PRÁCTICA N° 2

CURVA DE CRECIMIENTO, RECUENTO EN PLACA Y MÉTODO

ESPECTOFOTOMÉTRICO

Introducción

El crecimiento poblacional microbiano se define como un incremento de la biomasa

en el tiempo y puede ser determinado directamente a través de técnicas que
permitan la cuantificación de la biomasa. En la práctica No. 1, se evidenció la
importancia del recuento en placa para estimar el número de microorganismos
cultivables presentes en una muestra. En esta práctica, se introducirá la medición de
la turbidez de un cultivo por espectrofotometría como otra de las técnicas útiles para
la cuantificación de la biomasa microbiana y el crecimiento poblacional.

El análisis del crecimiento poblacional requiere de metodologías sencillas que

permitan hacer registrar los cambios en la abundancia microbiana en el tiempo. El
registro de dicho crecimiento puede hacerse directamente, a través de la
determinación de los cambios en el peso seco en el tiempo o midiendo algunos
parámetros que aumentan a medida que lo hace la biomasa celular. Este último es
el caso de la turbidez del cultivo, medida con un espectrofotómetro que proyecta un
haz de luz monocromática a través de la muestra, donde las partículas en suspensión
absorben y/o dispersan dicho haz de luz. Lo anterior, brinda información sobre la
naturaleza de la partícula presente en la muestra e indica indirectamente su
concentración. Para nuestro caso, el espectrofotómetro posee un detector que mide
la fracción de luz incidente que es trasmitida a través de un cultivo microbiano.
Cuando la luz atraviesa la suspensión de células, estas absorben y dispersan los
fotones, de manera que la cantidad de luz que llega al detector es menor que la
incidente. Así, la cantidad de luz absorbida es directamente proporcional a la
cantidad de células presentes en el cultivo (Figura 1) (para mayor información,
consultar la Ley de Lambert-Beer).

Figura 1. Medición de turbidez de

un cultivo microbiano. A) Esquema
que ilustra los componentes de un
espectrofotómetro. Las fotoceldas
miden la luz incidente dispersada
por las células en suspensión y da
lecturas en absorbancia. B)
Relación entre la turbidez y el
número de células o peso seco.
Nótese que la relación uno a uno se
pierde a una alta turbidez (Adaptado
de Brock, Microbiology of
microorganisms 2013).
Con base en lo indicado en la figura 1B, es importante resaltar que las medidas de
absorbancia, se deben mantener entre valores de 0.1 y 1.0; razón por la cual, cuando
la absorbancia de un cultivo sea > 1.0, se deben realizar diluciones que permitan
lecturas con valores que estén dentro de este rango. Es importante aclarar que, en
estos casos, el resultado de la absorbancia obtenido a partir de una dilución, debe
ser multiplicado por el factor de dilución, para así obtener el resultado real de la
cantidad del analito en la muestra. Generalmente, para evaluar la concentración de
biomasa en una suspensión bacteriana por espectrofotometría, se usan longitudes
de onda entre los 550 y 650 nm, puesto que los componentes de los medios de
cultivo usuales absorben poco a estas longitudes de onda, de manera que las
lecturas obtenidas son principalmente, dependientes de la dispersión provocada por
las células en suspensión. Cuando la medición de la biomasa se realiza en distintos
tiempos del crecimiento microbiano en un cultivo, el resultado será una “curva de
crecimiento” (Figura 2).

Figura 2. Curva de crecimiento. Representación gráfica de la

cinética de crecimiento de dos poblaciones de microrganismos (A
y B) propagándose en medios de cultivo independientes
(Adaptado de Brock, Microbiology of microorganisms 2013).

La curva de crecimiento de un microorganismo describe diversas fases del

crecimiento poblacional bajo las condiciones de cultivo en que usualmente estos se
mantienen y cada una está relacionada con diferentes estados de actividad celular y
con las condiciones que se producen a lo largo del tiempo. Esta curva se puede
dividir en cuatro fases generales (Figura 3):

Latencia: cuando una población bacteriana es inoculada en un medio fresco el

crecimiento no suele comenzar de inmediato y, por lo tanto, se encuentran en un
periodo de transición. En esta fase no hay un incremento exagerado de células, pero
hay gran actividad metabólica que conlleva a un incremento en el contenido proteico
y a la replicación del material genético, haciendo que las células aumenten su
tamaño individual y se preparen para la siguiente fase.

Exponencial o logarítmica: es el periodo de la curva del crecimiento en el cual el

microorganismo crece exponencialmente, es decir, la población se duplica. Aquí se
puede determinar la tasa de crecimiento de cada microorganismo en las condiciones
dadas.
Estacionaria: si la población microbiana se encuentra en un sistema de cultivo
cerrado, esta no puede crecer indefinidamente de forma exponencial, puesto que se
presentan limitaciones de crecimiento ya sea por agotamiento de algún nutriente
esencial, por acumulación de productos tóxicos, porque se alcance un número de
células elevado para el espacio disponible o por combinación de las causas
anteriores.

Muerte: si la incubación continua después de que una población microbiana alcanza

la fase estacionaria, algunas células podrán continuar vivas y seguir metabolizando,
pero otras van a morir y se lisarán por las condiciones de estrés en las que se
encuentra, generando una disminución progresiva en el número de células viables.

Figura 3. Curva de crecimiento microbiano graficada con dos métodos, espectrofotometría

y recuento de células viables. Estas curvas muestran las 4 fases de crecimiento microbiano.
(Adaptado de Brock, Microbiology of microorganisms, 2013).
Objetivo general

Conocer la utilidad de la curva de crecimiento para el análisis de la actividad de una

población microbiana.

Objetivos específicos

 Construir una curva de crecimiento microbiano usando las métodologías de

espectrofotometría y recuento en placa.
 Comparar el crecimiento de dos microorganismos, Escherichia coli y
Saccharomyces cerevisiae, bajo las condiciones de cultivo establecidas en la
práctica.
 Obtener la ecuación que relaciona los resultados obtenidos por el método
espectrofotométrico y el recuento en placa para cada microorganismo.

Procedimiento

Cuantificar el cambio en el número de bacterias y de levaduras en un par de sistemas

de cultivo cerrado durante un período de 8 horas. Para esto, se asignarán 8 grupos,
cada uno de los cuales realizará, a intervalos de 60 minutos, lecturas de absorbancia
en el espectrofotómetro y el recuento de unidades formadoras de colonia por el
método de siembra en superficie.
El procedimiento descrito a continuación es el mismo para los dos microorganismos,
variará el medio de cultivo; en el caso de la levadura el medio es extracto de malta
(YM) y el de la bacteria Luria Bertani (LB). Cambiarán también las diluciones a
sembrar de cada uno de los microorganismos.

Curva de crecimiento por espectrofotometría

1. La microbióloga inoculará 4 Erlenmeyers así: 2 Erlenmeyers que contienen 50 ml

de caldo LB serán inoculados con E. coli e incubados a 37 °C. 2 Erlenmeyers que
contienen 50 mL de caldo YM serán inoculados con S. cerevisiae y se incubarán
a 30 °C. Una vez inoculados los medios ella leerá la absorbancia de cada uno de
los 4 cultivos a 600 nm y realizará el respectivo recuento en placa. Estas serán
las mediciones del tiempo cero (T0) de las curvas de crecimiento.

2. A partir de este momento, a intervalos de una hora durante las siguientes 8 horas,
cada grupo debe tomar 1 mL de cada cultivo así:
 Retirar el Erlenmeyer de la incubadora y agitar vigorosamente para
homogenizar el cultivo.
 Destapar el frasco cerca de la llama del mechero, flamear la boca del
frasco y tomar 1 mL con micropipeta o con pipeta estéril.
 Depositar dicho volumen en la cubeta para su posterior lectura en el
espectrofotómetro.
  Flamear nuevamente la boca y la tapa del frasco y taparlo.

3. Medir la absorbancia a 600 nm para ambos microorganismos utilizando como

blanco, el medio de cultivo rotulado como tal.

4. Consignar los datos de absorbancia en las tablas adjuntas. Recuerde indicar en

los casos donde haya realizado alguna dilución.

5. Desechar la muestra en un frasco con solución desinfectante. Lavar la celda con

alcohol y enjuagar con agua destilada.

Nota
 Recuerde que se debe realizar una dilución de la muestra cuando la
absorbancia sea > 1,0.
 Es importante realizar la lectura de la absorbancia, agitando vigorosamente el
cultivo.
 Verifique antes de cada lectura en el equipo, que la longitud de onda y el
blanco que está utilizando y la posición de la cubeta, sean las correctas.

Curva de crecimiento por recuento en placa

1. Recuerde y aplique el procedimiento para el recuento en placa del laboratorio

anterior.
2. Según la hora del cultivo, realice las diluciones seriadas como se indica en la
siguiente tabla:

Tiempo de Cultivo E. coli Cultivo S. cerevisiae

incubación del Diluciones a Diluciones a
cultivo (min) sembrar sembrar
0* -1 -2
10 , 10 , 10 -3 10 , 10-2 , 10-3
-1

60 -2 -3
10 , 10 , 10 -4 10-2, 10-3 , 10-4
120 10-2, 10-3 , 10-4 10-2, 10-3 , 10-4
180 -3 -4
10 , 10 , 10 -5 10-3, 10-4 , 10-5
240 10-4, 10-5 , 10-6 10-3, 10-4 , 10-5
300 -5 -6
10 , 10 , 10 -7 10-3, 10-4 , 10-5
360 10-5, 10-6 , 10-7 10-4, 10-5 , 10-6
420 10-6, 10-7 , 10-8 10-4, 10-5 , 10-6
* Esta lectura es la que realiza la microbióloga a las 6:00 am.
Para esto:
 Cada estudiante debe marcar los tubos y las 6 cajas de Petri con agar LB
(para E. coli) y con agar YM (para S. cerevisiae) con las diluciones
correspondientes.
  A partir del cultivo y en condiciones asépticas, tome 0.5 mL y transfiéralos al
primer tubo correspondiente que contiene 4,5 mL de solución salina. Mezcle
con el vortex y repita este proceso para preparar las diluciones posteriores.
Es posible utilizar la misma pipeta para realizar todas las diluciones siempre y
cuando no olvide que debe purgar la pipeta en cada paso.

3. Siembre por el método de siembra en superficie las 3 últimas diluciones

correspondientes en cajas de Petri que contienen agar LB y YM, según
corresponda. Para esto:
 A partir de las diluciones y en condiciones asépticas, tome 0.1 mL de la mayor
dilución y deposítelos en el centro del medio de cultivo.
 Con el asa de Digralsky estéril, realice una buena distribución de la muestra
en la superficie del agar. Para este proceso, tome el asa, sumérjala en alcohol,
elimine el exceso de alcohol (evite el goteo) y esterilícelo flameándolo con el
mechero permitiendo que la llama consuma el alcohol remanente y enfríelo
ligeramente antes de hacer contacto con la muestra.
 Repita el proceso para la siembra de las siguientes diluciones.
 Espere a que seque un poco la muestra sobre el agar.
4. Incube a 37 °C la bacteria y a 30 °C la levadura por 24 h.
5. Realice el recuento de unidades formadoras de colonia aplicando sus
conocimientos previos.
6. Consignar los datos del recuento en placa en las tablas adjuntas. Recuerde
indicar en la dilución en la que realiza el recuento.

Análisis de resultados:

1. Graficar para cada microorganismo el cambio en la densidad óptica de los

cultivos (absorbancia) a lo largo del tiempo de incubación.
2. A partir de los datos del recuento y teniendo en cuenta la dilución en la que
este se reporta, calcular el número de unidades formadoras de colonia que
hay por cada mililitro (UFC/ml) de cultivo de bacteria.
3. Graficar para cada microorganismo el cambio en el número de células en
términos de UFC/ml a lo largo del tiempo de incubación.
4. ¿Qué fases de crecimiento puede identificar en cada una de las curvas de
crecimiento obtenidas para E. coli y para S. cerevisiae?
5. Identificar en la gráfica del punto 3, el intervalo de tiempo donde ocurre la fase
exponencial y graficar solo para estos valores el logaritmo natural (LN) de la
densidad celular (UFC/ml) en función del tiempo.
6. A partir de los datos del numeral 2 calcular la pendiente de la curva para cada
intervalo de tiempo de 1.5 h, de acuerdo con la siguiente ecuación:

𝑁𝑡2 − 𝑁𝑡1
𝑃=
𝑇2 − 𝑇1
Donde, P es la pendiente; NT2 corresponde al número de UFC/ml en el tiempo t +
1.5 horas; Nt el número de células en el tiempo t.

7. ¿Qué representa la pendiente calculada en el numeral 6 y cómo cambia el

valor de esta pendiente en el tiempo?
8. ¿Cuál es el comportamiento de la gráfica obtenida en el numeral 5? Utilizando
la ecuación presentada en el numeral 6, calcule la pendiente de esta gráfica.
¿Qué representa esta otra pendiente?
9. Para cada uno de los cultivos, obtener la curva y la ecuación que relaciona los
valores de absorbancia y los valores correspondientes de número de UFC/ml.
10. ¿Cuál es el comportamiento esperado de la gráfica obtenida en el numeral 9?
¿qué comportamiento observa en la gráfica que usted obtuvo?
Resultados
Recopile los datos obtenidos en la siguiente tabla:

Tabla de resultados de cuantificación de biomasa por densidad óptica y recuento en placa

Densidad óptica
Tiempo Recuento en placa
Hora (600 nm)
de
de Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 1 Cultivo 2
cultivo S.
lectura E. coli E. coli E. coli S. cerevisiae S. cerevisiae
(min) cerevisiae
Dilución* UFC* Dilución* UFC* Dilución* UFC* Dilución* UFC*

*Reporte solamente el resultado que se ajuste a los criterios de recuento en placa (dilución a la cual, las UFC estén
entre 30-300).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aldabe S, Aramendía P, Bonazzola C, Lacreu L. Química 2: química en acción.

Buenos Aires: Ediciones Colihue; 2004. 400 p.

Experimental Biosciences Resources [Página principal en internet]. Houston: Rice

University; c1996 [actualizado 2015 Jun 2015; citado 2015 Oct 2]. [aprox. 2
pantallas]. Disponible en:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/spectrophotometer.html

Todar's online textbook of bacteriology [Página principal en internet]. Wisconsin:

Kenneth Todar; 2008c [actualizado 2012, consultado 2016 may 27]. [aprox. 3
pantallas]. Disponible en: http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html

Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA, Clark DP. Brock, Biology of microorganisms. 13
Ed. California: Benjamin Cummings; 2011. 1523 p.

Olivas E E, Alarcón LR. Manual de prácticas de microbiología básica y microbiología

de alimentos. México: Universidad Autónoma de Ciudad de Juárez. Departamento
de Ciencias Básicas del ICB. Academia de Microbiología y Parasitología.; 2004. 107
p.

Rohatgi-Mukherjee KK. Fundamentals of photochemistry. 2 Ed. New Delhi: New Age

International (P) Limited, Publishers; 2006.

Universidad Interamericana de Puerto Rico. Recinto de Bayamón. Departamento

Ciencias Naturales y Matemáticas [Página principal en internet]. Puerto Rico;
[actualizado 2015 ago, citado 2015 oct 7]. [aprox. 2 pantallas]. Disponible en:
http://facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/Crecimiento%20Microbiano.htm

Weeks BS, Alcamo IE. Microbes and society. 2 Ed. United States of America: Jones
and Bartlett Publishers; 2008.