Tema 5.

Tecnología del
ADN recombinante:
PCR y secuenciación
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 ¿QUÉ ES LA PCR?

• La PCR (Reacción en Cadena de la

Polimera) es un proceso de síntesis in
vitro de un determinado fragmento de
DNA
• La técnica fue inventada en 1983 por el
Dr. Kary Mullis, quien recibió el premio
Nobel de química en 1993
 ¿QUÉ ES LA PCR?

¿Por qué “Polimerasa”?

• Porque en esta reacción la única enzima que se
utiliza es la polimerasa de DNA ACTIVIDAD DE SÍNTESIS

• La polimerasa de DNA siempre se posiciona en

la dirección 5’ 3’
• Cada polimerasa de DNA presenta condiciones
óptimas de temperatura, pH y concentración de
sales
– Taq polimerasa (más utilizada).Temperatura óptima:
72 ºC 2Kpts( la más )
rápida aunque
T tasa enn
 ¿QUÉ ES LA PCR?

¿Por qué “Cadena”?

• Porque el producto de la primera reacción
es el substrato de la siguiente reacción, y
así sucesivamente
 ¿QUÉ ES LA PCR?

¿Cuáles son los componentes de la

“Reacción”?
• DNA molde – contiene la secuencia a amplificar
• Cebadores – oligonucleótidos que definen la
secuencia a amplificar primers
• f dNTPs – desoxirribonucleótidos trifosfato
cualquier

(dATP, dGTP, dCTP, dTTP), que “construyen” la

nucleótido
(A , CT , G)

cadena de DNA
• Polimerasa de DNA – enzima que cataliza la
reacción
• Iones de Mg++ – cofactor del enzima
• Tampón – mantiene el pH a un nivel donde la la [ ]

polimerasa de DNA es más activa Optimizan

: calcular

necesaria de cada componente .

 ¿QUÉ ES LA PCR?

La “Reacción”

Tubo de PCR Termociclador

El dispositivo tiene un bloque térmico con
agujeros donde se pueden introducir tubos
que incluyen los componentes de la
reacción. El termociclador incrementa y
disminuye la temperatura del bloque en
pasos discretos y pre-programados
en un corto espacio de tiempo .
 ¿QUÉ ES LA PCR?
Amplifican a partir
de 2 sermones
muy largos una secuencia determinada elegido Csn los
primers
maí cor tas mejor
(20-25)
.

todo el cromosoma Cuanto

MPL / [ÓN
normalmente
necesita
.

más grandes se
si son

mástpaasmsepioauaaaee
dar lugar
reacción y puede
a
la separación de las

hebras sintetizadas .

☒ K

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5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 LOS TRES PASOS DE LA PCR

① • Desnaturalización del DNA

– Normalmente a 95 oC
• Alineamiento de los cebadores.
– La temperatura de alineamiento depende del
contenido en G y C.
– Si es muy elevado no se permite el
“mismatch” y si es muy baja éste puede ser
muy elevado.
• Extensión de la nueva hebra (síntesis).
 LOS TRES PASOS DE LA PCR

• Desnaturalización del DNA

– Normalmente a 95 oC
• Alineamiento de los cebadores ( REDUCIR)

– La temperatura de alineamiento depende del ri

y tipo

los nucleótidos de los cebadores

– Si es muy elevado no se permite el
“mismatch” y si es muy baja éste puede ser
muy elevado
• Extensión de la nueva hebra (síntesis).
94°C
T 2°C
E- G

A=T
Paso 2 de la PCR: Alineamiento

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 LOS TRES PASOS DE LA PCR

• Desnaturalización del DNA

– Normalmente a 95 oC
• Alineamiento de los cebadores
– La temperatura de alineamiento depende del
los nucleótidos de los cebadores
– Si es muy elevado no se permite el
“mismatch” y si es muy baja éste puede ser
muy elevado
• Extensión de la nueva hebra (síntesis)
Paso 3 de la PCR: Extensión
' '
5 3
°
POLIMERASA
72 TAC .

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 PCR: ciclo 2
-
DESNATURALIZAN 95° @ T)
-

ALINEACIÓN ( LT )
-
SÍNTESIS 72°)

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Producto del ciclo 2 de la PCR

Buscas un
fragmento
doble corto

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 Los primeros 4 ciclos de la PCR

A partir del 4° ciclo el crecimiento de es> ampliara> que buscamos de de de manera exponencial

Vierstraete, 2001
Resultado de la PCR

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 NECESIDADES DE LA PCR

• DNA molde: ≤ 1 µg
• dNTPs: 20-200 µM
• Tampón: pH 8,3-8,8
• Cloruro de magnesio: 0,5-2,5 mM
• Cebadores: 0,1-0,5 µM
• Polimerasa de DNA: 1,0-2,5 unidades

https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 DISEÑO DE LOS CEBADORES DE LA PCR

• Los cebadores son cadenas simples de DNA de

18–30 bases complementarias a las secuencias
flanqueantes de la región a amplificar
• A mayor longitud del cebador mayor temperatura
en el proceso de alineamiento
• El 50-60% de las bases deben ser G+C
• Los cebadores deberían terminar (3') en G o C, o
CG o GC mayorestabilidad

• Se debe evitar los “hairpins”, auto-dímeros y

secuencias palindrómicas
• La distancia entre los cebadores debería ser de
150-1.000 bp (se pueden utilizar hasta 20 Kb)

Existen diferentes plataformas (Oligo, GCG, Primer3,

BioTools, ect) para el diseño de cebadores
 si quieres esta mas

Necesita más tiempo Impa pero

se

pequeño
obtiene

también el
necesita menos
tiempo mnos harpo
este
' si genera
' M M A M

Cebadores
J 3-
/

3
' U W W U
g-
,

-
11000pts ÍÍÓBLEMA
3000pts PROBLEMA

.
Necesitas que haya primera
las dos hebras
Hairpin
Hairpin
en
.

osmplemennen
•
Primers escaleradss en oposición
cuando una secuencia
que amplifique
n
para
.

Simple se antrliga .

( COMPLEMENTARIEDAD COCAS )

Dímeros
Dimer
Union de eso
primer>
( No SEAN COMPLEMENTARIOS)

Auto-dímeros

Secuencias palidrómicas
-

produce complementariedad entre

primers .
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 VARIANTES DE LA PCR
- COLONIAS

'
RT-PCR

' TOUCHDOWN
'
ANIDADA

.
MULTIPLEX

-
TIEMPO REAL

• PCR de colonias
• RT-PCR
• PCR touchdown
}
PROBLEMAS

• PCR anidada o “nested”

• PCR multiplex OPTIMIZACIÓN

amplificación ]
• PCR en tiempo real fluoróforos
:
( medir
VARIANTES DE LA PCR: PCR de colonias
VARIANTES DE LA PCR: RT-PCR
la PPCR realiza
previa a una

retro transcripción .

( retro transcriptasa
 VARIANTES DE LA PCR: PCR touchdown

• Se utiliza cuando la amplificación es inespecífica F- cuando TT amplifica nada

a
baja y
no .

• Comienza con una temperatura superior a la Tm

teórica, ̴ 5 ºC. Disminuye durante varios ciclos -1º
C o -0,5 ºC, hasta que la temperatura de
hibridación es de 5-10 ºC por debajo de Tm. Para
los ciclos restantes se mantiene esta temperatura
de hibridación

•
Cuando no se
consigue amplificar una muestra

se realiza .

•
Utilizando las temperatura para conseguirlo .

→ ALTA c-
=
MUY EXIGENTE
+ 5°C

f-
-1°C
-
0,5°C
"

-10°C
 VARIANTES DE LA PCR: PCR touchdown

Desnaturalización 94 ºC 10 min
T
INICIAL .
Luego se va bajando
_

mis > matcted ( poco exigente )

1- =L favorece
.

ls
a-
1- T muy exigente .

( localizar que

)
quiero

Ciclo (x10) Ciclo (x25)

Desnaturalización 94 ºC 15 seg 94 ºC 15 seg
Alineamiento 65 ºC 30 seg (-1 ºC/cycle) 55 ºC 30 seg
Extensión 72 ºC 30 seg 72 ºC 30 seg

Extensión 72 ºC 5 min
Mantener 4 ºC
 VARIANTES DE LA PCR: PCR anidada ( dentro )
de

• Dos pares de cebadores de PCR se utilizan para amplificar

un fragmento uno está dentro de otro

• Primer par de cebadores amplifican un fragmento en

condiciones estándar de PCR. El segundo par de cebadores,
cebadores anidados (ya que se encuentran/anidan dentro del
primer fragmento), se unen en el interior del fragmento
producto de la PCR para permitir la amplificación de un
segundo producto de PCR que es más corto que el primero
– Ventaja: Muy baja probabilidad de amplificación inespecífica
( no electroforesis)
1- .
1- =L producto
laso
Primer par utilizado
cebado

largo

#-)
PRODUCTO FINAL
2.
producto Utibilcnds producto
hace
paso 1. se

EE primer PCR con el

corto cebador pequeño

¥ '
µ,
reduce mucho la
( selección nucleótido
probabilidad de

hibridación ya que

realiza
la LEPCR se

del producto
a
parir
de la 1° ,
lo que

se descar ten
hace que
muchas combinaciones

https://www.youtube.com/watch?v=7fSY-akGvrw
 VARIANTES DE LA PCR: PCR multiplex
ahorrar tiempo

• Permite la amplificación simultánea de muchos fragmentos

de interés en una única reacción mediante el uso de más de
un par de cebadores
•Condiciones:
– Los cebadores tienen que presentar Tm similares
– Los fragmentos amplificados deben presentar diferentes longitudes

margen para que

no
solapen
realizar
los
genes y se puede
PCR
L 233
.

virus
( Tiene que haber un

9233)
y otro .

{
cor rer en sonrisa ( se me mars claro)
→

Fragmentos
alelos
1

[Es
[tras
[ Fras
4. SOLAPAN
 VARIANTES DE LA PCR: PCR en tiempo real

• Se utiliza un fluoróforo para medir la cantidad de amplicón

como se sintetiza. La cinética de la PCR permite la
conocer la síntesis de las cadenas después de cada ciclo
marcada
de PCR (en vez de sólo al final de los ciclos) una
sonda

IMPORTANTE .

£
{ sensibilidad
NO AMPLIF /
cq.jo
.

hasta ciclo 15 no tiene ,

 VARIANTES DE LA PCR: PCR en tiempo real

• Se utiliza un fluoróforo para medir la cantidad de amplicón

como se sintetiza. La cinética de la PCR permite la
conocer la síntesis de las cadenas después de cada ciclo
de PCR (en vez de sólo al final de los ciclos)
VARIANTES DE LA PCR: PCR en tiempo real

CT
viral menor
.

* Cuanto mayor carga

http://www.slideshare.net/QIAGENscience/webinar-at-introtopcrfoodenviron0112ww
 VARIANTES DE LA PCR: PCR en tiempo real

• Ventajas:
La amplificación se puede monitorizar en tiempo real
Los productos no tienen que ser procesados tras la
PCR (alto rendimiento, bajo riesgo de contaminación)
Ciclos ultra-rápidos (de 30 minutos a 3 horas)
Requisito de 1000 veces menos RNA que los
más sensible

ensayos convencionales
Más específica, sensible y reproducible y no mucho
más caro que la PCR convencional (excepto el coste
del equipo) 50-70 mil

• Desventajas:
Alto coste de los equipos
Compleja técnicamente porque
es mucho más sensible .

Variación intra e inter-ensayo

en la misma ( entre muestras)
muestra
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 SECUENCIACIÓN

• La secuenciación es el proceso por el que se

determina el orden exacto de los nucleótidos en
una región determinada de DNA
 SECUENCIACIÓN SANGER

• Se utiliza una nucleótido modificado en la extensión del

DNA (didesoxinucleótido-ddNTP)

El grupo hidroxilo 3’ se ha modificado por un grupo de

hidrógeno en los ddNTP, por lo que finaliza la extensión de
la cadena de DNA debido a que no se puede formar un
enlace fosfodiéster
 SECUENCIACIÓN SANGER

Requisitos: DNA MOLPE

• Se utiliza el producto de PCR (amplicón) en forma de

hebra única secuencia en 1 dirección

• Los reactivos necesarios son los siguientes:

– Un cebador complementario a la región conocida para la
síntesis directa de la cadena
– DNA polimerasa
– 4 desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) sigue espiando
– 4 didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) para
de esperar .
 SECUENCIACIÓN SANGER

Procedimiento:
• Con la adición de la enzima (DNA polimerasa), el cebador
se extiende hasta encontrar un ddNTP
• La cadena finaliza siempre que se añade un ddNTP
• La cadena finalizará en todas las longitudes si la relación
dNTP:ddNTP es adecuada
 SECUENCIACIÓN SANGER - SIN COLOR
-
4 REACCIONES

1. Fragmento desconocido = AMPLICÓN PCR

2. Secuencia conocida
3. Cebador
4. dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, y dTTP)
5. Un tipo de ddNTP por reacción.
Marcado radiactivamente Cuatro reacciones
por separado
6. DNA polimerasa

ddATP ddGTP ddCTP ddTTP

5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

Reacción 1 Reacción 2 Reacción 3 Reacción 4

La reacción para
cuando se adiciona

el nucleótido correspondiente al DDNIP .

 SECUENCIACIÓN SANGER

I. :::: :: :::
longitudes determina la
.

dGdGdTddA
ddATP + dGdGdTdAddA
A Cuatro dNTps dGdGdTdAdAddA
dGdGdTdAdAdAdTdCddA

ddCTP + dGdGdTdAdAdAdTddC
C
Cuatro dNTps

ddG
ddGTP +
G Cuatro dNTps dGddG
dGdGdTdAdAdAdTdCdAdTddG

ddTTP + dGdGddT
T dGdGdTdAdAdAddT
Cuatro dNTps
dGdGdTdAdAdAdTdCdAddT
 SECUENCIACIÓN SANGER

• Los fragmentos de diferente longitud simulan una

escalera
• Las cadenas resultantes se resuelven por electroforesis,
introduciendo una reacción en cada uno de los carriles
3′
G
G A T C G
T
Fragmentos largos ddG A
A
A
T
C
Fragmentos cortos ddG A
T
G
5′
Los geles de secuenciación se leen de abajo a arriba
(dirección 5′ a 3′)
https://www.youtube.com/watch?v=3M0PyxFPwkQ
 SECUENCIACIÓN SANGER

• Los fragmentos de diferente longitud simulan una

escalera
• Las cadenas resultantes se resuelven por electroforesis,
introduciendo una reacción en cada uno de los carriles
tienes Gorda la semana
- Sabes que
el primer y la
sabes
porque

longitud aproximada .

- i

Cada banda corresponde a

un nucleótido (A, C, G o T)
Ar Az Az Ar Az
Ar
-

madre C padre G
-

(G)
ATAC ↳ CGTA

A T GC
2 bandas
f@ →

en la

misma

pasión
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
 SECUENCIACIÓN SANGER CON FLUORÓFOROS

• Los fluoróforos son moléculas multicíclicas que

absorben y emiten luz fluorescente a longitudes de
onda específicas
• Estas moléculas pueden unirse covalentemente a los
didesoxinucleótidos, marcando el extremo 3′

ddA

Cada colorante o “color” se ddT

utiliza para cada uno de los
cuatro ddNTP ddG

ddC
 SECUENCIACIÓN SANGER CON FLUORÓFOROS

1. Fragmento desconocido
5’ 3’
ddGTP
2. Secuencia conocida 3’ 5’

5’ 3’
3. Cebador ddATP
3’ 5’
4. dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, y dTTP) 5’ 3’
ddCTP

5. ddNTPs marcados don fluorescencia. 3’ 5’

Cada uno con un fluoróforo diferente 5’ 3’

ddTTP

3’ 5’
6. DNA polimerasa
Una única
reacción
 SECUENCIACIÓN SANGER CON FLUORÓFOROS

• Se obtiene un cromatograma tras la electroforesis capilar

+ llega antes

y
""

-
 SECUENCIACIÓN SANGER CON FLUORÓFOROS

• Secuenciación automática: Existe software para el análisis

de secuencias que proporcionan la secuencia analizada en
forma de texto y de electroferograma
Hasta 1000pts
1000 PRIMER p

[
-
1500
1000 PRIMER REUERSC

• El patrón de picos reflejan los cambios de la secuencia

"
T/T T/A"" °

PEQUEÑOS A/A
"
" ,

puf

{
5′ AGTCTG 5′ AG(T/A)CTG 5′ AGACTG
5.1. ¿Qué es la PCR?
5.2. Los tres pasos de la PCR
5.3. Diseño de primers
5.4. Variantes de la PCR
5.5. Secuenciación Sanger
5.6. Secuenciación Sanger con fluoróforos
5.7. Secuenciación de ultima generación
SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN (NGS)
SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN (NGS)

cromosomas

artificiales
SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN (NGS)
SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN (NGS)
SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN (NGS)
Tema 5. Tecnología del
ADN recombinante:
PCR y secuenciación