Universidad Autónoma Del Estado De México.

Facultad De Odontología.

Centro de Investigación y Estudios en

Odontología “Dr. Keisaburo Miyata”

“Efectos citotóxicos y antimicrobianos del

hidróxido de calcio, quitosano y gel de
carbopol como potencial medicamento
intraconducto”

Proyecto Terminal
para obtener el Diploma en la Especialidad en
Endodoncia.

Presenta:

C.D. Zaid Contreras Trejo.

Director:
E.E. Hugo E. García García.

Asesores:
Dr. en C.S. René García Contreras.
M. en EME Ignacio Jiménez Bueno.

Toluca, Estado De México, Junio 2020.

 Índice.

1.Introducción .......................................................................................................... 1
2. Marco Teórico. .................................................................................................... 3
2.1 Hidróxido de calcio como medicación intraconducto...................................... 4
2.2 Quitosano. ...................................................................................................... 5
2.2.1. Estructura y solubilidad. .......................................................................... 7
2.2.2. Propiedades del quitosano ..................................................................... 8
2.2.3. Aplicaciones. ........................................................................................... 9
2.3 Gel de carbopol. ........................................................................................... 10
3. Planteamiento del problema. ............................................................................. 12
4. Justificación. ...................................................................................................... 13
5. Hipótesis de investigación. ................................................................................ 14
6. Objetivos. .......................................................................................................... 15
7. Diseño de estudio. ............................................................................................. 16
8. Materiales y métodos. ....................................................................................... 17
8.1 Fase 1.- Síntesis de los compuestos : hidróxido de calcio-quitosano-gel de
carbopol (HQG), e hidróxido de calcio-quitosano (HQ). ..................................... 17
8.1.1. Materiales. ............................................................................................ 17
8.1.2. Preparación del gel de carbopol. ......................................................... 17
8.1.3. Preparación del compuesto hidróxido de calcio-quitosano (HQ). ......... 18
8.1.4. Preparación del hidróxido de calcio, quitosano y gel de carbopol. ....... 19
8.2. Fase 2.- Ensayo de citotoxicidad. ............................................................... 20
8.2.1. Población y universo de estudio. ........................................................ 20
8.2.2. Criterios de selección............................................................................ 20
8.2.3. Variables de estudio. ............................................................................ 21
8.2.4. Procedimiento. ...................................................................................... 22
8.3 Fase 3.- Ensayo antimicrobiano por difusión en agar. ................................. 26
8.3.1. Población y universo de estudio. .......................................................... 26
8.3.2. Criterios de selección............................................................................ 26
8.3.3. Variables de Estudio. ............................................................................ 26
8.3.4. Procedimiento. ...................................................................................... 28
 8.4. Consideraciones bioéticas. ......................................................................... 33
8.5. Análisis estadístico. ..................................................................................... 34
9. Resultados. ....................................................................................................... 35
9.1. Ensayo de citotoxicidad. ............................................................................. 35
9.2 Determinación de sensibilidad antimicrobiana por difusión. ......................... 38
10. Discusión. ........................................................................................................ 43
11. Conclusiones. .................................................................................................. 47
12. Anexos. ........................................................................................................... 48
Certificado de aprobación del comité de ética en investigación CIEAO. ............... 48
Bibliografía. ........................................................................................................... 49
 1.Introducción

La terapia endodóntica consiste en la extirpación quirúrgica de tejidos pulpares

dentro del sistema de conductos radiculares que originan patosis hacia los tejidos
perirradiculares. Esta se conoce como periodontitis apical primaria es el resultado
de una infección de origen endodóntico.1 El tratamiento para la periodontitis apical
es la remoción de las bacterias organizadas en biopelícula dentro del sistema de
conductos radiculares. Sin embargo, dado a la complejidad de este sistema de
conductos no es posible remover en su totalidad todas las bacterias. 2

Peters y colaboradores 3 mencionan que, independientemente de la técnica

empleada para ello, alrededor del 35 % se las superficies del conducto radicular
permanecen intactas después del trabajo biomecánico realizado con limas durante
el tratamiento endodóntico. Es por ello que las bacterias restantes dentro de los
túbulos dentinarios son inaccesibles para irrigantes como el hipoclorito de sodio o
la clorhexidina.

Las situaciones por las cuales se utiliza una medicación intraconducto incluyen: la
eliminación o reducción de microorganismos remanentes dentro del el sistema de
conductos, 4 inertizar el contenido de microorganismos, prevenir el dolor posterior
al tratamiento y curación de los tejidos perirradiculares, 5 siendo por lo normal una
colocación entre citas durante la terapia endodóntica. 6

La utilización del quitosano como medicamento intraconducto resulta atractivo, ya

que hoy en día juega un papel importante como biopolímero para la
fabricación y conjugación con otros materiales esto debido a sus propiedades de
biodegrabilidad, biocompatibilidad y en este caso en específico, de actividad
antimicrobiana. 7,8

Este biopolímero se caracteriza por poseer actividad contra una amplia variedad de
hongos y bacterias. 9,10

El quitosano también activa varios procesos de defensa en el tejido del huésped,

actúa como un agente de unión al agua e inhibe varias enzimas. La unión del

1
quitosano con el ADN y la inhibición de la síntesis de ARNm se produce a través de
la penetración del quitosano hacia los núcleos de los microorganismos y la
interferencia con la síntesis de ARNm y proteínas. 11

El objetivo de este estudio es, determinar la viabilidad celular y el efecto

antimicrobiano de un medicamento experimental a base de hidróxido de calcio-
quitosano-gel de carbopol como potencial medicación intraconducto, realizando
ensayos de citoxicidad sobre células de fibroblastos gingivales humanos y
macrófagos de ratón además de un ensayo de difusión en agar para evaluar los
efectos antimicrobianos en E. faecalis, S. aureus y C. albicans.

2
 2. Marco Teórico.

Es importante señalar que los medicamentos intraconducto son un paso esencial

para eliminar bacterias remanentes, e inhibir la invasión coronal de bacterias desde
la cavidad oral hacia dentro del sistema de conductos radiculares.
Sus orígenes históricos se remontan a compuestos fenólicos, que incluyen eugenol
(que puede clasificarse diferencialmente como un aceite esencial), paraclorofenol,
paraclorofenol alcanforado, monoparaclorofenol alcanforado, cresatina
(metacresilacetato), cresol, timol y creosota, son medicamentos con una larga
historia en el campo dental que comienza en el siglo XIX. 4

Muchas combinaciones de estos medicamentos se prepararon y jugaron un papel

importante en el tratamiento del conducto radicular desde el siglo XIX hasta el siglo
XX.

Hasta hace algunos años el formocresol, se usaba con frecuencia como

medicamento intraconducto, y Buckley 12 en 1904 se refiere a él, como un
medicamente intraconducto eficaz. En la actualidad se ha demostrado que el
formocresol exhibe una alta citotoxicidad, 13,14 teratogenicidad 15 y tumorigenicidad
16 así como inducir reacciones inmunes. 17

Aunque los haluros, incluidos el hipoclorito de sodio y el yodo, el gluconato de

clorhexidina, los esteroides y los medicamentos antiinflamatorios no esteroideos
(AINE) se han informado como medicamentos intraconductos, ninguno de ellos
ocupa una posición principal en la actualidad. 18

Se han utilizado antibióticos como medicación intraconducto pero estos son

transportados hacia el foramen apical, induciendo del desarrollo de resistencia a
antibióticos, sustitución microbiana y alergias. 19

El hidróxido de calcio se ha utilizado como componente de apósito para la pulpa,

pulpotomías, pulpectomías y rellenos de conductos radiculares, pero su estudio se
describe mas a detalle en el siguiente apartado.

3
2.1 Hidróxido de calcio como medicación intraconducto.

Desde su introducción en el año de 1920, el hidróxido de calcio ha sido utilizado

ampliamente en el campo de la endodoncia. Es una substancia sumamente alcalina
con un pH de aproximadamente 12.5, capaz de destruir la mayoría de
microorganismos. 20

Hasta hoy en día el hidróxido de calcio es una substancia que bajo todas estas
propiedades es muy utilizada como medicación intraconducto durante los
procedimientos endodónticos.

El hidróxido de calcio tiene una disociación en medios acuosos a iones hidroxilo y

dichos iones hidroxilo le conceden a este material propiedades antimicrobianas,
inhibición de resorción radicular, remoción de tejidos e induce la formación de una
barrera de protección cuando la pulpa dental se encuentra involucrada. 20

La mayoría de los microorganismos endopatógenos organizados en biopelículas (el

cual es uno de los procesos de adaptación que permiten que las bacterias
sobrevivan en un entorno carente de nutrientes) dentro del sistema de conductos
radiculares son incapaces de sobrevivir en un medio altamente alcalino
proporcionado por los iones hidroxilo del hidróxido de calcio, son eliminados en
cortos periodos de tiempo cuando entran en contacto directo con esta substancia.
20

Siqueira & Lopes 21 describen mecanismos por los cuales el hidróxido de calcio en
específico los iones hidroxilo, afectan a las células bacterianas:

- Daño a la membrana citoplasmática de la bacteria: Los iones hidroxilo

inducen la peroxidación lipídica, lo que resulta en la destrucción de los
fosfolípidos, componentes estructurales de la membrana celular. Los
iones hidroxilo eliminan los átomos de hidrógeno de los ácidos grasos
insaturados, generando un radical lipídico libre. Este radical lipídico libre
reacciona con el oxígeno, dando como resultado la formación de un
radical peróxido lipídico, que elimina otro átomo de hidrógeno de un

4
 segundo ácido graso, generando otro peróxido lipídico. Por lo tanto, los
propios peróxidos actúan como radicales libres, iniciando una reacción en
cadena autocatalítica y resultando en una pérdida adicional de ácidos
grasos insaturados y un extenso daño a la membrana.

- Desnaturalización de proteínas: La alcalinización proporcionada por el

hidróxido de calcio induce la descomposición de los enlaces iónicos que
mantienen la estructura terciaria de las proteínas. Como consecuencia, la
enzima mantiene su estructura covalente pero la cadena polipeptídica se
desenreda aleatoriamente en una conformación espacial variable e
irregular. Estos cambios con frecuencia dan como resultado la pérdida de
la actividad biológica de la enzima y la interrupción del metabolismo
celular además de que los iones hidroxilo dañan las proteínas.

- Daño al ADN: Los iones hidroxilo reaccionan con el ADN bacteriano e

inducen la división de las cadenas la replicación del ADN se inhibe y la
actividad celular se desorganiza.
Como se menciona el hidróxido de calcio tiene efectos letales sobre las
células bacterianas, pero estos efectos solo son observables cuando la
substancia se encuentra en contacto directo con la bacteria, es esta
condición, la concentración de iones hidroxilo es muy alta alcanzando
niveles incompatibles para la supervivencia de las bacterias.

Sin lugar a dudas el hidróxido de calcio es un excelente material reactivo ya que

está indicado para varias infecciones clínicas en endodoncia por su actividad
antimicrobiana, desinfección de los conductos radiculares, la versatilidad con varios
vehículos y su acción como barrera física.

2.2 Quitosano.

La quitina, es un polisacárido natural de gran importancia, fue identificado por

primera vez en 1884. Este biopolímero es sintetizado por una enorme cantidad de

5
organismos vivos; y considerando la cantidad de quitina producida anualmente en
el mundo, es el polímero más abundante después de la celulosa. La quitina se
encuentra en la naturaleza como microfibrillas cristalinas ordenadas que forman
componentes estructurales en el exoesqueleto de artrópodos o en las paredes
celulares de hongos y levaduras; hasta ahora las principales fuentes comerciales
de quitina han sido los caparazones de cangrejos y camarones.
La quitina se extrae de los crustáceos mediante un tratamiento ácido para disolver
el carbonato de calcio seguido de una extracción alcalina para solubilizar las
proteínas, además, a menudo se agrega una etapa de decoloración para eliminar
los pigmentos sobrantes y obtener un producto incoloro; estos tratamientos deben
adaptarse a cada fuente de quitina, debido a las diferencias en la ultra estructura de
los materiales iniciales, la quitina resultante debe clasificarse en términos de pureza
y color, ya que pigmentos residuales pueden causar problemas para su utilización,
especialmente para productos biomédicos. 22

Por desacetilación parcial de la quitina en condiciones alcalinas, se obtiene el

quitosano, que es el derivado de quitina más importante en términos de
aplicaciones. El quitosano es de interés comercial debido a su alto porcentaje de
nitrógeno (6.89 %) esto hace que sea un agente quelante útil. 23

Como la mayoría de los polímeros actuales son materiales sintéticos, su

biocompatibilidad y biodegradabilidad son mucho más limitadas que las de
polímeros naturales tales como celulosa, quitina, quitosano y sus derivados. Sin
embargo, estos materiales naturalmente abundantes también presentan una
limitación en su reactividad y procesabilidad. A este respecto, se recomiendan la
quitina y el quitosano como materiales funcionales adecuados, ya que estos
polímeros naturales tienen excelentes propiedades tales como biocompatibilidad,
biodegradabilidad, no toxicidad, propiedades de adsorción, presenta demasiados
grupos amino reactivo que ofrecen posibilidades en cuanto a modificaciones
químicas, 24 mostrando así, interés de aprovechamiento en campos como, la
farmacéutica, alimentos, cosméticos y aplicaciones biomédicas.

6
2.2.1. Estructura y solubilidad.

Cuando el grado de desacetilación de la quitina alcanza aproximadamente el 50%

(dependiendo del origen del polímero), se vuelve soluble en ácidos acuosos medios
y se llama quitosano; al ser soluble en soluciones acuosas, es ampliamente utilizado
en diferentes aplicaciones como soluciones, geles, o películas y fibras.

En estado sólido, el quitosano es un polímero semicristalino. La geometría de la

molécula de quitosano y, en particular, su conformación y el entorno de su grupo
amino son de gran interés en la comprensión de las propiedades específicas de este
biopolímero. Las principales investigaciones de quitosano se refieren a su
preparación con pesos moleculares variados y grado de desacetilación de la quitina;
la dependencia de sus propiedades de solución en el grado de desacetilación, la
preparación de derivados y aplicaciones. Esponjas, polvos y fibras pueden ser
obtenidos por regeneración de quitosano o sus derivados a partir de soluciones. 22,25

Las propiedades de solución del quitosano dependen no solo de su grado de

desacetilación, sino también de la distribución de los grupos acetilo a lo largo de la
cadena principal, además del peso molecular. La desacetilación, generalmente
realizada en estado sólido, da una estructura irregular debido al carácter
semicristalino del polímero inicial. El quitosano es soluble por debajo de un pH de
6, de hecho la solubilidad es un parámetro muy difícil de controlar: se relaciona con
el grado de desacetilación, la concentración iónica, el pH, la naturaleza del ácido
utilizado para la protonación y la distribución de los grupos acetilo a lo largo de la
cadena, así como la condiciones de aislamiento y secado del polisacárido. 22

7
2.2.2. Propiedades del quitosano.

Dentro de las propiedades químicas del quitosano podemos mencionar que posee
grupos amino reactivos, disponibilidad de grupos reactivos hidroxilo, la quelación de
muchos iones metales de transición. 23
Como propiedades biológicas podemos describir que es biocompatible ya que es
un polímero natural, biodegradable, seguro y no tóxico, se une agresivamente a
células de mamíferos y microbios, goza de un efecto regenerador en tejidos, induce
la formación de osteoblastos responsables de la formación de hueso, es
hemostático, fungistático, espermicida, antitumoral, anticolesterolemico, acelerador
de la formación de hueso, depresor del sistema nervioso central e
inmunoadyuvante. 26
La mayoría de los polisacáridos naturales, por ejemplo, celulosa, dextrina, pectina,
ácido algínico, agar, agarosa y carragenatos son de naturaleza ácida, mientras que
la quitina y el quitosano son ejemplos de polisacáridos altamente básicos. Sus
propiedades incluyen la solubilidad en diversos medios, la solución, la viscosidad,
el comportamiento de los poli electrólitos, la formación de polioxialquilo, capacidad
para formar películas, quelación de metales, características ópticas y estructurales.
26

A pesar de que la quitina es altamente hidrofóbica, es insoluble en agua y en la

mayoría de los solventes orgánicos, el quitosano, desacetilado producto de quitina,
es soluble en ácidos diluidos tales como ácido acético, ácido fórmico, etc.
Recientemente, se ha informado sobre la capacidad de formación de gel de
quitosano en N-óxido de N-metilmorfolina y su aplicación en formulaciones de
liberación controlada de fármacos. 27

A temperatura ambiente, el quitosano forma aldiminas y cetiminas con aldehídos y

cetonas, respectivamente. La reacción con cetoácidos seguida de reacción con
borohidruro sódico produce glucanos que llevan grupos amino proteico y no
proteico. Los derivados de quitosano se obtienen fácilmente bajo condiciones
suaves y se pueden considerar como sustituidos glucanos. 28

8
El contenido de nitrógeno de la quitina varía de 5 a 8% dependiendo del grado de
desacetilación, mientras que el nitrógeno en el quitosano se encuentra
principalmente en forma de grupos amino alifáticos primarios, por lo tanto, sufre
reacciones típicas de aminas. A temperatura ambiente, el quitosano forma aldiminas
y cetiminas con aldehídos y cetonas. 28

2.2.3. Aplicaciones.

En general, las principales aplicaciones del quitosano se pueden observar en el

ramo de la agricultura implementadas al mecanismo defensivo de las plantas, la
estimulación al crecimiento, recubrimiento de semillas contra heladas, tiempo de
liberación de fertilizantes y nutrientes; en el área de tratamiento de agua, como
fluctuante para producir un aclaramiento, para la eliminación de iones metálicos,
como polímero ecológico así como reducir olores; en el ramo alimenticio como
revestidor antibacteriano y fungistático para fruta; en productos cosméticos es útil
para mantener la humedad de la piel, tratamientos de acné, mejoramiento de la
flexibilidad del cabello, pastas dentales; farmacéuticamente como hemostático y
anticoagulante, agente bacteriostático, inmunológico y antitumoral. 29

Sin embargo para este estudio es importante destacar las aplicaciones biomédicas
que a continuación se mencionan.

Se ha sugerido que el quitosano puede usarse para inhibir la fibroplasia en la

cicatrización de heridas y para promover el crecimiento y la diferenciación tisular en
el cultivo de tejidos. 27

La escasa solubilidad de la quitina es el principal factor limitante en su utilización a

pesar de esta limitación, se han informado diversas aplicaciones como materia
prima para fibras artificiales que son útiles como suturas absorbibles y vendajes. 26

El quitosano posee varias propiedades biológicas tales como la no toxicidad,

biodegradación rápida, promoción de la célula, proliferación u osteoinducción, que
lo hacen un gran candidato para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo. 30

9
En un estudio Agata Przekora y colaboradores, 31 realizan compuestos de quitosano
con fosfato de calcio, demostrando que los compuestos obtenidos no son tóxicos,
son biocompatibles, de favorable adhesión y crecimiento celular, induciendo así la
diferenciación de osteoblastos, utilizándolo como sustituto de hueso ya que posee
propiedades mecánicas similares al del hueso trabecular; el quitosano también
promueve el crecimiento de osteoblastos y la formación ósea in vivo debido a la
existencia de grupos amino e hidroxilo reactivos.

El crecimiento de Escherichia coli se inhibió en presencia de más del 0.025% de

quitosano. El quitosano también inhibió el crecimiento de Fusarium alternaria y
Helminthosporium. Los grupos amino catiónicos de quitosano probablemente se
unen a grupos aniónicos de estos microorganismos, lo que resulta en la inhibición
del crecimiento. 32

Igualmente tiene actividad antimicrobiana contra bacterias gram-positivas y gram

negativas. 33

2.3 Gel de carbopol.

El carbopol, es un polímero de alto peso molecular de ácido acrílico, se usan

principalmente en formulaciones farmacéuticas líquidas o semisólidas, como geles,
suspensiones y emulsiones, como agente espesante y de viscosidad, para modificar
las características del flujo. 34

Se pueden utilizar también por sus propiedades mucoadhesivas, 35 siendo un

agente bioadhesivo (cualquier tipo de fenómeno de adhesión en el que una o más
de las fases involucradas, ya sea sustrato o adhesivo, sean parte de un organismo
vivo) 34, entre sus aplicaciones incluyen formulaciones oftálmicas, rectales, nasales
intestinales, tópicas, dentales entre otras. 36

El gel de carbopol se prepara mediante las dispersión del polímero en agua, el cual
ya mezclados se puede ver una hinchamiento hasta de 1000 veces de su volumen
orignal, permite la ionización de grupos carboxílicos, y como consecuencia, se forma
un gel fuerte.

10
El análisis reológico de este polímero de hidrogel es importante, especialmente en
las aplicaciones farmacéuticas, ya que su rendimiento mucoadhesivo está
estrechamente relacionado con las propiedades reológicas. 37

Las propiedades reológicas de los geles carbopol, se investigan ampliamente y se

sabe que este polímero forma dispersión y muestra propiedades viscoelásticas. 38

La alta viscosidad solo puede disminuir la velocidad de sedimentación, y el valor de

la tensión de fluencia es el factor predominante para proporcionar una suspensión
permanente. 39

La trietanolamina es el agente neutralizante que nos brinda el grado de viscosidad

de el gel de carbopol. 40

Cabe mencionar que cuando se debe agregar un medicamento insoluble en agua a

este gel, solo se puede dispersar y no se puede obtener un gel acuoso transparente.
Sin embargo, en algunos casos, los fármacos insolubles en agua son solubles en
cosolventes miscibles en agua hidrófilos, por ejemplo en propilenglicol y glicerina 41

considerándose materiales no tóxicos y no irritantes.

La posibilidad de obtener geles a partir de estos disolventes hidrofílicos, utilizando

un polímero como agente espesante, debe tomarse seriamente en cuenta para
hacer posible la adición de estos fármacos insolubles en agua. Además, un
medicamento disuelto en la fase líquida del gel bajo una forma no ionizada puede
potencialmente penetrar más en una barrera como la piel o cierta mucosa; para este
estudio se realizará la el uso de propilenglicol como cosolvente. 36

11
 3. Planteamiento del problema.

La caries dental como entidad patológica es la principal causa de inflamación e

infección pulpar; es un proceso dinámico que depende de microorganismos
invasores que, una ves sobrepasando la respuesta inmunitaria, el complejo dentino-
pulpar no será capaz de sanar por si mismo lo cual requerirá tratamiento de
conductos como terapia ante esta agresión. Durante la terapia endodóntica, entre
citas esta indicada la medicación intraconducto con el objetivo de eliminar bacterias
remanentes durante la instrumentación biomecánica. En la actualidad existen
numerosas sustancias que cumplen la función como material dental para su uso
como medicación intraconducto, entre estas sustancias, podemos encontrar las
derivadas de compuestos fenólicos (eugenol, paramonoclorfenol alcanforado,
cresol), de aldehídos (formaldehido, glutaraldehido), antibióticos (pasta antibiótica,
MTAD) y otros como los basados en esteroides, clorhexidina y derivados del
cemento Portland; sin embargo en la actualidad el estándar de oro sigue siendo el
hidróxido de calcio, pero pocos han sido los estudios que complementan este
material con polímeros para obtener mejores resultados.

Por ello, es importante conocer las características de cada uno de los componentes,
además del alcance de cada uno de ellos para asociación de este nuevo material
dental y los beneficios que tendrá la incorporación de estas nuevas sustancias como
material dental de medicación intraconducto.

De acuerdo con lo anterior surge las siguiente pregunta de investigación:

¿Qué efecto tiene la incorporación de quitosano, gel de carbopol al hidróxido de

calcio en la viabilidad celular y la actividad antimicrobiana para uso como
medicamento intraconducto?.

12
 4. Justificación.

La prevalencia en la tasa de fracasos en tratamientos endodónticos se debe

principalmente a que existen microorganismos persistentes en el sistema de
conductos radiculares. Hoy en día existen pocos estudios que evalúen la eficacia
del hidróxido de calcio con otras substancias. Hasta ahora, no existen estudios que
evalúen los efectos citotóxicos del hidroxido de calcio adicionado con quitosano y
gel de carbopol en células de Macrófagos de Raton y Fibroblastos Gingivales
Humanos.

Ademas, actualmente no se encuentran estudios que evalúen la eficacia

antimicrobiana del hidroxido de calcio adicionado con quitosano y gel de carbopol
en E. faecalis, S. aureus y Candida albicans.

Hoy en día, no existe un material específico con los materiales que deseamos
incorporar y es necesario crear uno, lo cual lo hace innovador al acoplar el hidróxido
de calcio con polímeros. Contar con una medicación intraconducto capaz de reducir
los microorganismos mas frecuentes en la microbiota endodóntica presentando una
adecuada viabilidad celular, podrá contribuir a la mejora de los tratamiento de
conductos.

Un mejor pronóstico en el tatamiento de conductos conllevará una disminución en

la pérdida de órganos dentales en la población.

13
 5. Hipótesis de investigación.

H0 .- La incorporación de un complejo de hidróxido de calcio-quitosano-gel de

carbopol no tendrá efecto significativo en la viablidad celular y el efecto
antimicrobiano para ser utilizado como medicamento intraconducto.

H1 .- La incorporación de un complejo de hidróxido de calcio-quitosano-gel de

carbopol tendrá un efecto significativo en la viablidad celular y el efecto
antimicrobiano para ser utilizado como medicamento intraconducto.

14
 6. Objetivos.

6.1.- Objetivo General:

❖ Determinar la viabilidad celular y el efecto antimicrobiano de un medicamento

experimental a base de hidróxido de calcio-quitosano-gel de carbopol para
su uso como medicamento intraconducto.

6.2.- Objetivos Específicos:

❖ Sintetizar el compuesto hidróxido de calcio-quitosano (HQ) e incorporar al

complejo HQ un gel experimental a base de carbopol (HQC).
❖ Determinar la viabilidad celular en cultivos primarios de macrófagos de ratón
(RAW) y fibroblastos gingivales humanos (HGF) a través de un ensayo de
proliferación celular.
❖ Determinar el efecto antimicrobiano de ambas síntesis a través de ensayos
de sensibilidad antimicrobiana por difusión en agar sobre E. faecalis, S.
aureus y C. albicans.

15
 7. Diseño de estudio.

Este estudio es un tipo de investigación experimental in vitro, prospectivo y

comparativo.

Este estudio se realizó en el Laboratorio de Investigación Interdiciplinaria en el Área

de Nanoestructuras y Biomateriales de la Escuela Nacional de Estudios Superiores
(ENES)-Unidad León de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

16
 8. Materiales y métodos.

8.1 Fase 1.- Síntesis de los compuestos : hidróxido de calcio-quitosano-gel de

carbopol (HQG), e hidróxido de calcio-quitosano (HQ).

8.1.1. Materiales.

El quitosano de alto peso molecular (50 g) y el ácido acético (500 mL) fueron
adquiridos de Sigma-Aldrich y usados sin posterior purificación. Por otro lado el
hidróxido de calcio químicamente puro de Viarden (500 g), carbopol 940 (200 gr),
propilenglicol (100 g) y Trietalonamina (140g) fueron adquiridos de NeoKem Lab.

8.1.2. Preparación del gel de carbopol.

Para la preparación del gel de carbopol en un matraz de vidrio de 100 mL se

agregaron 400 mg de carbopol, 15 mL de agua destilada y 0.225 mL de
propilenglicol (Figura1). La mezcla resultante se agito por un periodo de 5 horas a
temperatura ambiente en una agitadora magnética (Cimarec Barnstead Termolyne,
Dubuque, Iowa, U.S.A.) a 1500 rpm. La mezcla se realizó en una ambiente con
humedad controlada y con el matraz bien sellado para evitar la evaporación del
agua. Pasado este tiempo el pH de la mezcla fue neutralizado agregando
trietanolamina hasta alcanzar un pH de 7 y obtener un gel estable. 39

17
 Figura 1. Síntesis del gel de carbopol.

8.1.3. Preparación del compuesto hidróxido de calcio-quitosano (HQ).

Inicialmente en un vaso de precipitados de 50 mL se añadieron 24.5 mL de agua y

0.5 g de hidróxido de calcio químicamente puro (CaOH), se mezclaron a una
agitación constante en un agitador magnético (IKA C MAG HS 7, Wilmington, NC,
USA) a 1000 rpm. A continuación se incorporó lentamente 0.5 g de quitosano de
bajo peso molecular (Sigma-Aldrich). A esta mezcla se añadió 0.5 mL de ácido
acético 1% v/v, dejando todo el sistema en agitación por un periodo de 24 horas en
una campana especial para ácidos (Figura 2).

18
 Figura 2. Síntesis del complejo CaOH-Quitosano (HQ).

8.1.4. Preparación del hidróxido de calcio, quitosano y gel de carbopol.

En un vaso de precipitados de 100 mL se colocaron 5 gr de gel de carbopol y 0.5

gr. Del complejo de HQ (proporción 9:1) Los materiales fueron mezclados durante
3 horas utilizando un agitador magnético (IKA C MAG HS 7, Wilmington, NC, USA)
a 1500 rpm (Figura 3).

Figura 3. Incorporación del complejo HQ en el gel de carbopol.

19
Para fines de comparación se utilizó el complejo HQ como grupo control (Figura 4).

Figura 4.- Grupos de comparación

8.2. Fase 2.- Ensayo de citotoxicidad.

8.2.1. Población y universo de estudio.

Universo de Estudio: Número de células cultivadas y establecidas.

Muestreo: Probabilística.

Método de Muestreo: Aleatorio Simple

Tamaño: Casettes de 96 pocillos a densidades de 4x105 células/mL. Los ensayos

se realizarán por triplicado a tres experimentos independientes.

8.2.2. Criterios de selección.

La selección de casetes con pocillos con contenido celular se llevó tomando en

cuenta las siguientes características:

Inclusión: Casettes de 96 pocillos a densidades de 4x105 células/mL.

Exclusión: Casettes de 96 pocillos que presentarán defectos de fabricación.

Eliminación: Cassetes de 96 pocillos con perdida de contenido durante su

manipulación, además de contaminación de dichos pocillos con otras células o
substancias.

20
8.2.3. Variables de estudio.

8.2.3.1 Variables Dependientes.

Variable Definición Definición Tipo de Escala de

Conceptual Operacional Variable Medición
Citotoxicidad Daño celular Se emplearán Cuantitativa De Razón
provocado po la líneas Continua 0-n cel (%).
accionde celulares de
anticuerpos Macrófagos
específicos y de Ratón
complemento o (RAW) y
por células Fibroblastos
citotóxicas. Gingivales
Humanos
(HGF) en
contacto con
las síntesis de
HQC Y HQ.
Se utilizará un
ensayo de
MTT para el
análisis de
viabilidad
celular.

21
8.2.3.2. Variables Independientes.

Variable Definición Definición Tipo de Escala de

Conceptual Operacional Variable Medicion.
Dilución Reducción de la Se realizarán Cuantitativa De Razón /
concentración de diluciones del mL.
una sustancia 0-100% de las
química en una sintesis de
disolución HQC Y HQ en
contacto con
RAW Y HGF.
Tiempo de Incremento del Rango Cuantitativa De Razón 0-
proliferación número de temporal a Discreta n horas de
celular células por partir de la incubación.
división celular incubación
cuantificadas por con las
medio del conteo síntesis de
celular con HQC Y HQ, a
hematocitometro. las 24 horas.

8.2.4. Procedimiento.

Se cultivaron por 72 horas macrófagos de ratón (RAW) y fibroblastos gingivales

humanos (HGF), los cuales fueron incubados a 37°C con una humedad de 95% y
5% CO2 (Binder, Tuttlingen Alemania) en placas de 96 pocillos (100 μL) utilizando
un medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)
suplementado con estreptomicina y penicilina al 1%, 10% suero fetal bovino y 1%
de Glutamax.

22
 Figura 5. Formulación de las soluciones para el ensayo de viabilidad celular.

Para el ensayo de citotoxicidad, 0.05 g de cada uno de los materiales

experimentales fue mezclado con 100 μL de medio de cultivo dentro de un tupo
Eppendorf® y agitado vigorosamente con la ayuda de un vórtex (Daigger, Illinois,
USA) durante 20 segundos (Figura 5). Esta solución fue entonces diluída al 50%,
25%, 12.5%, 6,.25%, 3.12%, 1.56%, y 0.78%, y luego, cada una de las diluciones
fue transferida a las placas con las células precultivadas (Figura 6). El medio de
cultivo sin muestra se usó como control negativo. Las placas fueron incubadas a
37°C por 24 horas con una humedad de 95% y 5% CO2.

23
 Figura 6. Casette de 96 pocillos mostrando la distribución de las síntesis, tipo de
células y la dilución para en ensayo de citotoxicidad.

Pasadas las 24 horas horas se eliminó el medio de cultivo en todos los pocillos, se
colocaron por cada pocillo 100 μL de MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)-2,5-
Diphenyltetrazolium Bromide) y se incubó a 37°C por 7 horas en condiciones de
cultivo estándar 42 (Figura 7).

Figura 7.- Incubadora Binder exclusiva para células.

24
Pasadas 7 horas se aspiró el MTT y se colocaron 100 μL de dimetilsulfoxido DMSO
para cada pocillo. La absorbancia se determinó por medio de un espectofotómetro
Multiscan Go (Thermo Scientific, Massachusetts, USA; Figura 8) a una lectura a 570
nm de longtitud de onda, los datos se obtuvieron por triplicado.

Figura 8.- Espectofotómetro ThermoScientific.

Para complementar el ensayo se realizó un reconocimiento de células vivas por una

prueba de MTT observándolas al microscopio (Figura 9), para evaluar de manera
cualitativa el número de células para cada tipo de compuesto en diferente tipo de
célula (RAW/HGF).

Figura 9. Microscopio Leica.

25
8.3 Fase 3.- Ensayo antimicrobiano por difusión en agar.

8.3.1. Población y universo de estudio.

Universo de Estudio: Cepa de E. faecalis, S. aureus y C. albicans.

Población: E. faecalis, S. aureus y C. albicans tomando de 3-5 colonias a una escala

McFarland de 0.5.

Muestreo: Discrecional

Método de Muestreo: Aleatorio Simple

Tamaño: 100 μL por cada microorganismo.

8.3.2. Criterios de selección.

Inclusión: Cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans.
Exclusión: Cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans contaminadas.

Eliminación:

- Cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans contaminadas durante la

manipulación.

- Cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans mal sembradas.

- Cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans no crecidas.

8.3.3. Variables de Estudio.

8.3.3.1. Variable Dependiente.

Variable Definición Definición Tipo de Escala de

Conceptual Operacional Variable Medición.
Efecto Resultado en el Efecto Cuantitativa De Razones.
Antimicrobiano cual a bajas inhibitorio del continua. milímetros.
concentraciones crecimiento
cierta substancia de las células
actúa contra los bacterianas

26
 microorganismos de E. faecalis,
destruyéndolos o S. aureus y C.
inhibiendo su albicans
crecimiento 43. durante 24
horas.

8.3.3.2 Variables Independientes.

Variable Definición Definición Tipo de Escala de

Conceptual Operacional Variable Medición.
Medio de Técnica de Se utilizaron Cualitativa / 1.- MHB
cultivo laboratorio que para bacterias Nominal 2.- RPMI
consta de un gel o como medio Dicotómica
una solución que de cultivo
contiene los Muller Hinton
nutrientes Broth (MHB);
necesarios para y para
permitir, en levaduras
condiciones Roswell Park
favorables de pH Memorial
y temperatura, el Institute
crecimiento de Medium
microorganismos (RPMI).
y células.
Medicación Substancia la Medicación Cualitativa/ 1.- HQC
Intraconducto cual mantiene la de Hidróxido Nominal 2.- HQ
desinfección del de Calcio- Dicotómica.
conducto Quitosano-
radicular después Gel de
de la Carbopol
instrumentación y (HQC).
antes de la

27
 obturación, Medicación
incrementando de Hidroxido
significativamente de Calcio y
las posibilidades Quitosano.
de éxito de un
tratamiento de
conductos 6.
Dilución Es la reducción Se utilizó con Cuantitativa/ 1.- 50%.
de la base en el Nominal 2.- 25%.
concentración de porcentaje de 3.- 12.5%.
una sustancia reducción de
química en una concentración
disolución y de cada
consiste en síntesis de
rebajar la medicación
cantidad de intraconducto
soluto por unidad de HQC Y
de volumen de HQ.
disolución.

8.3.4. Procedimiento.

Metodología para cultivo joven.

Las cepas de E. faecalis, S. aureus y C. albicans fueron cultivadas por 72 horas. El

inóculo fue preparado disolviendo de 3 a 5 colonias en 5 mL de solución salina
estéril al 85%, hasta obtener una escala McFarland de 0.5 (Figura 10).

28
 Figura 10. Ajuste del estándar de turbidez de McFarland.

Para el ensayo se utilizaron cajas de Petri de agar (para el caso de las bacterias) o
agar-dextrosa (para el caso de las levaduras). un hisopo estéril con 100 μL de
suspensión microbiana fue utilizado para inocular en la superficie de cada una de
las placas.

De los tres diferentes tipos de microorganismos, se realizaron 3 discos para cada

una de ellas por cada material, Hidróxido de Calcio-Quitosano-Gel de Carbopol
(HQC) y Hidróxido de Calcio-Quitosano (HQ); y 3 de control, los controles
consistirán en una desfragmentación del material que se ocupará para la integración
del material, analizando los reactivos de manera individual (Figura 11).

29
 Figura 11 .- Dispensación de los discos por bacterias y levaduras. Dispensación
de los controles donde G=Gel de Carbopol, AA= Ácido Acético,
Q=Quitosano,H=Hidróxido de Calcio, MHB= Muller Hinton Broth, RPMI= Roswell
Park Memorial Institute Medium.

Diluciones.

Se determinó la concentración que se utilizó para el ensayo de citotoxicidad en

células la cual fue 0.05 g / 1000μL (MHB/RPMI) y se incremento 8 veces, la cual
para dicho ensayo se ajustó a 0.4 g /8000 μL (100%). Se realizaron las diluciones
al 50 % y 25% respectivamente de la siguiente manera: en tubos falcón de 15 mL
se colocaron 0.4 g de ambos compuestos (HQ/HQC) previamente pesados en una
balanza de precisión (Denver Instruments, Bohemia, NY U.S.A.) ; a continuación en
caso de las bacterias, se colocaron 4 mL del medio de cultivo Muller Hinton Broth
(MHB) como diluyente; para las levaduras, 4 mL de Roswell Park Memorial Institute
Medium (RPMI) Figura 12.

30
 Figura 12.- Diluciones para ambas síntesis.

Para obtener efectos con mayor similitud al hidróxido de calcio, tanto el compuesto
HQ y HQC se colocaron 100 μL en discos de papel estéril sin dilución, en contacto
directo con los cultivos bacterianos.

Inoculación de las Placas.

Se inocularon en cajas de Petri sin dejar una zonas libres, deslizando un hisopo
estéril por la superficie, rotando la placa 60° cada vez y pasándola por ultimo en la
periferia de las cajas Petri, para conseguir una siembra uniforme, dejando absorber
durante 5 min antes de la colocación de los discos. La distribución de las cajas se
realizó de la siguiente manera:

S. Aureus Hidróxido de Calcio-Quitosano-Gel de Carbopol 3 cajas Petri

Hidróxido de Calcio-Quitosano 3 cajas Petri

E. Faecalis Hidróxido de Calcio-Quitosano-Gel de Carbopol 3 cajas Petri

Hidróxido de Calcio-Quitosano 3 cajas Petri

31
C. Albicans Hidróxido de Calcio-Quitosano-Gel de Carbopol 3 cajas Petri

Hidróxido de Calcio-Quitosano 3 cajas Petri

Controles Bacterias 3 cajas Petri

Controles Levaduras 3 cajas Petri

Dispensación de los discos.

En discos de papel estériles, se colocaron 100 μL de cada compuesto (HQ/HQC) al

100% y en disoluciones al 50% y 25%; además de dichos materiales en contacto
directo por cada disco.

Con unas pinzas estériles se colocaron manualmente dentro de las cajas de Petri
contactando perfectamente con la superficie de agar/dextrosa, se situaron a más de
15 mm del borde de la caja. Se incubaron las placas invertidas a 37°C en un
transcurso de 24 horas (Figura 13).

Figura 13 .- Distribución de los discos de papel.

32
8.4. Consideraciones bioéticas.

La presente investigación contemplará los principios éticos para las investigaciones

médicas en seres humanos de la declaración de Helsinki de la Asociación Médica
Mundial (64ª Asamblea General de Octubre del 2013); en el articulo 7° de este
documento se establece que “ la investigación médica esta sujeta a normas éticas
que sirven para promover y asegurar el respeto a todos los seres humanos y para
proteger su salud y sus derechos individuales”.

Además, en todo momento se cuidara la integridad de los investigadores

implementando las medidas de seguridad establecidas en el Laboratorio de
Investigación Interdiciplinaria en el Área de Nanoestructuras y Biomateriales de la
Escuela Nacional de Estudios Superiores, Unidad León (ENES). En relación con el
investigador, este seguirá las normas de acuerdo con el reglamento de la Ley
General de Salud en materia de investigación para la salud título cuarto, de la
bioseguridad de las investigaciones capitulo I, de la investigación con
microorganismos patógenos o material
biologico que pueda contenerlos, descrito en
los artículos 75° y 77°.

Es importante señalar la certificación del

laboratorio de investigación interdisciplinaria
certificado bajo la Norma ISO
9001:2015 avalada por Alliance Veritas
Register, en el que llevamos a cabo la
enseñanza a través de la ejecución de
proyectos en las siguientes áreas: ciencias
agrogenómicas, nanoestructuras y
biomateriales además de patología oral y
maxilofacial.

33
8.5. Análisis estadístico.

El análisis estadístico fue realizado utilizando el paquete Sigma Plot 12.0. Para cada
linaje celular se realizó un análisis de varianza de dos vías evaluando: el efecto de
la concentración y el tipo de sintsis utilizado, las pruebas de compraración multiple
fueron hechas con el estadístico de Tukey, además que, para todos los análisis se
utilizó un nivel de significancia de 0.05.

34
 9. Resultados.

9.1. Ensayo de citotoxicidad.

Los resultados de la viabilidad celular de los materiales experimentales en

fibroblastos gingivales humanos se muestran en la Figura 14. De acuerdo con el
análisis estadístico realizado, la viabilidad celular fue significativamente influenciada
por la concentración concentración (p < 0.001) y el tipo de material utilizado (p <
0.001), así mismo, la interacción entre ambos factores resultó estadísticamente
significativa (p < 0.001). Para el material HQ, la viabilidad celular disminuyó
significativamente a partir de la concentración de 3%. Por otro lado, para el material
HQC, esto solo ocurrió en concentraciones de 25 y 50%.

Figura 14. Viabilidad celular de fibroblastos gingivales humanos en función de la

concentración y tipo de material evaluado. Letras minúsculas diferentes indican
diferencias estadísticamente significativas entre las diferentes concentraciones
evaluadas del material HQC. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias
estadísticamente significaticas entre las diferentes concentraciones evaluadas del
material HQ. Las columnas que están debajo de una barra horizontal indican la

35
ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos HQC y HQ
para cada concentración.

Por otro lado, los resultados de la viabilidad celular de los macrófagos de ratón en
función de la concentración y los materiales evaluados se muestra en la Figura 15.
De acuerdo con el análisis estadístico la viabilidad celular fue significativamente
influenciada tanto por la concentración (p = 0.005) como por el tipo de material
utilizado (p < 0.001), de igual forma, la interacción entre ambos factores resultó
estadísticamente significativa (p < 0.001). Para el material HQ, a medida que la
concentración aumenta se observan efectos citotóxicos, principalmente en
concentraciones de 6.25%, 25% y 50%.

Figura 15. Viabilidad celular de macrófagos de ratón en función de la

concentración y tipo de material evaluado. Letras minúsculas diferentes indican
diferencias estadísticamente significaticas entre las diferentes concentraciones
evaluadas del material HQC. Letras mayúsculas diferentes indican diferencias
estadísticamente significaticas entre las diferentes concentraciones evaluadas del
material HQ. Las columnas que están debajo de una barra horizontal indican la
ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos HQC y HQ
para cada concentración.

36
Los resultados para la prueba de MTT para fibroblastos gingivales humanos se
observa en la Figura 16, existe una correlación con las gráficas, donde, a medida
que la concentración aumenta la viabilidad celular disminuye en la síntesis HQ, la
actividad metabólica de las células en el compuesto HQC para fibroblastos
gingivales humanos se observa constante gracias a la cantidad de formazán azul
no dependiendo de la concentración.

Figura 16 .- Después de un periodo de incubación de 24 horas, por medio del

microscopio se determinó la integridad de las mitocondrias y su actividad funcional
para la viabilidad celular en células de fibroblastos gingivales humanos en ambas
síntesis.

Para el linaje celular de macrófagos de ratón (Figura 17) en la síntesis HQ se

observa una reducción de la actividad celular metabólica en el 50 % en una
comparativa a los controles de 0% mientras tanto, con la síntesis HQC la
interpretación de la viabilidad celular se observa constante en todas las
concentraciones relacionándose con la Figura 15.

37
 Figura 17.- Después de un periodo de incubación de 24 horas, por medio del
microscopio se determinó la integridad de las mitocondrias y su actividad funcional
para la viabilidad celular en células de macrófagos de ratón en ambas síntesis.

9.2 Determinación de sensibilidad antimicrobiana por difusión.

Para los resultados del ensayo antimicrobiano se midieron las zonas de inhibición
en todos los cultivos realizados, con las dos síntesis en ambas bacterias además
de los controles tablas 1 y 2. Es importante mencionar que existieron errores durante
la inoculación para C. albicans (Figura 20) por lo cual no se tomo en cuenta dentro
de los resultados para este estudio.

38
Zonas de Inhibición / HQ.
Promedios de acuerdo a la síntesis HQ.
E. faecalis S. aureus
Contacto Directo 2 mm 2.1 mm
100% 0 mm. 0 mm.
Dilución 50% 0 mm. 0 mm.
Dilución 25% 0 mm. 0 mm.
Promedios controles de acuerdo a la síntesis HQ.
Gel de Carbopol. 0 mm. 0 mm.
MHB 0 mm. 0 mm.
CaOH 1 mm. 1.5 a 2 mm
Quitosano 1 mm. 2.5 a 3 mm.
Ácido Acético 2 mm. 3.5 a 4 mm

Tabla 1.- Promedios zonas de inhibición en la sintesis HQ.

Zonas de Inhibición / HQC.

Promedios de acuerdo a la síntesis HQC.
E. faecalis S. aureus
Contacto Directo 0 mm. 0 mm.
100% 0 mm. 0 mm.
Dilución 50% 0 mm. 0 mm.
Dilución 25% 0 mm. 0 mm.
Promedios controles de acuerdo a la síntesis HQC.
Gel de Carbopol. 0 mm. 0 mm.
MHB 0 mm. 0 mm.
CaOH 0 mm. 1 a 1.5 mm.
Quitosano 1 mm. 3 a 3.5 mm.
Ácido Acético 2 mm. 3.5 a 4 mm.

Tabla 2.- Promedios zonas de inhibición en la síntesis HQC.

39
 A
B

Figura 20.- Error de inoculación de C. albicans, en la caja de Petri A se observa

una muestra representativa de los controles, a la derecha en la caja de Petri B se
observa una muestra representativa de la síntesis HQ en contacto directo y a
diferentes concentraciones.

De acuerdo con la síntesis de HQC en E. faecalis, se examinó como patron en todos

los ensayos que no existe una zona de inhibición a ninguna concentración como se
observa en la Figura 21 .

40
 Figura 21 .- Para la síntesis HQC en E. faecalis, en la imagen de la izquierda
podemos observar que en nuestros controles (A), se observa un halo blanquecino
en el disco de papel del quitosano (B), en la imagen de la derecha no existieron
cambios significativos en las distintas concentraciones (C) al igual que en contacto
directo con respecto a esta síntesis (D).

De acuerdo a la tabla de resultados la síntesis de HQ en E. faecalis, se observan

zonas de inhibición en un rango de 2 mm en todas las muestras (Figura 22).

Figura 22. En la síntesis de HQ en E. faecalis, la imagen de la izquierda se

observan los controles (A), un halo blanquecino en el disco de papel del quitosano
(B), en la imagen de la derecha, las diferentes concentraciones donde no se notan
cambios significativos (C), y el disco de papel donde estuvo en contacto directo se
observa una zona de inhibición de 2 mm (D).

Observando los resultados en las cajas petri con S. aureus en la síntesis HQC no
se observaron cambios significativos a diferentes concentraciones así como
tampoco en contacto directo (Figura 23).

41
 Figura 23 . Para la síntesis HQC en S. aureus, en nuestros controles (A), es
interesante la zona de inhibición que se nota en el disco de quitosano (B), incluso
es mas grande que el del hidróxido de calcio (C), en la imagen de la derecha
podemos verificar que no existen zonas de inhibición, ni a diferentes
concentraciones (D), tampoco en contacto directo con mencionada síntesis (E).

De acuerdo con los resultados obtenidos en S. aureus con la síntesis HQ, se

observan zonas de inhibición de 2 mm solo en discos en contacto directo, no
encontrando cambios significativos a diferentes concentraciones (Figura 24).

42
Figura 24 . Síntesis HQ en S. aureus, en la imagen e la izquierda los controles (A),
es necesario hacer notar la zona de inhibición que produce el disco de quitosano
(B), en la caja de la derecha las diferentes diluciones y el disco en contacto directo
(C) se puede observar la zona de inhibición que produce el disco de la síntesis en
contacto directo (D).

43
 10. Discusión.

En el presente estudio se realizaron diferentes experimentos donde se pusieron a

prueba dos síntesis HQ/HQC sobre diferentes tipos de celulas y bacterias, se evaluo
la citotoxicidad en celuas RAW y HGF, donde los resultados sugieren que a mayor
concentración las sintesis antes mencionadas adquieren un efecto citotóxico,
rechazando la hipótesis nula.

El efecto antimicrobiano observado en S. aureus y E. faecalis bajo estas dos síntesis

solo se observa en los discos en contacto directo, aceptando la hipótesis nula solo
en la síntesis de HQ.

Las Figuras 21 y 23 obedecen a que, en sintesis de HQC se observan menores

efectos de citotoxicidad los diferentes linajes celulares (RAW/HGF) ya que como G.
Bonacucina 36 menciona en su trabajo el carbopol es el polímero mas utilizado como
base en la formulación de medicamentos en la industria farmacéutica, y ese
polímero habitualmente se prepara en dispersión con agua lo que incrementa su
tamaño y neutraliza el sistema, para nuestro estudio tanto el quitosano como el
hidróxido de calcio fueron mezclados en agua, esto redujo su nivel de eficacia en
cuanto a que esta síntesis entro a mayor dilución ya que las concentraciones de gel
de carbopol eran mayores; R. Sareen y col 44 en su trabajo encuentran resultados
satisfactorios solo cuando el medicamento (en este estudio ellos probaron
Meloxicam) esta en un 93%, siendo solo un 7% gel de carbopol. Si se correlaciona
con nuestro trabajo, se observa una mayor viabilidad celular porque la proporción
de agua (gel de carbopol) fue mayor en todo momento comparada con la del
hidróxido de calcio y quitosano.

Pasa lo contrario en síntesis de HQ bajo las dos líneas celulares (RAW/HGF) donde
se observan efectos citotóxicos a medida que la concentración aumenta, Loh y
colaboradores 45 en su trabajo evalúan la citotoxicidad de moléculas de quitosano y
encuentran que la citotoxicidad de este compuesto esta relacionada a la
concentración, y que el mecanismo de acción de la citotoxicidad se debe a una
fragmentación del núcleo y ruptura del citoplasma provocada por las moléculas de

44
quitosano. Para el caso de la evaluación del material HQ, al ser aplicado
directamente sin ser mezclado con el gel de carbopol tanto las moléculas de
quitosano como el hidróxido de calcio entraron en contacto directo con las células
y, por ende, la viablilidad celular se redujo. Otro motivo por el cual pudo haberse
reducido la viabilidad celular se debe a la citotoxicidad del hidróxido de calcio, la
cual es atribuida a la presencia de los iones hidroxilo 45–47 donde se tiene evidencia
que debido al pH tan elevado que se genera, hay necrosis celular y apoptosis.

En un estudio Chen y col. 48 evalúan los efectos antibacterianos del quitosano y

señalan que, el quitosano como biopolímero contiene mejores características
antimicrobianas que la quitina por si sola debido a un Ph de 6 y cargas positivas en
el monómero de glucosamina. Varios estudios 29,30,48,49 mencionan que dentro de
los mecanismos de acción de las moléculas de quitosano cargadas positivamente y
las membranas celulares cargadas negativamente existe una fuga de componentes
protéicos y otros componentes intracelulares, es decir actua de manera externa
permitiendo la permeabilidad celular en la membrana de la bacteria 29,50 Cabe
mencionar que este factor antimicrobiano se ve influenciado por el grado de
desacetilación, la concentración en solucion y el pH del medio. 51

Esto se correlaciona con nuestro estudio ya que el quitosano por si solo originó,
halos blanquecinos en las placas de Petri de los controles usados contra E. faecalis
y S. aureus; ademas de zonas de inhibición en los discos en ambas bacterias que
se encuentran en contacto directo con las mismas, demostrando que a mayor
concentración de quitosano se observa una mayor actividad antimicrobiana.

Es importante la complementación de quitosano al hidróxido de calcio, ya que varios

estudios han revelado que el hidróxido de calcio por si solo no erradica todas las
bacterias dentro de un túbulo dentinario. 51,52

A pesar que se han propuesto alternativas para aumentar sus efectos

antimicrobianos como su combinación con la clorhexidina, 53 paramonoclorfenol
alcanforado 54 y antibióticos. 55

Como se observa en los discos en contacto directo en el compuesto HQ donde las

concentraciones fueron mayores, es posible apreciar en potencial de ambas

45
sustancias en sinergia con el fin de obtener un efecto antimicrobiano. Raafat 56 en
su estudio explica que el efecto antimicrobiano del quitosano se debe a las
propiedades policatiónicas presentadas por los grupos amino cargados
positivamente de la glucosamina, este siendo el factor principal que colabora en la
interacción con los componentes cargados negativamente en la membrana,
causando daños en las actividades vitales, esto, vinculado con el hecho de que
estas síntesis al ser la que mejores resultados obtuvo en cuestión de parámetros
antimicrobianos, no distingue entre células, por lo cual obtiene inferiores resultados
en el ensayo de citotoxicidad. Estudios previos han estudiado el efecto
antimicrobiano del quitosano en combinación con el hidróxido de calcio en E.
faecalis 57 concluyendo que la adición del quitosano al hidróxido de calcio exhibe un
efecto inhibidor sobre el crecimiento de E. faecalis en la dentina del conducto
radicular en comparación con otros vehículos siendo un medicamento intraconducto
con buen efecto antimicrobiano sin afectar negativamente las propiedades de
adhesivas de selladores endodónticos, por lo cual la resolución de la hipótesis
planteada es parcialmente aceptada, ya que se observan efectos antimicrobianos
solo en la síntesis de hidróxido de calcio con quitosano.

Dentro de las limitaciones de este estudio podemos encontrar el hecho que, por
cuestiones de falla en el sembrado de la C albicans, no pudimos evaluar el efecto
de ambas síntesis en levaduras. Como es bien sabido, estudios de gran impacto
realizan ensayos antimicrobianos en modelos multiespecie (biofilm) por lo cual, lo
ideal seria realizar dichos experimentos en este tipo de ecosistemas microbianos
organizados. Se requieren mas investigaciones de laboratorio y clinicas para
evaluar solo la síntesis de HQ, ya que como los resultados lo muestran se
observaron mejores efectos antimicrobianos, sugiriendo un uso prometedor de esta
síntesis como medicación intraconducto.

46
 11. Conclusiones.

Con base en los resultados presentados y dentro de las limitaciones de este estudio
es posible concluir que la viabilidad celular y el efecto antimicrobiano de un complejo
de hidróxido de calcio-quitosano fueron dependientes a la concentración en que
fue evaluada. Las mayores concentraciones de este complejo llevaron a un aumento
en la actividad antimicrobiana y a una disminución en la viabilidad celular.

El compuesto HQC mostró una mayor viabilidad celular pero nula eficacia
antimicrobiana en diluciones.

47
 12. Anexos.

Certificado de aprobación del comité de ética en investigación CIEAO.

48
 Bibliografía.

1. Hargreaves KM, Berman LH, Cohen S. Cohen. Vías de la Pulpa +

ExpertConsult [Internet]. Elsevier Health Sciences Spain; 2011. Disponible
en: https://books.google.com.mx/books?id=auG-aCkeoUgC

2. Vertucci FJ. Root canal anatomy of the human permanent teeth. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 1984;58(5):589–99.

3. Peters OA, Schönenberger K, Laib A. Effects of four Ni–Ti preparation

techniques on root canal geometry assessed by micro computed
tomography. Int Endod J. 2001;34(3):221–30.

4. Walton RE. Intracanal medicaments. Dent Clin North Am. 1984;28(4):783–

96.

5. Ehrmann EH, Messer HH, Adams GG. The relationship of intracanal

medicaments to postoperative pain in endodontics. Int Endod J.
2003;36(12):868–75.

6. Chong BS, Ford TRP. The role of intracanal medication in root canal
treatment. Int Endod J. 1992;25(2):97–106.

7. Vineeta N, Gupta S, Chandra A. Retrievabilty of calcium hydroxide intracanal

medicament with Chitosan from root canals: An in vitro CBCT volumetric
analysis. J Conserv Dent JCD. 2014;17(5):454.

8. Shaik J, Garlapati R, Nagesh B, Sujana V, Jayaprakash T, Naidu S.

Comparative evaluation of antimicrobial efficacy of triple antibiotic paste and
calcium hydroxide using chitosan as carrier against Candida albicans and
Enterococcus faecalis: An in vitro study. J Conserv Dent JCD.
2014;17(4):335.

9. del Carpio-Perochena A, Kishen A, Shrestha A, Bramante CM. Antibacterial

properties associated with chitosan nanoparticle treatment on root dentin and
2 types of endodontic sealers. J Endod. 2015;41(8):1353–8.

49
10. Calamari S-E, Bojanich M-A, Barembaum S-R, Berdicevski N, Azcurra A-I.
Antifungal and post-antifungal effects of chlorhexidine, fluconazole, chitosan
and its combinations on Candida albicans. Med Oral Patol Oral Cir Bucal.
2011;16(1):e23-8.

11. El Ghaouth A, Arul J, Asselin A, Benhamou N. Antifungal activity of chitosan

on post-harvest pathogens: induction of morphological and cytological
alterations in Rhizopus stolonifer. Mycol Res. 1992;96(9):769–79.

12. Buckley JP. The chemistry of pulp decomposition, with a rational treatment
for this condition and its sequelae. Amer Dent J. 1904;3:764–71.

13. Kasugai S, Hasegawa N, Ogura H. Application of the MTT colorimetric assay

to measure cytotoxic effects of phenolic compounds on established rat dental
pulp cells. J Dent Res. 1991;70(2):127–30.

14. Soekanto A, Kasugai S, Mataki S, Ohya K, Ogura H. Toxicity of camphorated

phenol and camphorated parachlorophenol in dental pulp cell culture. J
Endod. 1996;22(6):284–6.

15. Friedberg BH, Gartner LP. Embryotoxicity and teratogenicity of formocresol

on developing chick embryos. J Endod. 1990;16(9):434–7.

16. Lewis B Ben, Chestner SB. Formaldehyde in dentistry: a review of mutagenic

and carcinogenic potential. J Am Dent Assoc. 1981;103(3):429–34.

17. Van Mullem PJ, Simon M, Lamers AC. Formocresol: a root canal disinfectant
provoking allergic skin reactions in presensitized guinea pigs. J Endod.
1983;9(1):25–9.

18. Kawashima N, Wadachi R, Suda H, Yeng T, Parashos P. Root canal

medicaments. Int Dent J. 2009;59(1):5–11.

19. Neu HC. The crisis in antibiotic resistance. Science (80- ).

1992;257(5073):1064–73.

20. Foreman PC, Barnes IE. A review of calcium hydroxide. Int Endod J.

50
 1990;23(6):283–97.

21. Siqueira Jr JF, Lopes HP. Mechanisms of antimicrobial activity of calcium

hydroxide: a critical review. Int Endod J. 1999;32(5):361–9.

22. Rinaudo M. Chitin and chitosan: properties and applications. Prog Polym Sci.
2006;31(7):603–32.

23. Muzzarelli R. Chitosan in: R. Muzzarelli (Ed.), Natural Chelating Polymers.

Pergamon Press, Oxford; 1973.

24. Hudson SM, Smith C. Polysaccharides: chitin and chitosan: chemistry and
technology of their use as structural materials. En: Biopolymers from
renewable resources. Springer; 1998. p. 96–118.

25. Cartier N, Domard A, Chanzy H. Single crystals of chitosan. Int J Biol

Macromol. 1990;12(5):289–94.

26. Kumar MNVR. A review of chitin and chitosan applications. React Funct
Polym. 2000;46(1):1–27.

27. Dutta PK, Viswanathan P, Mimrot L, Kumar MNVR. Use of chitosan amine
oxide gel as drug carriers. J Polym Mater. 1997;14(4):351–5.

28. Dutta PK, Dutta J, Tripathi VS. Chitin and chitosan: Chemistry, properties
and applications. 2004;

29. Sandford PA, Zikakis JP, Brine CJ. Advances in chitin and chitosan. Elsevier
Applied Science; 1992.

30. Muzzarelli RAA. Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve,
cartilage and bone. Carbohydr Polym. 2009;76(2):167–82.

31. Przekora A, Ginalska G. Biological properties of novel chitosan-based

composites for medical application as bone substitute. Open Life Sci.
2014;9(6):634–41.

32. Hirano S, Gebelein CG, Carraher Jr CE. Industrial Biotechnological

Polymers. Technomic, Lancaster. 1995;189.
51
33. Sun Y, Liu Y, Li Y, Lv M, Li P, Xu H, et al. Preparation and characterization
of novel curdlan/chitosan blending membranes for antibacterial applications.
Carbohydr Polym. 2011;84(3):952–9.

34. Blanco-Fuente H, Anguiano-Igea S, Otero-Espinar FJ, Blanco-Méndez J. In-

vitro bioadhesion of carbopol hydrogels. Int J Pharm. 1996;142(2):169–74.

35. Singla AK, Chawla M, Singh A. Potential applications of carbomer in oral

mucoadhesive controlled drug delivery system: a review. Drug Dev Ind
Pharm. 2000;26(9):913–24.

36. Bonacucina G, Martelli S, Palmieri GF. Rheological, mucoadhesive and

release properties of Carbopol gels in hydrophilic cosolvents. Int J Pharm.
2004;282(1–2):115–30.

37. Riley RG, Smart JD, Tsibouklis J, Dettmar PW, Hampson F, Davis JA, et al.
An investigation of mucus/polymer rheological synergism using synthesised
and characterised poly (acrylic acid) s. Int J Pharm. 2001;217(1–2):87–100.

38. Unlü N, Ludwig A, Hincal AA. Formulation of Carbopol 940 ophthalmic

vehicles, and in vitro evaluation of the influence of simulated lacrimal fluid on
their physico-chemical properties. Pharmazie. 1991;46(11):784–8.

39. Carnali JO, Naser MS. The use of dilute solution viscometry to characterize
the network properties of carbopol microgels. Colloid Polym Sci.
1992;270(2):183–93.

40. Bremecker K-D. Tromethamine: an alternative in carbomer-gels containing

amines. Pharm Ind. 1989;51(2):199–202.

41. Chu JS, Danny MY, Amidon GL, Weiner ND, Goldberg AH. Viscoelastic
properties of polyacrylic acid gels in mixed solvents. Pharm Res.
1992;9(12):1659–63.

42. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods.
1983;65(1–2):55–63.

52
43. Maltz M. Antimicrobial Effects on Bacteria Associated with Dental Caries
[Internet]. Department of Cariology, Faculty of Odontology, University of
Göteborg; 1981. Disponible en:
https://books.google.com.mx/books?id=rjFqAAAAMAAJ

44. Sareen R, Kumar S, D Gupta G. Meloxicam carbopol-based gels:

characterization and evaluation. Curr Drug Deliv. 2011;8(4):407–15.

45. Loh JW, Yeoh G, Saunders M, Lim L-Y. Uptake and cytotoxicity of chitosan
nanoparticles in human liver cells. Toxicol Appl Pharmacol.
2010;249(2):148–57.

46. Jahromi MZ, Ranjbarian P, Shiravi S. Cytotoxicity evaluation of Iranian

propolis and calcium hydroxide on dental pulp fibroblasts. J Dent Res Dent
Clin Dent Prospects. 2014;8(3):130.

47. Cavalcanti BN, Rode SM, Marques MM. Cytotoxicity of substances leached
or dissolved from pulp capping materials. Int Endod J. 2005;38(8):505–9.

48. Chen C-S, Liau W-Y, Tsai G-J. Antibacterial effects of N-sulfonated and N-
sulfobenzoyl chitosan and application to oyster preservation. J Food Prot.
1998;61(9):1124–8.

49. de Souza CCA, Duarte PT, De Souza PP, Giro EM, Hebling J. Cytotoxic
effects and pulpal response caused by a mineral trioxide aggregate
formulation and calcium hydroxide. Am J Dent. 2008;21(4):255.

50. Jung B, Kim C, Choi K, Lee YM, Kim J. Preparation of amphiphilic chitosan
and their antimicrobial activities. J Appl Polym Sci. 1999;72(13):1713–9.

51. Rabea EI, Badawy ME-T, Stevens C V, Smagghe G, Steurbaut W. Chitosan

as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules.
2003;4(6):1457–65.

52. Fang SW, Li CF, Shih DYC. Antifungal activity of chitosan and its
preservative effect on low-sugar candied kumquat. J Food Prot.
1994;57(2):136–40.

53
53. de Magalhães Silveira CF, Cunha RS, Fontana CE, de Martin AS, de
Almeida Gomes BPF, Motta RHL, et al. Assessment of the antibacterial
activity of calcium hydroxide combined with chlorhexidine paste and other
intracanal medications against bacterial pathogens. Eur J Dent. 2011;5(1):1.

54. Siqueira Jr JF, de Uzeda M. Influence of different vehicles on the

antibacterial effects of calcium hydroxide. J Endod. 1998;24(10):663–5.

55. Baer J, Maki JS. In vitro evaluation of the antimicrobial effect of three
endodontic sealers mixed with amoxicillin. J Endod. 2010;36(7):1170–3.

56. Raafat D, Sahl H. Chitosan and its antimicrobial potential–a critical literature
survey. Microb Biotechnol. 2009;2(2):186–201.

57. Elsaka SE, Elnaghy AM. Antibacterial activity of calcium hydroxide combined
with chitosan solutions and the outcomes on the bond strength of RealSeal
sealer to radicular dentin. J Biomed Res. 2012;26(3):193–9.

54
55
56
57