UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

CARRERA DE BIOLOGÍA

GENÉTICA Y EVOLUCIÓN

TAREA 9

MicroRNA-100 is involved in shrimp immune response to white spot

syndrome virus (WSSV) and Vibrio alginolyticus infection

ESTUDIANTE:
Luz Marina Castro Barco

PROFESOR:
Blgo. Telmo Ariel Escobar

2022 – 2023
Ciclo II
MicroRNA-100 is involved in shrimp immune response to white spot
syndrome virus (WSSV) and Vibrio alginolyticus infection.
La manchas blancas (white spot syndrome virus - WSSV), produce alta mortalidad en postlarvas
y camarones juveniles (puede ser cercana al 100% en pocos días); es de curso agudo y se transmite
de forma horizontal o vertical (zooplancton, agua contaminada, sedimentos del fondo de los
estanques, canibalismo y predación). Las manifestaciones de la enfermedad suelen aparecer
durante los primeros 30-50 días de cultivo en los estanques de producción. El estrés es un factor
fundamental en el desarrollo de la enfermedad, se ve una marcada relación entre la temperatura
inferior a 27°C y la aparición de la enfermedad. Por encima de esta, los camarones infectados con
el WSSV pueden permanecer como portadores asintomáticos.

Ilustración1: Virus del síndrome de la mancha blanca o WSSV

Otros factores que producen estrés y que desencadenan la enfermedad en camarones infectados
por el WSSV, son niveles bajos de oxígeno disuelto, valores extremos de pH, cambios súbitos de
la calidad del agua, altos niveles de sólidos en suspensión, sustancias tóxicas en el agua, ablación
unilateral de los pedúnculos oculares y el desove, entre otros. Se ha determinado en algunos casos
que la enfermedad de las manchas blancas está relacionada con presencia de bacterias oportunistas
en la hemolinfa de los camarones (bacteremia). Esta condición sugiere que las toxinas liberadas
por las bacterias cuando su cantidad es abundante dentro del camarón, lo predispone por estrés
séptico a sufrir la enfermedad por el WSSV. La hipótesis de esta situación propone que dicha
toxemia produce inmunosupresión y/o que se activa la replicación viral produciendo daños de
tejidos y signos clínicos en 24 a 48 horas de la fase aguda de la bacteriosis.
 Son ARN monocatenarios que se encargan de
regular la expresión génica

Son ARN monocatenarios que se encargan de

regular la expresión génica

Son utilizados para los estudios de diagnóstico

y para el tratamiento contra el cáncer.

Se componen entre 21 y 25 nucleótidos, y se

caracterizan por utilizar una ruta de
ribointerferencia.

Métodos

Camarones y preparación de tejidos.

Se obtuvo un total de individuos
adultos sanos de M. japonicus del
mercado de mariscos de Hangzhou,
Zhejiang, China. Los hemocitos se
recogieron de camarones infectados
y no infectados. Las muestras se
utilizaron inmediatamente para la Preparación de WSSV y V. alginolyticus
extracción de ARN para evitar la
degradación total del ARN. WSSV (número de acceso de GenBank
AF 332093.1) se purificó y usó en un
experimento de desafío como se
describió previamente. Se cultivó V.
alginolyticus y se usó para desafiar a
los camarones de acuerdo con un
protocolo informado anteriormente
 Secuenciación de pequeños ARN
Los ARN totales se extrajeron de los hemocitos
de los camarones infectados y no infectados a las
24 y 48 horas posteriores a la infección mediante
el uso de un kit de aislamiento de miARN
(Ambion, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo
del fabricante. Los siguientes pasos se realizaron
siguiendo las pautas descritas en un informe
mencionado anteriormente

Northern blotting de miRNAs

Los ARN pequeños se extrajeron de hemocitos de
camarones utilizando el kit de aislamiento de
miARN mirVana (Ambion, EE. UU.) de acuerdo
con el manual del fabricante. La concentración
del ARN pequeño se midió con NanoDrop y se
usaron 3 mg de ARN pequeños por muestra para
la transferencia Northern como se describió
anteriormente

Ensayo de pérdida de función in vitro de

camarones miR-100
Para silenciar la expresión de miR-100
(AACCCGTAGATCCGAACTTGTG), se inyectó
el oligonucleótido anti-miRNA-100 (AMO-miR-
100) en cada camarón a una dosis de 0,15
mM/camarón. Como control, la secuencia de AMO-
miR-100 se codificó y se mostró como AMO-miR-
100-scramble. En las inyecciones se incluyeron
AMO-miR-100-scramble (0,15 mM/camarón) y
solución salina tamponada con fosfato (PBS). Para
evitar la degradación de AMO-miR-100 o AMO-
miR-100-scramble, los oligonucleótidos se
inyectaron secuencialmente en el mismo camarón
tres veces en un intervalo de 24 horas.
PCR cuantitativa en tiempo real
Los experimentos se realizaron por triplicado y se
analizaron al menos tres camarones para cada tipo
de tejido. Se utilizaron menos de 200 μg de ARN
total para la síntesis de ADNc mediante ReverTra
Ace qPCR RT Master Mix con gDNA Remover
Code: FSQ-301 (Toyobo, Japón). El ADNc se
almacenó a -20 °C. Se llevó a cabo un ensayo
SYBR Green qRT-PCR en un sistema de detección
de PCR en tiempo real de dos colores Bio-Rad, y
los datos se calcularon de acuerdo con el método
de TC comparativo 2−ΔΔCT usando Microsoft
Office Excel 2007, con la amplificación de
GAPDH como un control interno.

PCR cuantitativa en tiempo real de miARN

Los experimentos se realizaron por triplicado y se
analizaron al menos tres camarones para cada tipo
de tejido. Se utilizaron menos de 200 μg de ARN
total para la síntesis de ADNc mediante el kit de
transcripción inversa TaqMan TM MicroRNA
(Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El cebador
de transcripción inversa de miR-100 y los
cebadores de PCR en tiempo real de miR-100 y
U6 se diseñaron según el principio de diseño de
cebador de miARN Stem-Loop, las secuencias se
muestran en. El ADNc se almacenó a -20 °C.

Análisis de mortalidad de camarones Análisis de recuento total de

Camarones (más de 20 individuos)
fueron inyectados intramuscularmente
con AMO-miR-100 en el área lateral del
cuarto segmento abdominal. Doce horas
más tarde, a los camarones tratados se
les inyectó 0,1 ml de filtrado ( 105
copias de WSSV/ml) que contenía
AMO-miR-100 utilizando una jeringa
con una aguja de calibre 29.
hemocitos
Se recogieron aproximadamente 1,0–1,5
ml de hemolinfa de camarón utilizando
una jeringa empapada en anticoagulante,
junto con un volumen igual de
anticoagulante (NaCl 450 mM, EDTA-
Na2 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3, 850
mOsm/kg)
Resultados
Identificación de la respuesta de miARN a la infección por WSSV o V. alginolyticus en
camarones a través de micromatrices de miARN y transferencia Northern.

El nivel de expresión relativo de miRNA se muestra con diferentes colores; dpu-miR-100

indica miR-100;

Análisis de transferencia Northern del ARN total con sondas de oligodesoxinucleótidos

marcadas con DIG en diferentes momentos posteriores a la infección (24 y 48 h).

Se aplicó la PCR cuantitativa Stem-Loop en tiempo real para revelar la expresión

posterior a la infección de miR-100 de manera intuitiva.
Pérdida de función de miR-100 de camarón mediante el uso de oligonucleótidos
anti-miRNA.

se analizó mediante PCR en

tiempo real Quantitative Stem-
Loop para confirmar el efecto de
eliminación

detectar la expresión en los

hemocitos de once genes inmunes
(Rab7, IMD, p 53,
MAPK, hemocianina, miosina,
pro PO, Rho, L-lectina, STAT y
TNF)

Los datos se muestran como medias ± SD (desviación estándar) de tres individuos separados. Los
asteriscos indican una diferencia significativa ( P < 0,01) entre dos muestras.
Efectos de la eliminación de miR-100 en la infección por WSSV o V. alginolyticus

Recuento de mortalidad de camarones desafiados con WSSV ( A ) o V. alginolyticus ( B )

después del tratamiento con AMO-miR100. Cada grupo contenía más de 20 individuos de
camarón para garantizar el nivel de confianza y el tratamiento se repitió tres veces para evitar la
influencia del clima, la condición del camarón y el error en la operación de inyección.

Efectos de la interferencia AMO-miR-100 en la actividad de la fenol oxidasa (PO).

( A ) Actividad PO hemocítica después del tratamiento con WSSV o WSSV + AMO-

miR-100;
( B ) Actividad de PO hemocítica después del tratamiento con V. alginolyticus o V.
alginolyticus + AMO-miR-100. Cada columna representa la media de ensayos por
triplicado.
 Efectos de la interferencia AMO-miR-100 en la actividad SOD de la hemolinfa del
camarón.

( A ) Actividad SOD relativa después del tratamiento con WSSV o AMO-miR-100 + WSSV;

( B ) Actividad SOD relativa después del tratamiento con V. alginolyticus o AMO-miR-100 + V.

alginolyticus . La actividad SOD de PBS se usó como un índice como 1, cada columna representa
el valor relativo en comparación con PBS.

Efectos de la interferencia AMO-miR-100 en el recuento de hemocitos totales de

camarones.

Se usó PBS como control. El recuento total de hemocitos (THC) de PBS se usó como un
índice de 1, cada columna representa el valor relativo en comparación con PBS.
Efectos de la interferencia AMO-miR-100 en la etapa temprana y tardía de la
apoptosis.

• Los viriones de WSSV y V. alginolyticus se marcaron con FITC.

• El área del pico de fluorescencia representaba la intensidad de la fluorescencia en los

hemocitos, mostrando el porcentaje de hemocitos engullidos por el patógeno, y el
diagrama de dispersión representaba la granularidad de los hemocitos, el incremento de
la granularidad celular sugería la capacidad de una sola célula para engullir el patógeno.
 Discusión

En el experimento de función de pérdida, encontramos que

había dos genes, entre múltiples genes relacionados con el
sistema inmunológico, que estaban influenciados por la
desactivación de miR-100. hemocianina y
miosina. Investigaciones anteriores han demostrado que la
hemocianina es una proteína respiratoria importante que
transporta oxígeno por todo el cuerpo de los camarones y
podría estar involucrada en su resistencia a infecciones
patógenas

Los datos obtenidos en este estudio indicaron que la expresión

de hemocianina estaba regulada por miR-100. La miosina es una
proteína del citoesqueleto que regula múltiples procesos, como
el transporte de materiales, la contracción muscular, la división
celular y la fagocitosis

Los resultados indicaron que el camarón miR-100 juega un

papel esencial en el sistema inmunológico innato de los
camarones. miR-100 promueve la respuesta inmune antiVibrio
de los camarones a través de la regulación del THC, la
apoptosis, la fagocitosis y la actividad de PO. Además, ejerce
una influencia sobre la infección por WSSV a cierto nivel
mediante el control de la actividad de SOD, la fagocitosis de
hemocitos y la actividad de PO.
Referencia
• Wang, Z. y Zhu, F. (2017). MicroRNA-100 está involucrado en la respuesta inmune de los
camarones al virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) y la infección por Vibrio
alginolyticus. Informes científicos, 7 (1), 1-12.