UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas

Escuela Profesional de Biología

PRACTICA Nº1 FRAGILIDAD OSMOTICA DEL ERITROCITO

Docente:

 Blga. Rossalyn Acuña Payano

Estudiantes:

 Hidalgo Venegas, Carlos.

 Toribio Gamuzo, César.
 Vásquez Domínguez, Andrés.

Grupo:

Grupo “E” – Viernes 16:20 – 18:00

2013
 FRAGILIDAD OSMÓTICA DEL
ERITROCITO

I. INTRODUCCIÓN

La osmosis es un tipo especial de transporte pasivo en el cual sólo

las moléculas de agua son transportadas a través de la membrana.
El movimiento de agua se realiza desde un punto en que hay mayor
concentración a uno de menor para igualar concentraciones. De
acuerdo al medio en que se encuentre una célula, la osmosis varía.
La función de la osmosis es mantener hidratada a la membrana
celular. Dicho proceso no requiere gasto de energía. En otras
palabras, la osmosis es un fenómeno consistente en el paso del
solvente de una disolución desde una zona de baja concentración de
soluto a una de alta concentración de soluto, separadas por una
membrana semipermeable.

La membrana celular constituye una interfase entre el compartimento

intra y extracelular que permite el libre recambio de moléculas de
agua, estableciéndose un gradiente osmótico. La membrana celular
de los eritrocitos es flexible, pero prácticamente carece de
elasticidad, lo que significa que la célula se rompe si le entra agua
hasta exceder un volumen crítico.

Cuando la célula enfrenta un ambiente hipotónico se genera un

movimiento neto de agua libre hacia su interior. Según el grado de
hipotonicidad y la capacidad de la membrana para mantener su
integridad, la célula se hincha y estalla permitiendo, en el caso de los
eritrocitos, la salida de hemoglobina. Esta propiedad es utilizada en
la prueba de la fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE), que consiste
en exponer alícuotas de eritrocitos a concentraciones decrecientes
de NaCl, usualmente entre 0,85% y 0%, y luego cuantificar el grado
de hemólisis en cada una de ellas. Por lo tanto, la FOE permite
evaluar la resistencia y estabilidad de la membrana del eritrocito
frente a un estrés osmótico.

La ruptura de la membrana celular produce la salida del contenido de

hemoglobina, por lo que se puede medir la ruptura de los eritrocitos
midiendo y cuantificando la cantidad de hemoglobina liberada al
medio mediante técnicas espectrofotométricas.
 La fragilidad osmótica del eritrocito depende de características como
la edad del eritrocito, su tamaño, forma y las demás condiciones
propias de la estructura interna de la célula. Como se emplea una
población de millones de células, la fragilidad osmótica sigue la
distribución de una curva normal.

El objetivo de esta práctica, es conocer la fragilidad osmótica de los

eritrocitos frente a diferentes efectos físicos y químicos; como la
temperatura y el pH; en concentraciones decrecientes de NaCl.

II. MARCO TEÓRICO

Eritrocitos

Los eritrocitos son células sanguíneas anucleadas que miden

aproximadamente 8 μm de diámetro (así, unos 3000 eritrocitos en fila
ocupan 2,5 cm de longitud) y tienen forma de disco bicóncavo. La
membrana del eritrocito en un complejo de lípidos y proteínas (bicapa
lipídica), el cual es importante para mantener la elasticidad celular y
la permeabilidad selectiva.

Los eritrocitos pueden deformarse, sin llegar a lesionarse para poder

pasar por los más estrechos capilares. Este grado de deformidad o
elasticidad influye en la rapidez del flujo sanguíneo por la micro-
circulación. Los eritrocitos son los elementos celulares más
abundantes de la sangre. En el varón adulto existen alrededor de
5.500.000 por cc de sangre, y en las mujeres unos 4.800.000 por cc.

Un eritrocito contiene 200 a 300 millones de moléculas de

Hemoglobina (Hb). La Hb consiste en la combinación de una
molécula proteica de globina, con cuatro moléculas de un compuesto
pigmentado llamado grupo hemo. Cada molécula de hemo posee un
átomo de hierro en su centro (Fe2+), por lo que, una molécula de Hb
puede transportar hasta cuatro moléculas de oxígeno y formar
oxihemoglobina por medio de una reacción reversible. La Hb también
puede combinarse con dióxido de carbono para formar carboxi-
hemoglobina, también por una reacción reversible. El CO2 se une a
la porción globina de la molécula de Hb. En un varón adulto normal,
100 cc de sangre contienen 14 a 16 g de Hb; la sangre de una mujer
contiene de 12 a 14 g de Hb por 100 cc.

El proceso de formación de eritrocitos se denomina eritropoyesis. La

vida promedio de un eritrocito circulante en el torrente circulatorio es
de unos 120 días. Se fragmentan en los capilares y son fagocitados
por las células retículo-endoteliales de la cubierta de los vasos
sanguíneos en hígado, bazo y médula ósea.

En condiciones fisiológicas, los eritrocitos se encuentran en equilibrio

osmótico con la sangre que los contiene (valor de osmolaridad del
plasma sanguíneo: 290 ± 10 mOsm/L), por lo cual se dice que la
sangre es una solución isosmótica e isotónica. Si la osmolaridad del
plasma llega a disminuir significativamente (plasma hipotónico), el
agua como líquido, entra al interior celular aumentando su volumen.
Si por el contrario, la osmolaridad del plasma se incrementa, este se
torna hipertónico y el agua sale del eritrocito ocurriendo una
reducción del volumen celular.

La forma y el volumen de los eritrocitos cambian cuando varía la

cantidad de agua contenida en su interior, pudiendo tomar una forma
estrellada o irregular al ocurrir pérdida de volumen (fenómeno de
crenación) o bien aumentar su volumen hasta adquirir la forma de
una esfera. Cuando la célula no puede resistir la carga de agua que
recibe, la membrana se rompe (fenómeno de hemólisis) y se libera la
hemoglobina la cual puede ser cuantificada por métodos
espectrofotométricos. La hemólisis es un proceso que ocurre en una
población mixta de células por lo que no ocurre en un solo punto y a
la misma velocidad en todos los casos. Como el efecto final es un
tanto difícil de apreciar experimentalmente, debido a que la hemólisis
ocurre en forma que se hace asintótica al 100 % (curva aplanada), se
prefiere analizar el tiempo de hemólisis al alcanzar el 50%.

Membrana del Glóbulo Rojo

La membrana del glóbulo rojo es la responsable de las propiedades

mecánicas y de la mayoría de las funciones fisiológicas de la célula.

Está formada por una bicapa lipídica plana, donde predominan en el

80 % los fosfolípidos y el colesterol y en menor medida los
glicolípidos y aminofosfolípidos, distribuidos asimétricamente. De
igual forma, se encuentran embebidas parcial o totalmente en ella las
proteínas integrales de membrana, unidas fuertemente por enlaces
apolares. Su libre desplazamiento a través de esta bicapa contribuye
a mantener su fluidez. Las proteínas periféricas interactúan entre sí
para formar una malla o enrejado que recubre la cara interior de la
doble capa de fosfolípidos y son las responsables de la estabilidad y
las propiedades viscoelásticas de la membrana. Entre estas
proteínas se destacan la espectrina (Sp), la ankirina (banda 2.1, 2.2,
2.3 y 2.6), la banda 4.1, la banda 4.2, la banda 4.9, la aducina, la
tropomiosina y la banda 7. Otras proteínas periféricas se disponen
hacia la cara exterior de la bicapa lipídica y ellas son
fundamentalmente antígenos de grupo sanguíneo (fig.1).

Fig. 1. Estructura de la membrana eritrocitaria.

La banda 3 representa el 25 % del total de las proteínas integrales.

Está constituida por 2 dominios estructurales: el dominio
citoplasmático, que es el encargado de la unión con las proteínas del
esqueleto, y el sitio transmembranoso que mantiene el contacto con
el medio extra e intracelular, proporcionando los canales
responsables del transporte de iones bicarbonato (HCO3-) y cloruros
(CI-). Además, posee un sitio de glicosilación capaz de unir
antígenos para el grupo sanguíneo I/i e interviene activamente en la
eliminación de eritrocitos envejecidos.

Las glicoforinas son un grupo de proteínas integrales caracterizadas

por su elevado contenido en ácido siálico. Las glicoforinas A,B,C y D
son las más importantes y constituyen los sustratos antigénicos de
los diferentes grupos sanguíneos. La glicoforina C contribuye a la
estabilidad de la membrana gracias a su interacción con proteínas
periféricas, además de participar en el intercambio iónico
transmembranoso.

La Sp es la proteína más abundante y además la principal

responsable del mantenimiento del enrejado proteico. Está
compuesta por 2 subunidades a y b enrolladas de forma antiparalela,
las que se unen por sus extremos para formar tetrámeros. Estas 2
subunidades están constituidas por secuencias repetitivas de 106
aminoácidos, las que se enlazan para formar una triple hélice (fig.2).
Fig.2. Estructura del tetrámero de espectrina (Sp). Se observa la
triple hélice de las unidades repetitivas, los sitios de autoasociación
de la Sp y los sitios de nucleación donde comienza la interacción
lateral entre las cadenas a y b de la Sp.

La ankirina (ANK) está compuesta por 3 subunidades estructurales

correspondientes a 3 dominios funcionalmente diferentes: regulador,
de unión a la membrana y de unión a la Sp. Su contribución a la
integridad de la membrana es decisiva, ya que constituye un
importante punto de anclaje a la doble capa lipídica a través de la
banda 3.1

La actina es una proteína organizada en forma de protofilamentos

helicoidales estabilizados por la interacción con la Sp, la proteína 4.1
y la tropomiosina.

Otra de las proteínas que integran el citoesqueleto es la proteína 4.1,

cuya función fundamental es estabilizar la unión espectrina-actina y
contribuir a fijar el esqueleto a la bicapa lipídica.

El mantenimiento de la forma y estabilidad de la membrana es

también responsabilidad de otras proteínas. Entre ellas está la
proteína 4.2, que actúa como modulador para estabilizar la
interacción ankirina-banda 3. La banda 4.9, la aducina y la
tropomiosina, protegen la estabilidad de la actina.
III. MATERIALES:

 Tubos de ensayo.
 Rejilla.
 Estufa para Baño María.
 Termómetro.
 Micropipeta y Propipeta.
 Pipetas graduadas.
 Agua destilada.
 Solución salínica amortiguadora (fosfato salino) a pH 7,4 de
NaCl al 1%
 Solución anticoagulante de ethylen diamine tetra-acético 0,1%
 Buffer a pH 5,6; 7,4 y 8,9.
 Muestra Biológica: Sangre de Caballo.

IV. METODOLOGÍA:

Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica

Para cada muestra sanguínea realizar el siguiente esquema de

evaluación:

Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Concentración
0,00 0,10 0,35 0,45 0,5 0,55 0,6 0,7 0,85
de NaCl %
Sol. Fosfato
salino (NaCl 0,00 0,1 0,35 0,45 0,5 0,55 0,6 0,7 0,85
1%) pH 7,4 mL
Agua destilada
1 0,9 0,65 0,55 0,5 0,45 0,4 0,3 0,15
mL
Sangre total
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
con EDTA mL.

 Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente

30 minutos.
 Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
 Leer en espectrofotómetro a 530 nm usando el tubo 9 como
blanco (0% de hemólisis).
 Haga una gráfica de los valores de hemólisis en % contra la
concentración de NaCl.
Experimento Nº2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad
osmótica

Reactivos 1 2 3 4 5
Concentración
0,00 0,85 0,85 0,85 0,85
de NaCl %
Sol. Fosfato
salino (NaCl 0,00 0,85 0,85 0,85 0,85
1%) pH 7,4 mL
Agua destilada
1 0,15 0,15 0,15 0,15
mL
Sangre total
0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
con EDTA mL.
Mezcla e
Sobre
incubar a ambiente ambiente 37º 45º
hielo
Cº/30 min.

 Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.

 Leer el sobrenadante en espectrofotómetro a 530 nm. Usar
agua destilada como blanco.
 Expresar el resultado como el porcentaje de hemólisis a cada
valor de temperatura de incubación. Se calcula utilizando el
valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo donde
ocurre la máxima hemòlisis como el 100%.

Experimento N°3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica

Reactivos 1 2 3 4
Concentración
0,00 0,85 0,85 0,85
de NaCl %
pH 5,6 7,4 8,9
Sol. Fosfato
salino (NaCl 0,00 4,25 4,25 4,25
1%) mL
Agua
1 0,15 0,15 0,15
destilada mL
Sangre total
0,01 0,01 0,01 0,01
con EDTA mL.

 Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente

30 minutos.
 Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min.
 Leer el sobrenadante en espectrofotómetro a 530 nm. Usar
agua destilada como blanco.
 Expresar el resultado como el porcentaje de hemólisis a cada
valor de pH. Se calcula utilizando el valor de absorbancia del
sobrenadante, del tubo donde ocurre la máxima hemólisis
como el 100%.
V. RESULTADOS

Cálculos

Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica

Concentracion
TUBO ABSORBANCIA % Hemólisis
NaCl
1 0.737 0 100
2 0.715 0.1 97.01
3 0.541 0.35 73.41
4 0.462 0.45 62.69
5 0.251 0.5 34.06
6 0.211 0.55 28.63
7 0.152 0.6 20.62
8 0.065 0.7 8.82
9 0 0.85 0
Tabla 1.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm

Experimento Nº1: Fragilidad Osmótica

120

100

80
%hemolisis

60

40 % Hemolisis

20

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Concentración de NaCl

Cuadro 1.- Gráfico de la concentración de NaCl respecto al porcentaje de

hemolisis obtenido
Experimento Nº2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad
osmótica

TUBO ABSORBANCIA Efecto de Tº % Hemólisis

Ambiente (sin
1 0.56 84.72
Sol. Salina)
2 0.482 Hielo 72.92
Ambiente (con
3 0.588 88.96
Sol. Salina)
4 0.661 37º 100
5 0.595 45º 90.02
Tabla 2.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm con
relación al efecto de temperatura y porcentaje de hemolisis.

Cuadro Nº 2: Experimento Nº 2: Efecto de la temperatura sobre la

fragilidad osmótica; el porcentaje de hemólisis en relación al
efecto de la temperatura.
Experimento N°3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica

TUBO ABSORBANCIA Efecto del pH % Hemólisis

1 1 0 -----------
2 0.043 5.6 19.63
3 0.166 7.4 75.8
4 0.219 8.9 100
Tabla 3.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotómetro a 530nm con
relación al efecto del pH y porcentaje de hemolisis.

Cuadro Nº 3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmótica; el % de hemólisis en

relación al pH.
Cuestionario

1. ¿Una solución salina que es isotónica para eritrocitos es

necesariamente isotónica para otro tipo de células?

El paso del agua hacia dentro o fuera de las células es un

proceso biológico de importancia. Si las concentraciones mol/L de
solutos en ambos lados de la membrana celular son las mismas,
la presión osmótica es igual y las soluciones son isotónicas sin
que haya paso neto de líquido en ningún sentido. Por lo tanto una
solución salina para eritrocitos o cualquier otra célula, es la
misma.
La concentración de solutos en la sangre es isotónica con una
solución de 0,9% de cloruro de sodio. La concentración de cloruro
de sodio 0,85< 0,9%, se llama solución salina normal o fisiológica
o “suero fisiológico”.

2. ¿Cuáles son las causas de la hipernatremia?

El exceso de sodio en la sangre puede ser ocasionado por ciertas

condiciones.

Las causas específicas de la hipernatremia incluyen:

 Deshidratación o pérdida de fluidos corporales por vómitos

prolongados, diarrea, sudoración o fiebre alta.
 Deshidratación por no beber la cantidad suficiente de agua.
 Fármacos tales como esteroides, regaliz y ciertos
medicamentos para disminuir la presión sanguínea.
 Ciertas enfermedades endocrinológicas como diabetes
(cuando la orina es muy frecuente) o aldosteronismo.
 Ingestión excesiva de sal.
 Hiperventilación (respiración demasiado rápida).

En todos los casos, la hipernatremia y por lo tanto la

hipertonicidad plasmática, induce la salida de agua del espacio
celular al extracelular, lo que produce disminución del volumen
celular. La disminución del volumen neuronal se manifiesta
clínicamente por síntomas neurológicos: letargia, reflejos
hiperactivos, temblor muscular, convulsiones y coma. Con
frecuencia, sobre todo en personas ancianas, se producen
trombosis de los senos venosos craneales, y, al disminuir el
tamaño del cerebro, hemorragias cerebrales por tracción de las
 estructuras vasculares. La salida del agua celular al espacio
extracelular tiende a preservar la volemia, por lo que al principio
no son aparentes los síntomas y signos de hipovolemia, que
pueden aparecer, hasta la situación de shock, en fases
avanzadas.

3. ¿Cómo se comportaría el eritrocito en un estado de

hipernatremia?

Cuando sobreviene la hipernatremia, todas las células del

organismo se reducen en tamaño, que es proporcional al grado
de reducción del volumen celular; sin embargo, los mecanismos
regulatorios internos permiten restaurar, en muchas células, su
volumen casi normal. Los eritrocitos y las neuronas tienen esta
habilidad para regular su volumen. Una vez que han pasado más
de 48 horas de hipernatremia; es decir, el inicio de considerarse
crónica, tendrá un volumen normal a expensas del contenido de
solutos intracelular aumentado. En ese momento, rápidamente se
restaura la osmolaridad que originará una “hinchazón” celular, lo
que en la mayor parte de los órganos del cuerpo no tendrá mayor
consecuencia; sin embargo, en el cerebro es devastadora, pues
aparecen: edema cerebral, herniación y la muerte. De ahí la
importancia del tratamiento cauteloso en la hipernatremia crónica.

VI. CONCLUSIONES

A menor concentración de NaCl se incrementa el porcentaje de

hemolisis, debido a que ingresa agua al eritrocito liberando
hemoglobina. La variación del porcentaje de hemolisis influye
directamente con la lectura de las absorbancias.

En un ambiente salino se produce mayor cantidad de hemolisis

comparado con un ambiente normal. La temperatura del hielo obtiene
la menor hemolisis debido a que conserva a los eritrocitos sin ningún
cambio y por consiguiente no hay liberación de hemoglobina.
VII. DISCUSIONES

Para ésta evaluación tomamos en cuenta que los resultados

obtenidos son de una especie de caballo sana y joven. Los efectos
de temperatura, salinidad y pH frente a una muestra de sangre se
ven influenciada de acuerdo a las condiciones inmunológicas del
animal (Forchetti, 2006).

Los márgenes de error para nuestros resultados se obtuvieron en las

lecturas de las absorbancias, para i) la temperatura: sabemos que la
temperatura fisiológica es 37ºC y el porcentaje de hemolisis debe ser
mínimo o nulo; sin embargo en los resultados obtenidos no se
coincide esta afirmación; ii) el pH: de la misma forma, sabemos que
el pH fisiológico es 7,4 y su hemolisis debe ser mínima; pero nuestras
lecturas nos indican lo distinto comparadas con lo normal (Chihuailaf,
2006).

VIII. REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS

 Granados J, Fragilidad osmótica de los eritrocitos de carnero en

relación con su uso en el laboratorio clínico, Hospital de San Juan
de Dios, Costa Rica, 1993.

 Hariharan S.: Nutrition of laboratory animals. LAIS Centre News

1984; 12: 2- 35.

 Lovelock J, La hemolisis de células sanguíneas por congelación y

descongelación, Instituto Nacional para la investigación médica,
Londres – Inglaterra, 1953.

 Zou CG, Haemolisis of human and sheep redblood cells in glycerol

media: the effect of pH and the role of band 3. School of biological
science. Inglaterra. 2000.

 Forchetti, O.; Maffrand C.; Vissio C.; Boaglio C.; Cufré G..
Hipofosfatemia y fragilidad osmótica eritrocitica en cabras. Revista
Electrónica de Veterinaria, Vol. VII, nº 01, Enero/2006

 Chihuailaf R H . Variaciones de la Fragilidad Osmótica Eritrocitaria

en Bovinos a Pastoreo sobre praderas con bajo contenido de Selinio
y Suplementados o no con Selenio, Instituto de Ciencias Clínicas
Veterinarias. Chile, 2006

 http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S08642892002000100001&script
=sci_arttext