REPORTE DE LABORATORIO

PRÁCTICAS 8 Y 9

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE

AMILASAS, CELULASAS, PECTINASAS, LIPASAS Y PROTEASAS Y EVALUACIÓN
CUANTITATIVA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA AMILOLÍTICA MEDIANTE TÉCNICA
DNS
María Alejandra Velásquez Guzmán Daniela Alejandra Torres Torres
velasquez.malejandra@javeriana.edu.co torres_dalejandra@javeriana.edu.co

NOTA: 4.7 Con formato: Fuente: Negrita

Pontificia Universidad Javeriana, Programa de Microbiología Industrial

1. Resultados práctica 8 1.0/1.0

A partir de una muestra de agua residual de cocina se evaluó la actividad de las diferentes
enzimas.

1.1.Evaluación cualitativa de actividad enzimática de los datos experimentales.

La Tabla 1 registra los datos de UFC/mL totales, UFC/mL con halo y el porcentaje de población
enzimáticamente activa correspondientes a cada medio evaluado en los datos experimentales.
Tabla 1. Recuento total y específico sobre sustrato inductor de actividad enzimática.

Actividad Porcentaje población

UFC/mL con
enzimática Medio Dilución UFC/mL totales enzimáticamente
halos
evaluada activa (%)
Amilolítica Almidón 10-4 1.53𝑥107 6.85𝑥106 44.8
Celulolítica Celulosa 10-2 ND ND ND
Pectinolítica Pectina 10-1 >101 Sin halos 0
Proteolítica Leche 10-4 ND ND ND
Lipolítica Tributirina 10-3 ND ND ND

Los datos registrados en la Tabla 2, corresponden al diámetro del halo de las colonias que fueron
significativas en el medio almidón y la coloración de Gram de cada colonia seleccionada.
Tabla 2. Recuento total y específico sobre sustrato inductor de actividad enzimática

Diámetro (mm) de
Medio evaluado Colonias de interés Coloración de Gram
halos de hidrólisis de
 las colonias más
representativas **
Bacilos Gram
Colonia 1 5
positivos
Almidón
Bacilos Gram
Colonia 2 8
positivos

1.2.Evaluación cualitativa de actividad enzimática de los datos experimentales internos.

Las Tablas 3 y 4 corresponden a los datos experimentales internos, e incluyen coloración de Gram,
recuentos totales y de las colonias que presentaron halo con sus respectivos diámetros.
Tabla 3. Recuento total y específico sobre sustrato de actividad enzimática.

Porcentaje
UFC/mL o
UFC/mL o población
Medio g con
g totales enzimáticamente
halos
activa (%)
Pectina 2.50E+03 2.00E+02 8
*Leche 2.35E+05 3.20E+05 136.17
Tributirina 8.50E+04 3.60E+04 42.35
*En el medio leche el recuento UFC/mL fue mayor con halo que el recuento total.
Tabla 4. Halos de hidrolisis sobre sustrato específico.

Diámetro de los halos de

Colonia de hidrolisis en las colonias más
Medio Coloración de Gram
interés representativas (mayor de 5 mm
diámetro)
Pectina Colonia 1 6 Bacilos Gram positivos
Colonia 1 10 Bacilos Gram positivos
Leche Colonia 2 12 Bacilos Gram positivos
Colonia 3 6 Bacilos Gram positivos
Tributirina Colonia 1 5 Bacilos Gram positivos

Interpretación 1.0/1.0 Con formato: Fuente: Negrita

La evaluación de la muestra analizada, correspondiente a los datos experimentales, reveló la

presencia exclusiva de microorganismos con actividad amilolítica. Desde una perspectiva
macroscópica, se identificaron morfotipos diversos de colonias blanquecinas, con variados
tamaños, especialmente de tamaño mediano y pequeño, algunas opacas y otras brillantes; además,
 no se percibió un olor específico. En la observación microscópica, se identificaron bacilos Gram
positivos.
De las 68 colonias con actividad enzimática, solo dos exhibieron un halo real (>5mm), indicando
actividad enzimática significativa. Este fenómeno se traduce en que solo el 44.8% de la población
total posee actividad enzimática significativa, específicamente en el contexto amilolítico.

Como se observa en la Tabla 1, los datos correspondientes a la evaluación de la actividad

celulolítica, proteolítica y lipolítica se registraron como ND debido a inconvenientes durante la
práctica. Se identificó contaminación en el medio CMC, se observó un crecimiento masivo en el
medio de Pectina y se evidenció una homogenización inadecuada en el medio de Tributirina. Por
lo tanto, no fue posible llevar a cabo el recuento total de unidades formadoras de colonias por
mililitro (UFC/mL), determinar halos de hidrólisis, ni evaluar la actividad de estas enzimas.

A partir de los datos experimentales internos registrados en la Tabla 3, se aislaron microrganismos

con actividad pectinolítica y lipolítica con porcentajes de actividad enzimática de 8% y 42.35%,
respectivamente. Sin embargo, aunque se reportó actividad proteolítica en el medio Leche, estos
datos se anularon ya que el recuento de UFC/mL con halo fue mayor al recuento de la población
total.
Como se observa en la Tabla 4, en los medios Pectina y Tributirina solo se evidenció 1 colonia
con halo real, para el primer caso de 6 mm y para el segundo, 5mm de diámetro. Adicionalmente,
las dos colonias se caracterizaron al microscopio como bacilos Gram positivos.

2. Resultados práctica 9 1.0/1.0

Se evaluó la actividad enzimática amilolítica producida por un cultivo de Bacillus licheniformes
mediante la técnica cuantitativa DNS.

2.1.Evaluación cuantitativa de actividad enzimática de los datos experimentales.

La Tabla 5 contiene los datos experimentales correspondientes a la evaluación de actividad
amilolítica, producida por el microorganismo Bacillus licheniformes, incluyendo los datos del
recuento de UFC/mL, la coloración de Gram, el promedio de UA, la desviación estándar y el %CV
correspondientes a dos réplicas.
Tabla 5. Evaluación cuantitativa de la actividad amilolítica de Bacillus licheniformes.

Hora Unidad amilolítica (UA) Gram UFC/mL

(h)
R1 R2 Promedio DS %CV R1 R2 R1 R2
Bacilos Gram
0 28.8 49.9 39.35 14.9200 37.9160 - ND -
positivos
 Bacilos Gram Bacilos Gram
2 25.4 18.74 22.07 4.7093 21.3382 ND ND
positivos positivos

Bacilos Gram
4 14.62 - - - - - ND -
positivos

Bacilos Gram Bacilos Gram

6 3.89 7.22 5.555 2.3547 42.3882 ND ND
positivos positivos

Bacilos Gram Bacilos Gram

8 15.64 27.37 21.505 8.2944 38.5695 ND ND
positivos positivos

Bacilos Gram
10 0 - - - - - ND -
positivos

De las unidades amilolíticas evaluadas en todas las horas, ninguna de sus réplicas es útil para el
análisis cuantitativo enzimático, dado que sus réplicas superan el %20 de %CV, por ellos fueron
anuladas.

2.2.Evaluación cuantitativa de actividad enzimática de los datos experimentales internos.

Los datos de las Tablas 6 y 7 corresponden a los resultados experimentales internos de glucosa
residual (DNS 1) y el producto de la reacción enzimática (DNS 2). Además, incluyen los datos de
absorbancia a 540 nm de cada replica, los factores de dilución, las concentraciones en g/L de cada
replica y los cálculos estadísticos de promedio, desviación estándar y %CV.
Tabla 6. Resultados datos de control interno para sustrato residual (DNS 1).

Abs 540 nm Concentración g/L

Hora
R1 R2 R3 Fd R1 R2 R3 Promedio DS %CV
0 0.256 0.223 0.220 - 0.5024 0.4433 0.4379 0.4612 0.0358 7.76
0.5 0.263 0.268 0.260 - 0.5150 0.5239 0.5096 0.5162 0.0072 1.40
1 0.270 0.300 0.290 - 0.5275 0.5812 0.5633 0.5573 0.0274 4.91
1.5 0.278 0.275 0.281 - 0.5418 0.5364 0.5472 0.5418 0.0054 0.99
2 0.287 0.276 0.268 - 0.5579 0.5382 0.5239 0.5400 0.0171 3.16
4 0.307 0.287 0.317 - 0.5938 0.5579 0.6117 0.5878 0.0274 4.65
6 0.201 0.201 0.206 2 0.8078 0.8078 0.8257 0.8138 0.0103 1.27
8 0.175 0.165 0.160 2 0.7147 0.6788 0.6609 0.6848 0.0274 4.00
10 0.125 0.131 0.127 2 0.5356 0.5570 0.5427 0.5451 0.0109 2.01
12 0.096 0.105 0.110 3 0.6475 0.6959 0.7227 0.6887 0.0381 5.54

Prueba de cálculo (formulas)

 Concentración g/L
𝑦+𝑏
𝑥=
𝑚

Tabla 7. Resultados datos de control interno para producto Rxn E+S (DNS 2).

Abs 540 nm Concentración g/L

Hora
R1 R2 Fd R1 R2 Promedio DS %CV
0 0.167 0.174 2 0.6860 0.7111 0.6985 0.0177 2.54
0.5 0.175 0.181 2 0.7147 0.7362 0.7254 0.0152 2.10
1 0.189 0.192 2 0.7648 0.7756 0.7702 0.0076 0.99
1.5 0.196 0.199 2 0.7899 0.8006 0.7953 0.0076 0.96
2 0.208 0.196 2 0.8329 0.7899 0.8114 0.0304 3.75
4 0.23 0.217 3 1.3675 1.2977 1.3326 0.0494 3.71
6 0.132 0.147 3 0.8409 0.9215 0.8812 0.0570 6.47
8 0.16 0.168 4 1.3219 1.3792 1.3505 0.0405 3.00
10 0.144 0.147 5 1.5090 1.5359 1.5225 0.0190 1.25
12 0.132 0.136 5 1.4016 1.4374 1.4195 0.0253 1.78

La Tabla 8 registra el recuento (UFC/mL), los datos de glucosa real, las unidades amilolíticas
(μmol/min *L), para determinar las UA se consideraron las concentraciones en g/L de DNS1 y
DNS2 y las condiciones de prueba que correspondieron a un tiempo de prueba de 30 min y el factor
de la dilución de reacción que fue 2.
Tabla 8. Resultados de control interno de glucosa real y unidades amilolíticas.

Recuento (UFC/mL)
Hora Glucosa real Glucosa*min*L Unidades amilolíticas (UA)
Bacillus licheniformes
0 0.4679 86.6553 173.31 3.5E+08
0.5 0.4673 86.5447 173.09 2.50E+09
1 0.4915 91.0226 182.05 6.50E+11
1.5 0.5244 97.1036 194.21 9.60E+11
2 0.5414 100.2547 200.51 3.30E+12
4 1.0387 192.3553 384.71 5.40E+12
6 0.4744 87.8438 175.69 8.30E+13
8 1.0081 186.6889 373.38 2.10E+14
10 1.2499 231.4677 462.94 5.80E+15
12 1.0751 199.0998 398.20 3.90E+14

Prueba de cálculo (ejemplo con la hora 0)

 Glucosa real
0.4612
0.6985 − ( ) = 0.4679 𝑔/𝐿
2

 Glucosa*minuto*L
0.4679 𝑔 1 𝑚𝑜𝑙 16 𝜇𝑀𝑜𝑙 𝜇𝑀𝑜𝑙⁄
∗ ∗ = 86.6553 min∗ 𝐿
30 𝑚𝑖𝑛 ∗ 𝐿 180 𝑔 1 𝑚𝑜𝑙

 Unidades amilolíticas (UA)

𝜇𝑀𝑜𝑙⁄
86.6553 min∗ 𝐿 ∗ 2 = 173.31 𝑈𝐴

La Figura 1 representa a partir de un gráfico combinado la curva de crecimiento de Bacillus

licheniformes en UFC/mL y las unidades amilolíticas (UA) en función del tiempo evaluado.

7,0E+15 500,00
450,00
6,0E+15
Unidades amilolíticas (UA)

400,00
5,0E+15 350,00
300,00
UFC/mL

4,0E+15
250,00
3,0E+15 200,00
2,0E+15 150,00
100,00
1,0E+15
50,00
0,0E+00 0,00
0 0,5 1 1,5 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)

UFC/mL Unidades amilolíticas (UA)

Figura 1. Actividad amilolítica y biomasa de Bacillus licheniformes, correspondiente a los datos

experimentales internos.
La Figura 2 representa a partir de un gráfico combinado la curva de crecimiento de Bacillus
licheniformes en UFC/mL y las unidades amilolíticas (UA) en función del tiempo evaluado, sin
incluir la hora 6.

7,0E+15 500,00
450,00
6,0E+15

Unidades amilolíticas (UA)

400,00
5,0E+15 350,00
300,00
UFC/mL

4,0E+15
250,00
3,0E+15 200,00
2,0E+15 150,00
100,00
1,0E+15
50,00
0,0E+00 0,00
0 0,5 1 1,5 2 4 8 10 12
Tiempo (h)

UFC/mL Unidades amilolíticas (UA)

Figura 2. Actividad amilolítica y biomasa de Bacillus licheniformes, correspondiente a los datos

experimentales internos.

Interpretación 1.0/1.0
A partir de los resultados experimentales registrados en la Tabla 5 no fue posible cuantificar la
actividad amilolítica de Bacillus licheniformes, ya que se anularon los resultados por incoherencia
entre las réplicas ya que, al calcular los promedios de las UA y la desviación estándar, los %CV
superaron el porcentaje permitido (>20%). Esto pudo ocurrir debido a errores de manipulación a
lo largo de la práctica.
Los resultados experimentales internos registrados en las Tablas 6, 7 y 8 se emplearon para calcular
las unidades amilolíticas producidas por Bacillus licheniformes a lo largo del tiempo de
crecimiento evaluado.

Las Figuras 1 y 2, describen cómo a medida que aumenta el tiempo, tanto la biomasa del
microorganismo como su capacidad de producir unidades enzimáticas amilolíticas aumenta
también; sin embargo, como se observa en la Figura 1, la hora 6 disminuyó la cantidad de UA por
lo que se decidió eliminar esta hora y se construyó la Figura 2, allí se identificó que la hora 10
presentó la mayor producción de enzima amilolítica (462.9353 UA) y una producción de biomasa
de 5.80E+15 UFC/mL correspondiente al final de la fase exponencial.
Conclusiones 0.7/1.0
 Es posible concluir que se cumplió el objetivo de la práctica 8, debido a que a partir de la
muestra de agua residual de cocina se determinó actividad enzimática, sin embargo, se
puede afirmar que su población microbiana no fue tan diversa ya que no presentó actividad Comentado [JMT1]: Evaluar la diversidad, no era parte de los
objetivos.
de enzimas diferentes a las amilasas.
 A partir de los datos experimentales internos correspondientes a la práctica 9 fue posible
evaluar la actividad enzimática de Bacillus licheniformes e inferir que está actividad está
relacionada con las fases de crecimiento.