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“Año del Diálogo y la Reconciliación Nacional”

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO


FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS.

Escuela Académica Profesional de Ciencias Biológicas.

Efecto del extracto acuoso de Semillas de Moringa


oleifera en larvas de Spodoptera eridania en
condiciones de laboratorio.

AUTORES:

Rojas Moreno Wilmer Joel.

Roncal Alayo Elmer Martin.

ASESOR:

Castro Malabrigo Victor.

Trujillo-PERÚ.

Abril - 2018
PLAN DE INVESTIGACIÓN

1. ANTECEDENTES

Las lectinas son proteínas que han sido referidas como proteínas de
defensa natural que se encuentran en las plantas y animales
(Gaidamashvili et al., 2009)

Estudios encontraron que las lectinas ejercen un gran número de


propiedades biológicas dentro de las cuales podemos enumerar la
aglutinación de células, la estimulación mitogénica de linfocitos, inducción
de células supresoras, reconocimiento de receptores de membrana,
detección de tumores e interacciones de tipo hospedero patógeno
(Sharon y lis, 2004).

De todas las lectinas de plantas estudiadas, la lectina Galanthus nivalis


(GNA), fue una de las primeras que reportó efectos perjudiciales sobre el
crecimiento y desarrollo de insectos, dichos estudios reportan toxicidad
de GNA en dietas artificiales y en plantas transgénicas, sobre larvas del
orden Lepidoptera (Sadeghi et al., 2008)

Investigaciones mostraron que después de la ingestión de semillas de


plantas o tejidos, las lectinas son liberadas de las estructuras celulares y
entran en contacto con las estructuras de carbohidratos presentes en el
intestino de insectos causando un efecto sobre el organismo (Vandeborre
et al., 2011).

Ferreira et al. (2009) reportó la actividad larvicida de (LC50 de 1260 lg


mL1 ) sobre A. aegypti L3 de extractos de semillas en Moringa oleifera
Lamarck y también demostró la baja toxicidad del extracto sobre Daphnia
magna, Mus musculus and Rattus novergicus.
Caccia et al. (2012), reportó actividad entomotóxica de lecitinas sobre
larvas de spodoptera sp, quedando un 34% de larvas en instar 2. De igual
forma las larvas alimentadas con lecitina, mostraron una disminución en
peso individual.

2. JUSTIFICACIÓN

Estudios anteriores han demostrado que Moringa oleífera no solo


puede usarse en la alimentación sino también presenta actividad
antimicrobiana y también como un insecticida, esto gracias a extractos
obtenidos de las distintas partes de la planta. Ante la problemática de
muchos agricultores la afección de Spodoptera eridania, se pretende
ampliar el campo de posibilidades para un mejor control de la plaga
previamente en laboratorio y su posible aplicación en campo.

3. PROBLEMA

¿Cuál es el efecto entomotóxico del extracto de semillas de Moringa


oleífera sobre el crecimiento larval de Spodoptera eridania?

4. HIPOTESIS

El extracto acuoso de semillas de Moringa oleífera presentará efecto


entomotóxico sobre el crecimiento en larvas de Spodoptera eridania

5. OBJETIVOS

a. General

Demostrar el efecto del extracto acuoso de semillas de Moringa


oleífera sobre larvas de Spodoptera eridania.
b. Específicos

Obtener el extracto acuoso de semillas de Moringa oleifera.

Determinar la toxicidad del extracto acuoso de semillas de M.oleifera


sobre Artemia salina

Evaluar la entomotoxicidad del extracto acuoso de semillas de M.


oleifera en larvas de S. eridania

5. METODOLOGIA DE TRABAJO

Para la obtención de la lectina de las semillas de M. oleífera se realizará


una combinación de técnicas de cambios de temperatura y sucesivas
extracciones salinas y acidas. Primero se aplicara un pretratamiento a las
semillas con hipoclorito de sodio (NaClO). El proceso iniciara con el molido
de las semillas y posterior tamizado del polvillo obtenido en un tamiz
número 20. A continuación tomaremos 10 g de la harina y mezclamos con
50 ml de solución salina dejándolo reposar por 24 horas a 4 °C con
agitación constante.

La mezcla que se obtendrá será centrifugada a 3 000 rpm durante 20 min,


al sobrenadante que será tratado por 30 min a 60 °C, luego será
congelado a -20 °C por 48 h. Pasado ese tiempo se descongelará y será
centrifugado a 3 000 rpm por 20 min. Al nuevo sobrenadante obtenido se
le adicionará HCl hasta llevarlo a una concentración de 0.1 N y será
incubado a 40 °C durante 24 h, este será centrifugado nuevamente
durante 20 min a 3 000 rpm y el precipitado será desechado, el
sobrenadante será dializado con solución salina por espacio de 24 h. La
presencia de la proteína será determinado en un espectrofotómetro a una
densidad óptica de 280 nm, según la ley de Lambert Beer, se espera que
la concentración final de 250 mg/mL y posteriormente se liofilizó.
BIOENSAYO

Como el material biológico se empleara larvas de Spodoptera eridania,


estas serán criadas en el laboratorio de Crianza y Manejo de Plagas, del
Pabellón Antonio Samanamud en la Universidad Nacional de Trujillo. Los
ensayos se realizaran por el método de ingestión, pues consideraremos
que la cutícula de las larvas es impermeable a esta solución acuosa.

Se tomaran larvas en sus diversos estadios larvales, a los cuales se les


adormecerá por descenso de temperatura, estos serán agrupado en
grupos de 3 individuos cada grupo en vasos plásticos de 150 ml con tapa
de malla, donde previamente se colocaran viales con el extracto diluido
en agua azucarada al 2 % y tapados con una mota de algodón. El extracto
se utilizara en concentraciones de 1 000, 100, 10 p.p.m. Cada prueba se
replicará 3 veces con su testigo. La mortalidad se registrará a las 24, 48 y
72 h de aplicado la dosis.

Con vistas a determinar la influencia del extracto sobre el desarrollo de los


estadios inmaduros, se medirán las pupas con una regla y se hará
mediante la prueba estadística Turkey.

BIOENSAYO DE TOXICIDAD DE Artemia salina Leach.

Preparación de Agua Salina.


Se disolverá 38 g de sal de mar en 1 L de agua destilada, filtrar la
solución.
Preparación de la Cámara de Incubación
Como cámara de incubación se usaran una jabonera con base de
ranuras longitudinales. Cortar la tapa las ¾ partes, se forrara con papel
lustre negro y se colocara una división de tecnopor.
Incubación de las Larvas de Camarón
Colcada la división de tecnopor, se observara 2 cámaras; una cámara
iluminada (más pequeña) y una cámara oscura.
Se colocara aproximadamente 30 mL de agua salina, seguidamente se
agregara 50 mg de huevos de Artemia salina en la que será la cámara
oscura, se tapara bien y se procederá a iluminar con una lámpara
durante 24 a 48 h.
Durante este tiempo las larvas deben eclosionar y legro migraran por
fototropismo hacia la parte iluminada de modo que este será un buen
método de separación de larvas, las cuales serán usadas en este
ensayo.
Procedimiento del Ensayo.
Se disolverá 20 mg de la muestra en 20 mL de disolvente. El disolvente
dependerá de la polaridad de la muestra: las muestras polares se
disuelven en 2 mL de agua destilada y las muestras apolares en 0.5 mL
de DMSO y 1.5 mL de agua destilada.
A partir de esta solución se prepararan diluciones de 1 000, 100 y 10
μg/mL, para lo cual se añadirá 500, 50 y 5 μL de solución a 9 viales (3
por cada concentración).
A cada vial se agregara 10 nauplios (larva de camarón que eclosionara)
y se completara a 5 mL cada vial con agua salina. Luego se colocara
los viales a la luz de la lámpara durante 24 h, después de este tiempo
se contaran anotando el número de muertos y sobrevivientes en cada
dilución.
Calculo de la DL50
Para el cálculo de la DL50 se aplicara el programa “Artemia”
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• Caccia et al. (2012). Mechanism of Entomotoxicity of the plant lectin


from hippeastrum hybrid ( Amaryllis) in Spodoptera littoralis larvae.
journal of insect physiology. Pages 1177-1183.

• Ferreira, P.M.P., Carvalho, A.F.U., Farias, D.F., Cariolano, N.G., Melo,


V.M.M., Queiroz, M.G.R., Martins, A.M.C., Machado-Neto, J.G., 2009.
Larvicidal activity of the water extract of Moringa oleifera seeds against
Aedes aegypti and its toxicity upon laboratory animals. Anais Acad.
Brasil. Ciên. 81, 207–216.

• Gaidamashvili, M., Ohizumi, Y., Ogawa, T., Muramoto K. (2009).


Binding of the insecticidal DB1 lectin in Helicoverpa armigera (Hϋbner)
Midgut Epithelia. Plant Physiology. Bulletin of the Georgian National
academy of Sciences. 3 (2): 147-149.
• Sadeghi, A., Smagghe G., Broeders, S., Hernalsteens, J.P., De Greve,
H., Peumans, W., Van Damme E. (2008). Ectopically expressed leaf
and bulb lectins from garlic ( Allium sativum) protect transgenic tobacco
plants against cotton leafworm (Spodoptera littoralis). Transgenic Res.
17: 9-18

• Sharon N. and Lis H. (2004). History of Lectins: from hemagglutinins to


biological recognition molecules. Glycobiology. 11: 53-62.

• Vandenborre, G., Smagghe, G., Van Damme E. (2011). Plant lectins as


defense proteins against phytophagous insects. Phytochemistry 72:
1538-1550.