Práctica de Elisa.

Realizado por: Noelia Palacio, Mónica Pérez, Katharina

Pérez, Paula Randino.
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ÍNDICE

1. FUNDAMENTO TEÓRICO 3

2. INTRODUCCIÓN 4

3. OBJETIVOS 5

4. MATERIALES 5

5. PROCEDIMIENTOS 5

6. HIPÓTESIS 6

7. RESULTADOS 6

8. DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN 7

9. RESULTADOS HIPÓTESIS 8
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Fundamento teórico.

Una sonda es un fragmento de ADN o ARN marcado, con una sustancia, que se une a su

secuencia complementaria con el fin de localizar genes en específico. La hibridación con

sonda es muy utilizada en biología molecular a la hora de realizar diversos estudios como

patologías genéticas, de enfermedades infecciosas, expresión génica o investigación.

En esta práctica vamos a realizar un test de ELISA, el cual tiene por objetivo detectar un

anticuerpo específico complementario a un antígeno. Para ello necesitamos un antígeno,

del cual se unirá un anticuerpo primario encargado de reconocer la cubierta del virus,

posteriormente se unirá un anticuerpo secundario que se encarga de detectar la presencia

del complejo anticuerpo-antígeno y que funciona unido a una enzima HRP que permite

localizar el antígeno por más mínimo que sea , esta enzima se unirá a un substrato que dará

lugar a un producto con color, dependiendo del sustrato que sea el color será marrón (S1) o

azul (S2)

Cabe destacar que para que esta técnica se realice correctamente, no debe faltar ningún

miembro de la cadena anterior mencionada, ya que la carencia de uno supondría la

imposibilidad de unión del resto, es decir, si no existe un antígeno, el anticuerpo primario

no se podría unir, y por consecuencia el secundario tampoco, etc. Esto ocurre ya que todos

los elementos se “vinculan” entre sí. por lo que si falta uno, el siguiente no puede adherirse,

por ende, si entre un reactivo y otro se realiza un lavado, los elementos no adheridos se

retirarán.
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Introducción.

Nuestra práctica consiste en realizar una sonda denominada ELISA, esta técnica es

comúnmente utilizada para detectar anticuerpos unidos a antígenos en pacientes que

hayan sufrido una infección. Para ellos necesitaremos unos pocillos en los cuales vertemos

antígenos y dejaremos que estos sean absorbidos y luego retiraremos el líquido sobrante. A

continuación, vertemos un anticuerpo primario, un anticuerpo secundario, y un sustrato.

Para verificar si la técnica Elisa se basa en los conocimientos obtenidos en el tema 16,

vamos a realizar variaciones a la hora de realizar los pasos. Nuestra microplaca consta de

cuatro filas de pocillos y tres columnas, en vez de realizar el mismo procedimiento en cada

pocillo, vamos a modificar la fila 1 y la fila 3. En la fila 1, no vamos a verter el antígeno en

primer lugar, pero vamos a realizar los siguientes pasos correctamente, mientras que en la

fila 3 , no vamos a añadir el anticuerpo primario pero vamos a realizar el resto de pasos

correctamente. Si la práctica se realiza correctamente, debemos esperar que estas dos filas

(1 y 3) no presenten ningún color ya que la sonda no se pudo realizar, lo cual reafirmará

nuestros conocimientos obtenidos en el tema 16.

En la fila 2, vamos a usar el sustrato numero 1, por ende debemos de esperar que el

producto final sea de color marron, por otro lado, en la fila 4 hemos utilizado el sustrato

número 2, por lo que debemos esperar un producto final de color azul.

Para la realización de esta práctica, la clase a sido dividida en 6 grupos entre los cuales se

repartirán los procedimientos de: preparación de antígeno, preparación de tampón de

lavado, preparación de anticuerpo primario, preparación de anticuerpo secundario,

preparación del sustrato ABTS (S2) y preparación de sustrato ABTS (S1). Una vez que todo

esté hecho y todos los grupos constan de una cantidad de los elementos, se comienza a

realizar la técnica de ELISA.

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Objetivos

El objetivo de esta práctica es que los estudiantes aprendan a utilizar la técnica llamada
“técnica ELISA” o “enzimoinmunoanálisis de adsorción”, con la finalidad de que aprendan a
detectar anticuerpos en la sangre, además de adquirir nuevos conocimientos y cómo llevar
a cabo este procedimiento. Además de este, otro objetivo será aprender a seguir un
protocolo de laboratorio y en caso de fallos ser capaces de detectarlos para mejorarlos.

Materiales

Los materiales que hemos utilizado para realizar esta práctica han sido los siguientes:

● Agua destilada

● Pipeta Pasteur

● Vaso de precipitado con 16 ml 1x PBST

● Vaso de precipitado de 250ml para desechar residuos

● Probeta

● Pipeta

● Placa de microtitulación

● Tubo Eppendorf de 0,5 ml con sustrato 1

● Tubo Eppendorf de 0,5ml con sustrato 2

● Tubo Eppendorf de 0,6 ml con anticuerpo primario

● Tubo Eppendorf de 0,6 ml de anticuerpo secundario

● Tubo Eppendorf de 0,6 ml de antígeno

Procedimiento

Para realizar esta práctica, primero preparamos y esterilizamos la zona y todos los
materiales que vamos a utilizar en esta práctica. Identificamos las sustancias que vamos a
emplear, que en nuestro caso son 1xPBST, sustrato 1, sustrato 2, anticuerpo primario,
anticuerpo secundario y antígeno. Comenzamos añadiendo tres gotas de antígeno en cada
pocillo de las filas 2,3 y 4 y lo dejamos incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Una vez pasado este tiempo, eliminamos el líquido que hay en cada pocillo con ayuda de
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una pipeta pasteur para luego lavar los pocillos usando el tampón 1X PBST. A continuación,
volvemos a eliminar el líquido de todas los pocillos, pero usando una pipeta diferente para
cada fila. Repetimos estos dos últimos pasos.
Seguidamente, añadimos 3 gotas de anticuerpo primario en las filas 1,2 y 4, mediante la
misma pipeta y dejamos incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Quitamos el
resto de líquido presente en los pocillos usando una pipeta diferente para cada fila.
Posteriormente lavamos cada pocillo usando el tampón 1X PBST. Añadimos 3 gotas de
anticuerpo secundario en todos los pocillos y también lo dejamos incubar durante 5
minutos a temperatura ambiente. Eliminamos el resto del líquido del anticuerpo secundario
de cada fila con una pipeta diferente por cada una de estas. Por último, volvemos a lavar los
pocillos usando el tampón 1X PBST y luego lo retiramos, añadimos 3 gotas de sustrato 1 en
las filas 1 y 2, 3 gotas de sustrato 2 en las filas 3 y 4 para finalmente dejarlo incubar 5
minutos y observar los resultados.

Hipótesis.

Dado a que hemos estudiado que para que el sustrato de lugar a un producto con color

deben estar el antígeno, el anticuerpo primario y secundario, la enzima HRP, el sustrato y el

producto, podemos plantear la hipótesis de que las filas 1 y 3 a las cuales les falta uno de

los elementos mencionados no van a dar como resultado un producto con color. Por otro

lado, las filas 2 y 4 al si tener todos los elementos, deben dar como resultado un producto

con color. Esta hipótesis es válida siempre y cuando la práctica se realice correctamente sin

contaminación de las muestras.

Resultados

Img1. Modelo de la práctica Img2. Resultados de la práctica

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Tras haber seguido todos los pasos del procedimiento obtuvimos los resultados que se

muestran en la imagen 2. En la imagen 1 podemos observar los valores de referencia que

teníamos de la práctica.

En cuanto a la primera fila, podemos observar que el producto no tiene color, por ende

quiere decir que al faltar el antígeno, el resto de elementos no se han adherido a nada y al

realizar el lavado con el tampón, estos se han lavado también.

En la segunda fila podemos distinguir un color marrón característico del sustrato 2 ya que si

se ha completado la técnica.

En la tercera fila podemos ver una estela azul en nuestros resultados mientras que no

debería de haber color al igual que en la fila 1. Esto se debe a la contaminación ya que en

primer lugar, la intención principal era no añadir el anticuerpo primario, pero puede ser que

al hacer los lavados o al verter las gotas se haya contaminado el pocillo. Es por ello, que ha

conseguido emitir un producto azul pero este es muy escaso. En caso de no haber

contaminación como hemos podido observar en la práctica de algunas compañeras, hemos

podido observar que esa fila sería completamente transparente.

En la cuarta fila se distingue un color azul característico del sustrato 1, lo que quiere decir

que todos los elementos se unieron entre sí y dieron como resultado el producto azul.

Discusión y conclusión

Basándonos en los resultados obtenidos procedemos a compararlos.

En la primera fila no se introdujo el antígeno por lo que no se pudo completar la técnica

ELISA y no se manifestó ningún color. Esto se debe ya que como se explicó anteriormente,

es una cadena en la que si falta un componente, en este caso el primero, el resto de

componentes no pueden adherirse. En cuanto a la segunda fila, se manifestó el color

correspondiente al sustrato 1, el marrón, ya que se introdujeron todos los componentes.

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En cuanto a la tercera fila, había ausencia del anticuerpo primario por lo que al igual que en

la primera fila no debería haberse producido color. Cabe destacar que en nuestro caso sí

que apareció una estela azul. La contaminación pudo haberse ocasionado ya que en el

primer lavado usamos la misma pipeta para realizarlo mientras que deberíamos haber

usado una pipeta por fila. Pudo haberse contaminado también al ir vertiendo las soluciones

en las casillas y haberse caído algunas gotas. Por último en la cuarta fila se manifestó el

color azul, el correspondiente al sustrato 1.

Por otro lado, tras haber pasado un tiempo considerable, pudimos observar que todos los

colores se volvieron más intensos, apareciendo color incluso en la fila uno en la que

inicialmente no había ni debería de haber.

Esto se puede deber a más contaminación porque al estar

destapados estaban totalmente expuestos a agentes

contaminantes. Por otro lado también se encontraban a

temperatura ambiente, por lo que el color ha seguido

desarrollándose, un factor que ha podido interferir en los

resultados tras un tiempo. En conclusión, consideramos

que hemos cumplido con los objetivos de la práctica

aunque hemos de tener más cuidado con la

contaminación ya que puede alterar considerablemente

los resultados de las pruebas.

Resultado de la hipótesis.

Dado a que nuestros resultados están contaminados, no podríamos verificar la hipótesis.

Pero, ya que algunos de nuestros compañeros realizaron la práctica correctamente y sin

contaminación, podemos verificarla. Dado a los resultados obtenidos podemos decir que la

hipótesis es correcta.