Facultad de Medicina

Campus Viña del Mar

Química y Farmacia
FARM601

Tecnologías relacionadas con la

S detección del DNA

Amplificacion del material genético .

Rxn en Cadena de la polimerasa .

Dr. Cristóbal Mujica T.

cr.mujica@uandresbello.edu
 ↳y la
transforma en millones
de la mis ma secuencia .

¿Cómo podemos obtener muchas copias del mismo gen?

*
PCR se fundamento
detección . ,

~para
~

en Ran de replicacion

Amplifican una Secuencia in witho .

 PCR
Polymerase Chain Reaction
Reacción en cadena de la polimerasa

Amplificación enzimática de un fragmento de DNA especifico.

Permite generar millones de copias idénticas de un fragmento de DNA especifico
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)
 Elementos que se requieren para la síntesis del DNA
Z
4
Toyse separan por medio de la técnica de PCR helicasa
hay
.

no
para separar, per
se hace a To .

especificidad
& •
•
Hebra Templado o molde
Iniciador (cebador, primer)
• dNTPs: desoxirribonucleótidos tri-
fosfatados

L ↳
-

Tampon .
• DNA Polimerasa (enzima
responsable de copiar)

Mg • Cationes (Mg, cofactor)

Temus
abrotico .
2
Resistente cofactor
donde encuentre doble
latay
de
.

altO
polit -na amplificon
.

. nobra
Partiendo de un DNA molde, la enzima DNA polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de
una zona especifica delimitada por los primers.
 PCR: Separar las hebras de DNA
DNA de doble hebra la temperatura
equipo sube
y baja
1

I
dated 1
obs
:
o estudio
.

sellera
100 Melting autoda
94 oC
Temperatura

courxn
a 94°C .

50

0
Tengo 2 Simples hebras con
Tiempo nucleotiolos * puestos .
 -

100 Melting

Temperatura
94 oC

50

DNA de
cadena simple 0
Tiempo

0min
3

• Al aumentar la temperatura se rompen los puentes de hidrogeno que mantienen ambas hebras
unidas y logramos obtener DNA de simple hebra
• Además, al separarse las hebras permite que se expongan las bases para que sean leídas por las
enzimas
 Si To aumento especificiolad de
las secuencias , sid to puloe Melting
no 100
ocurrir que 94 oC

Temperatura
se alineen Annealing
30818
:

Primers
12 nuclótidos) 50 50 oC
sobran
550
se alineon
con see 0
secuencia en Tiempo
particulon
550 hibridación .

↑ ↓To pona
interrumpip
de
alineamiento depende
↑↑
Hibridación To de
una
de primers secuencial
con Ca
que

r
↓ traboyo

⑳
Se
⑪ aparean
↑ ↑ primer
Diseño del partidor permite
,
generan una estructura
que 10 a 22 nucleóticos , me donán elpto de partida
PCR Melting
100
94 oC

Temperatura
Extension
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo muclótido
ponohoicorrespondiente
.

->

· e
Taoy polimerasa
↓72°
& enzima Apolimorizad
infunciona
->
↳
d primando

.
5
&
PCR
30 ciclos

Temperatura
Melting Melting
100
94 oC Extension 94 C
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo

3’ 5’

Calor
5’
5’

Calor
5’
5’ 3’
 alabor
*
Se alaba cuando se

Mucleóticos .

30ciclos

Melting Melting
100
94 oC

Temperatura
Extension 94 C
o
Annealing
Primers 72 oC
50 50 oC

0
Tiempo
 Número de copias

1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6

Número de ciclos
Polymerase chain reaction (PCR)
https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38

4hrs .

Qué característica debe

tener la enzima?
 P
convencional
I Fase plateau
electroforesis

035cdos
.

30
Cantidad de DNA

↑h
De Acicloa
otpo se duplica el
material genético

Gregor
Fase exponencial
↳
PCR hoy en dia ,
un
asi puedo sabeR momento que
se satura
-

si estoi el producto
quel quiero y
Si &Stri

suncionando

Número de ciclos PCR

 Fundamentos del PCR

PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro.

Permite amplificar un fragmento específico de ADN situado entre dos regiones de secuencia conocida, y
consta de tres pasos:
1. Desnaturalización del ADN (a 95ºC): las dos hebras se separan a esta temperatura.
2. Hibridación de dos iniciadores (a 50ºC-65ºC): en este rango de temperaturas los iniciadores o
cebadores se unen a la hebra de ADN complementaria. Estos cebadores son específicos y determinan
que fragmento de ADN se va a amplificar.
3. Extensión o elongación de la PCR (72º C): la Taq polimerasa se une al cebador y empieza a replicar la
cadena que se desea amplificar.
Estos tres pasos o fases conforman un ciclo que se repite unas entre 30 y 40 veces.
Puesto que cada cadena que se sintetiza en el ciclo anterior sirve de molde para el siguiente, en cada ciclo
se duplica el número de copias de ADN. Así, la cantidad de ADN obtenido crece de forma exponencial, y
pueden conseguirse al final del proceso millones de copias de un único fragmento de ADN.
 Componentes del PCR

ADN molde: El primer paso antes de iniciar una PCR es extraer el ADN que se quiere amplificar,
normalmente a partir de muestras de sangre o de parafina. El protocolo de extracción y de PCR cambia en
función del origen de la muestra, ya que el ADN puede haberse visto afectado por los diferentes
mecanismos de preparación de muestras. La calidad del ADN influirá en las aplicaciones que le podremos
dar, es importante tener una buena calidad. Mediante técnicas de PCR se puede llegar a detectar una única
molécula en una mezcla compleja de ADN. La sensibilidad de la PCR varía dependiendo de la cantidad de
ADN molde (tamaño medio de los fragmentos y pureza). Además, determinadas sustancias que pueden estar
presentes en el ADN extraído pueden disminuir la eficacia de la PCR. La cantidad óptima de ADN molde de
partida para la reacción de PCR es de 10-200 ng.
 Componentes del PCR

Primers, iniciadores o Cebadores: Los primers son críticos para la PCR ya que proporcionan la especificidad
de la reacción. Así, en función del diseño de estos cebadores se amplificará una región u otra dentro del
ADN utilizado como molde. Son secuencias de cadena simple de entre 20 y 40 nucleótidos, complementarios
a los extremos de cada lado de la secuencia que queremos amplificar. La longitud y secuencia de los
cebadores son características esenciales para la reacción de PCR, ya que determinan la eficiencia de la
misma. Cuando se diseñan los cebadores (existen programas informáticos específicos para ello), hay que
considerar bien la temperatura a la que debe realizarse la hibridación y evitar los motivos repetidos que
puedan hibridar de forma incorrecta con el ADN. También debe evitarse la presencia de secuencias
invertidas que puedan dar lugar a la formación de estructuras secundarias en el cebador, o las secuencias
complementarias entre los dos cebadores que darían lugar a dímeros entre ellos.
 Componentes del PCR

Enzima Taq polimerasa: Es una enzima termoestable capaz de incorporar progresivamente nucleótidos
desde el extremo 3’ de un cebador. La Taq polimerasa fue inicialmente aislada de la bacteria Thermus
aquaticus y es capaz de amplificar el ADN a altas temperaturas (y por tanto no se desnaturaliza cuando en
el ciclo se superan los 75ºC y 95ºC). Actualmente, se usan polimerasas sintéticas con actividad “hot-start”,
cuya activación se inicia a elevadas temperaturas. Esto impide la síntesis a partir de dímeros de cebadores,
que se pueden formar a bajas temperaturas.
 Componentes del PCR
Tampones o buffer: cada ADN polimerasa requiere de su tampón específico para realizar su actividad
enzimática en condiciones óptimas de pH, etc.

MgCl2: la concentración de MgCl2 influye en la productividad y especificidad de la PCR. Una concentración

baja de estos iones produce un bajo rendimiento, pero alta especificidad. Sin embargo, una concentración
elevada da un alto rendimiento, pero produce la formación de productos inespecíficos.

Hay otros reactivos como el DMSO o la betaína, que hacen que se amplifiquen mejor las zonas ricas en GC.

Nucleótidos: componentes básicos del ADN, constituyen las unidades que la Taq polimerasa va a utilizar
para formar la nueva cadena de ADN. La concentración estándar de los nucleótidos en la reacción es de
200 microM. Los cuatro deben estar a la misma concentración para evitar errores en la polimerización.

Termociclador: es un equipo que marca las temperaturas en los tiempos indicados, de forma que permite
realizar automáticamente las distintas fases que conforman la reacción de PCR.
 Tipos de PCR
->
1.- PCR Anidado busca secuencia + especifica .

2.- PCR múltiple

3.- PCR invertido

4.- RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA)
5.- qPCR (Real time-PCR o quantitative PCR)

6.- RT-PCR (Reverse transcription-PCR)

/
 PCR anidada busca secuencial
->

↓especifical
Amplifica
fragmento
argo La PCR anidada es una modificación de la
PCR diseñada para aumentar la sensibilidad
de la reacción del ensayo.

a
Esta modificación consta de dos grupos de
cebadores dirigidos contra la misma diana.

El primer grupo de primers se desarrolla de

Amplifica la manera usual, mientras que el segundo
el pequeño grupo son primers situados internamente o
anidados con respecto al primer grupo
que deseo .
PCR invertido
PCR RAPD
 Clid .

Visualizo - sigo material

SARS qPCR (Real time-PCR o quantitative PCR)
min/min .

genétic
Se
que
en
produce
conda
La PCR a tiempo real simplifica la técnica de PCR puesto que no es necesario realizar una electroforesis
ciclo -

posterior, ya que es en el propio termociclador donde se detecta a tiempo real la cantidad de amplificado.

Fase plateau
Esta técnica permite, a diferencia del PCR
convencional, permite seguir la cinética de

Terminada cada reacción en tiempo real, por lo que

Cantidad de DNA

bromero de etidio esta permite una cuantificación sensible y

Fase exponencial
gage
.

Gando encuentral
la doble nebra específica del blanco que se desea analizar, al
&mite
geuorescencia utilizar la fase exponencial de la curva de
no distingue
material genético .

amplificación a diferencia de la PCR

tóxico .

convencional que se observa el resultado final

de la amplificación (Fase plateau).

Número de ciclos PCR

 Florobo

qPCR: Detección ↳ mento

Sonda gwanteres .

Sondas específicas para fragmentos del ADN, es decir, que meen

sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado un
fragmento del ADN de interés.
Se pueden dividir en tres tipos:
a) sondas de hibridación (A)
b) sondas de hidrólisis (B)
c) sondas de horquilla (C)
Endo frowmanoneti e

Todas se basan en la transferencia de energía entre dos

fluoróforos (principio FRET): un donador (reportero) y un
aceptor (apagador o quencher), los cuales emiten
fluorescencia a diferente longitud de onda. Cuando el
reportero y el apagador se encuentran próximos, el apagador
absorbe toda la fluorescencia del reportero. Cuando este par
de moléculas se separa, la fluorescencia del reportero no
puede ser absorbida por el apagador y en consecuencia
puede ser detectada por el fotodetector.
 qPCR: Sondas hibridación
En este caso se utilizan dos sondas específicas,
que hibridan con la secuencia del ADN de interés.
Una de ellas está marcada con un donador (en la
figura como D) y la otra con un aceptor (en la
figura como A).
La señal del fluoróforo aceptor solo es detectada
en caso de que se encuentre unido al donador. Por
lo que conforme se da la amplificación del ADN,
la cantidad de oligonucleótidos unidos será mayor
por lo que se incrementará la intensidad de la
fluorescencia.
Este sistema sigue la señal del fluoróforo
aceptor de forma opuesta a la sondas de
hidrólisis, que siguen la señal del reportero o
donador. Sondas: es un oligonucleótido específico (~20
bases) para la secuencia del gen de interés
 qPCR: Sondas de horquillas

En estas sondas, un oligonucleótido marcado en su

extremo 5’ con un reportero y el 3’ con un apagador,
se encuentran formando una horquilla, estructura que
los mantiene cercanos para poder llevar a cabo la
transferencia de energía y mantener al reportero
apagado.
Al unirse a la secuencia de interés, la horquilla se
extiende, aumentando la distancia entre el apagador y
el reportero, permitiendo detectar la fluorescencia
de este último.
Estas sondas de horquilla son altamente específicas.
 qPCR: Sondas de horquillas
Entre las más utilizadas se encuentran las sondas
TaqMan que se conocen también como sondas 5’
nucleasas (ya que utilizan la actividad 5’ exonucleasa de
la ADN polimerasa).
En este sistema se utiliza una sonda marcado con dos
fluoróforos, un reportero unido al extremo 5’ y un
apagador en el extremo 3’.
La longitud de la sonda es la distancia entre los dos
fluoróforos, de manera que la fluorescencia del
reportero está apagada por el fenómeno FRET.
La actividad 5’ exonucleasa de la ADN polimerasa corta
los nucleótidos de la sonda durante la amplificación, los
fluoróforos se separan y se observa la señal de
fluorescencia. Es decir, la hidrólisis de la sonda provoca
un incremento en la señal del reportero y ésta aumenta
proporcionalmente al incremento del amplicón.
 A interacciona con el mathial genético
qPCR: uso SYBR green de doble hebray emite florescencia,
hebra NO
↓ peo en simple -
-

Al final del proceso de extension se toma

a Soto
Existen además de la sondo otro formato de detección que es el uso de moléculas fluorescentes.
.

Puesto que la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de producto la utilización de

fluoróforos específicos para DNA doble hebra o bicatenario es una alternativa al uso de sondas.

SYBR-Green I es un fluoróforo específico que se une

solamente a DNA doble hebra.
Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco
SYBR-Green apagado
menor del DNA bicatenario, aumentando su
fluorescencia unas 1000 veces.
La detección con SYBR-Green I es tan sensible que
llega a identificar la producción de una única molécula.
Este formato de detección necesita una puesta a punto
SYBR-Green emitiendo fluorescencia previa para que la PCR no amplifique productos
inespecíficos que luego el fluoróforo detectaría,
DNA simple hebra
introduciendo errores en el posterior análisis de los
DNA doble hebra resultados.
+Doble hebrat fluorescencia
 qPCR: Detección
El equipo mide continuamente el incremento en fluorescencia manteniendo un registro que grafica
generando una cinética o curva de amplificaión, lo que permite saber que la reacción mantiene una relación
lineal hasta un determinado número de ciclos.

Si se mantiene una relación lineal es posible hacer

una extrapolación y determinar el número de
moléculas iniciales.

e
El PCR clásico mide la cantidad de producto solo
al término de todos los ciclos y presume que la
reacción es lineal. wind
La curva de amplificación está constituida por al en
menos tres fases distintas:
1) Fase de latencia (lag), donde la acumulación de
producto no se puede detectar
Ala hora sé
2) Fase exponencial.
3) Fase de saturación.
0
S
Acondiciona Nociclos .

miento
 qPCR: Cinética de amplificación
Fase de latencia (lag), durante los ciclos
iniciales de la PCR no hay cambios
significativos en la intensidad de la
fluorescencia emitida, por lo que es F. estacionaria
indistinguible el ADN amplificado y el ruido F. lineal
basal, pero permiten fijar la línea base.
Fase exponencial, aumenta la cantidad del
ADN amplificado y la señal fluorescente. El Fase latencia
F. exponencial
punto donde se observa un sensible
incremento en la fluorescencia se conoce
como fase inicial, la cual es el origen de la
fase logarítmica o geométrica.
Posteriormente, inicia la fase lineal en la cual
la eficiencia de amplificación no es
constante.
Fase estacionaria o saturación donde el
producto obtenido permanecerá constante,
aunque se aumente el número de ciclos.
 Ventajas PCR en Tiempo Real
Ø En la PCR convencional se observa el resultado final de la amplificación (Fase plateau). En la
PCR a tiempo real se analizan los datos de la fase de crecimiento exponencial, que es mucho
más informativa.

Ø El incremento de la fluorescencia es directamente proporcional al número de amplicones

generados, por tanto, se puede cuantificar. soen estima , no cuantifical

Ø La precisión, la resolución y la sensibilidad son mayores con la PCR a tiempo real.

Ø La PCR convencional solo discrimina por el tamaño del amplificado, en cambio la PCR a tiempo
real discrimina por tamaño y secuencia.

Ø No se requiere ningún proceso post-PCR por lo que se ahorra tiempo. Además, se minimizan los
problemas de contaminación por amplicones y se reduce la variabilidad en el resultado.

Ø El rango dinámico, es decir la sensibilidad de la técnica para diferenciar entre diferentes

cantidades, es mucho mayor empleando PCR a tiempo real, hasta 6 órdenes de magnitud.

Ø Si se emplean sondas en la detección de la fluorescencia, se evita la detección de los

-

artefactos de la reacción, como los dímeros de cebadores, que dan falsos positivos.
-
-
Templado
PCR
DNA
PCR tiempo real
PCR
enzima DNApol
↳
RNA RT-PCR
 Transcripción reversa

RT-PCR
 Transcripción reversa
Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer
una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR.
La transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA
complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA objetivo.
2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer mediante la
incorporación de nucleótidos complementarios.
3. Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA.
4. PCR.
El mRNA es copiado a cDNA por la transcriptasa reversa usando un primer.
En PCR en tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una actividad endo
H. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea formada.
Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como la Taq polimerasa), los
primers específicos para el gen de interés.