTIEMBRE 2014


Carbón activado con benlate 0,2 g espolvoreado al medio.(R1, R2, R3, R4)
FECHA Los explantes cuentan con tres pares de hojas

Se aplicaron 0.2 g de benlate al medio con el fin de reducir la contaminación presentada por el
explante.
Se elaboraron 2 réplicas a las cuales se le aplico benlate 0,2 g espolvoreado.
3 réplicas sembradas directamente c
26 DE SEPTIEMBRE 2014

Las réplicas de benlate no presentan el micelio del hongo, pero aparece un cuerpo ceroso blanquecino se
sospecha de bacterias, el explante presenta un necrosamiento del tejido acelerado.

Siembra directa (T1, T2, T3) las tres replicas presentan contaminación por un micelio blanquecino, la que
presenta un menor grado de contaminación es la T3.
07 de octubre de 2014
Tratamiento 1 Explante en imbibición de 2g de Tratamiento 2 Explante en el medio enriquecido
benlate durante 20 minutos, en el medio con C.A
enriquecido con C.A

Tratamiento 1(R1, R2) Tratamiento 2 (R1, R2)


09/10

Los explante no presenta micelio del hongo, Los explante presenta el micelio blanquecino, el
pero si un cuerpo ceroso blanquecino y cuerpo ceroso y un necrosamiento de los
necrosamiento de los tejidos tejidos, más lento con respecto al tratamiento 1.

SIEMBRA 14 DE OCTUBRE 2014

Tratamiento 1 (R1, R2) explantes sin hojas Tratamiento 2 explantes con hojas

16/10 T1R1: El medio presenta contaminación T2R1: Presenta contaminación en el medio.


por bacterias. T2R2: No presenta contaminación.
T1R2: No presenta contaminación, pero
tampoco se observa germinación de
yemas.
20/10 T2R1: necrosamiento del material vegetal, T2R1: Presenta contaminación en el medio y
presencia de bacterias, micelio del hongo necrosamiento del material vegetal.
blanco saliendo del explante. T2R2: presencia de cuerpos cerosos en el medio de
T2R2: Presenta contaminación en el cultivo.
medio y necrosamiento del material
vegetal.

SIEMBRA 28 DE OCTUBRE 2014


TRATAMIENTO 1
FECHA Siembra en un medio de cultivo enriquecido con 0.2 g de benlate y explantes sin
hojas

03/11 Los explantes presentan contaminación con el micelio blanquecino y necrosamiento, este material
es desechado de laboratorio.
04/11 Siembra de explantes en un medio enriquecido con benlate 0.2 g
Ingeniero Darío Garavito Garavito.

Siembra de explante en forma vertical.

11/11 Los explantes presentan contaminación por parte de un cuerpo ceroso blanquecino, presenta
micelio blanco y necrosamiento del material vegetal.
7. DISCUSION DE RESULTADOS
En varios estudios previos se indica la dificultad de obtener material aséptico de
guayaba para el cultivo in vitro (Ramírez, León y Urdaneta, 1999), lo que significa
que la desinfección superficial es a menudo un factor limitante para el
establecimiento in vitro. El protocolo de desinfección superficial. En el trabajo de
investigación la contaminación fue un factor limitante pero con la aplicación de
0.2g de Benlate, se logró un nivel bajo de contaminación, controlando el micelio
blanco que presentaba el explante una vez sembrado.
El problema fenolización está estrechamente relacionado al estrés oxidativo y
nitrosativo que sufren las células del explante cultivado. Este fenómeno se
produce por el desbalance entre las reacciones pro-oxidación (excesivaformación
deROSy, o RNSo de naturaleza enzimática) (Novoaet al. 2001, Turrens 2003). Se
demostró que adicionar 30 mg de carbón activado al medio de cultivo, reduce los
problemas de fenolización característico de esta especie, al recoger fenoles y
polifenoles que desprende el material vegetal y afecta el medio de cultivo y el
progreso del explante.

8. CONCLUSIONES
Al ser material vegetal joven entre más drástico sea el proceso de desinfección
que le realicemos a las yemas de guayaba acida (Psidium araca L.) , mayor será
la velocidad de necrosamiento del explante ya que se verán afectados sus tejidos
por el estrés al cual se han sometido.
Gracias al aporte o la información recolectada en los antecedentes, se demostró
que adicionar 30 mg de carbón activado al medio de cultivo, reduce los problemas
de fenolización característico de esta especie, por lo cual se recomienda como el
mejor tratamiento para reducir los fenoles y polifenoles liberados por el explante.
Con las distintos tratamientos de desinfección evaluados y aplicados al materia
vegetal el que mejor resultados presento fue con la aplicación de 0.2g de
Benlate, donde se logró un nivel bajo de contaminación, controlando el micelio
blanco que presentaba el explante una vez sembrado, pero al ser un tratamiento
de desinfección muy severo se prevé que incide en la no germinación de las
yemas de guayaba acida (Psidium araca L.) .

9. RECOMENDACIONES

Para futuras prácticas de propagación de guayaba acida (Psidium araca L.)


se recomienda recolectar yemas provenientes de árboles jóvenes, los
cuales no presenten problemas fitosanitarios ya que al ser material vegetal
delicado, presentaran problemas al realizar procesos de desinfección
severos, estos pueden ser drásticos y causar daño a los tejidos del
material vegetal.

Aumentar la exigencia en los protocolos de uso y manejo del laboratorio por


parte de docentes y estudiantes que lo utilizan, con el fin de obtener unas
condiciones de asepsia optimas en el laboratorio al momento de realizar
alguna actividad ya que la contaminación presente en el área de trabajo
incide en los resultados de la investigación.

Se recomienda hacer un tratamiento de diferentes medios de cultivo


diferentes al M&S y de acuerdo a los antecedentes

Realizar tratamientos con medios diferentes al M&S; según los


antecedentes consultados este no es el adecuado para plantas de tipo
leñoso como es el caso de la guayaba agria (Psidium araca L.)

10. BIBLIOGRAFIA

 EFECTO DE TRES ANTIOXIDANTES EN EL CULTIVO In Vitro DE


ÁPICES DE GUAYABA (Psidium guajava L.). RELACIÓN ENTRE
EL ORIGEN DEL EXPLANTE Y EL CONTENIDO DE
COMPUESTOS FENÓLICOS. O. Concepción, Lelurlys Nápoles,
Aurora T. Pérez, Martha Hernández, Ninel Peralta y R. Trujillo.
Cultivos Tropicales, vol. 26, núm. 1, 2005, pp. 33-39, Instituto
Nacional de Ciencias Agrícolas, Cuba.

 Jiquilpan, Michoacán. Marzo 2010, ORGANOGÉNESIS in vitro


DE ARÁNDANO Vaccinium corymbosum L."

 Propagación in vitro de Psidium guajaba mediante


organogénesis directa a partir de segmentos nodales. Fabiola
Ocampo y Víctor Manuel Núñez. Revista Corpoica – Ciencia y
Tecnología Agropecuaria (2007). P 22-27.

 PROBLEMAS DE OXIDACIÓN Y OSCURECIMIENTO DE


EXPLANTES CULTIVADOS in vitro. Álvaro Azofeifa. Agronomía
mesoamericana 20(1): 153-175. 2009

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