Biología Molecular ENCB, IPN

7QM3
e
kaneBit
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

in vitro (solo enzimas)

Reacción en cadena de la polimerasa: es una técnica que permite obtener rápidamente una
gran cantidad de copias de un fragmento específico de DNA. Consta de varios ciclos (25–45), y
cada ciclo tiene 3 etapas:
Separa DNAencadenas sencillas
• Desnaturalización (95ºC)
iniciadores
• Alineamiento de los iniciadores 1550) Pegan
Ciclo 3
• Polimerización, alargamiento o extensión (72ºC) Tag pol Temp. Optima
- se empiezan a obtener los fragmentos de interés, limitados por los iniciadores

Condiciones de reacción para una PCR convencional:

↳tandario

neutraliza carga
Si se estandarios y seprebar
dif. 2My] sin que aparezca
banda inespecifica
Cofactor Tay pul

Alta fidelidad

Arquea Otras arqueas

Termusetious Grum(
DNA polimerssadependiente DNA.I -> Pyrococcusturiosus
Pyrucocius i
woesi

I
Vida media qumin a 95%constante Thermus termophilos
Velocidad Thereus flars
3 1000
nucleitidos/ 72°
PCR depunto final
polimerizacich m in
inermococus litoralis
a

Termoestable
Direccick 5" - 3"
Programación del termociclador para una PCR convencional: Molde DWA
Iniciadores
y exonuclusa 5" - 3"

·
NO act.editura de
35

graescamesiere
E
0 95°
Dif. Temperatura entre base
y tapa
hace que no se evapor
Secute ahora poner aceite mineral a cada tubo

Clase del jueves 23 de marzo del 2023 1

 5"Cy(94AAT AG4TGCT
4(
Biología Molecular LOS ENCB, IPN

E
7QM3 Alinear iniciadores
Tm= 402((+C) 2°(A T)
+
+

3A
Ta Tm
=

-
50) 5T

Confirmar experimentalmente
im
40(((4) 2°(6)
=
+

Principales factores que afectan a la PCR: Tm 68° =

Ta 68° 50) 63°

=
=
-

Temp. fusich
Factor Efecto sobre la PCR T50% DNA

Alta. Penrgicinética esta enduble

Baja de Sepega pero en

otrus lados y
Las temperaturas de desnaturalización (95ºC) y de polimerización cudence y 50%
encadena sencilla.
(72ºC) son fijas.
bandas inespecíficas
genera

Temperaturas Mi inicida
·

sopegre
a La temperatura de alineamiento de los iniciadores se calcula como
Ta = Tm-5ºC, donde Tm =*
por
4ºC[G+C] + 2ºC[A+T]. Regla de Wallace
secuencia blanco
lemp. Sptimall
-
enlaces de puente cit

Iniciador Forward: se une sobre la cadena molde del DNA. 3- 5

codificante Tamano
11 111134
,TM fragment o
013 s Reverse ampliad 8
Iniciador Reverse: se une cobre la cadena codificadora del DNA. sitI
un

sitoria,
115 200 -

500bp
Molche
Iniciadores El tamaño de los iniciadores es de 20 a 25 nucleótidos.
Ambos iniciadores deben tener las mismas Tm, y unirse
solamente a la secuencia de interés en el genoma.
Longitudde producto:(Ultima posicion iniciador Reverse)- (Primera posicion del iniciador Forward) #A

Es un cofactor de la DNA polimerasa.

Concentración de Mg++ Una mayor concentración de Mg++ aumenta la eficiencia de la

PCR, pero puede favorecer la amplificación de fragmentos
1.8 mi
inespecíficos.
ubien
a Los cationes (K+) neutralizan la carga negativa de los grupos
Fuerza iónica
Sino, la cadena mulde; amás se va a poder fosfato del DNA, para permitir el alineamiento de los iniciadores.
acerchr

Aten"miento Disminuye la amplificación de productos inespecíficos y los

Hot start Tay pol 72°C
artefactos derivados de dímeros de iniciadores.

I
Dependen de la cantidad de DNA presente en la muestra original.
Número de ciclos de la
No se recomiendan más de 45 ciclos de reacción, debido a la
reacción
inactivación de la Taq polimerasa.
Tha. pol
↓ de 25 cidos limite int.
Hasta DrAse duplica
10ry actividad.
atividad
cido 30 el
si
I
si tienes Drt efectivamente
a 250( lo puedus visualizar en
gel Después de 30 es una meseta
de ↳> sedesnaturaliza
agarosa.
Scleurace un
Taq polimerasa
antiverpo que
bloquea su sitio -> 45ciclos máximo de Act. residual
activo y hasta
el ver ciclo empieza
I de 45cicks, paras reaccion y
a
trabajar
agregas + pol.
Tay
Trabajar siempre en
bielo para no
general
productos
chespecifices
Más información:
El
primer
dimerg" Premier Biosoft PCR Primer Design Guidelines
(http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)

Clase del jueves 23 de marzo del 2023 2

 -

lamaño iniciadores
Iniciador 8 nuclertidos

Sitiosmiincada 48 65,536bp =

voltearSuenciacione
*
Youbp. genam
ne n
a las companics

=>
49,000 sitrusen los que se puede pegar

Garanticar quesolo se
pegue
i vez.

⑧
↳ 17nucóticlos

4* 17,179,869,184bp.
=

Cmayor tamuno bp humano).

- ↳↳ I sitio mis en el
genoma
humano
Iniciadores.
Tamaro tipico -> 20 a 25 nuclertidos
· Famaño.20-25
nuclertidos
Concentracio final de cada
Contenido (C 40-60%

(Usualmentee
·

Iniciador
0.1-1.0pM
(hammeros che"s
·
No formar estructura 7o
entre si
· No complementarios
Desuntain
· Tienen misma Tm
(lungitud similar, composicion bases similar). GerirI tlarges,
· Sepegrensolo asemencia desende a
↑ paso alieamiento
estruct. 7 DNA.
Alinena una
regich del DrA que no farme en el

Puede
·

·
formar estructuras
SewadaNac

*
-Fiempo reall
Sistema Man Apired Systems
tay

Ivane en garradosue
-

SEB
3.
apagador

Emitflucescencia
en ↓ I
↳ wie captada pare
Aluorescente

*. ->
Ahoraen
qute
nuchutudes

Semeten todos los DNA de ↑ cavo por suespecificidad

duble cadena
ciclo
Fluorescensic Umbrat

Elcido umbral
inversamente
Du presente
con

en
(CT) conduciona
la cantidad
la mezcla de
de
~ ciclo
#

Log. (cuncentracich)
reasiol

↑ [PMAT - ciclo X

↓ [DNA] - ciclo