Cinética de

crecimiento de los
microorganismos
Universidad Autónoma de Chihuahua

YAEL ERNESTO GALLARDO CASTANEDA

RUBEN MARQUEZ MELENDEZ
Resumen.
A lo largo del desarrollo de esta practica se denotará el uso de técnicas cualitativas y
cuantitativas para el conteo de células en una muestra, asi como al determinación de
variables de interés de dicho microorganismo tales como la tasa de crecimiento especifico,
el tiempo de duplicación y la tasa de crecimiento especifico máximo, con un análisis
colorimétrico y directo en el caso del conteo de células con ayuda de una cámara de
neubauer.

Palabras clave: Levadura, tasa de crecimiento especifico, tasa de crecimiento especifico

máximo, conteo directo al microscopio, dilución, colorimetría, células

Introducción.
En cuanto al crecimiento microbiano, se debe de tener en cuenta que crecimiento
tiene una relacion en tanto a la palabra multiplicación, por lo que esto hace referencia al
incremento del número de células. El crecimiento de la mayoría de los microorganismos
procariotas ocurre por fisión binaria, es decir, que a partir de una célula se forman dos.
Durante este proceso todos los materiales estructurales de la célula se duplican. Teniendo
en cuenta estas situaciones se tiene que la definición de crecimiento microbiano al
incremento de numero de células microbianas de una población. Y por tanto la velocidad
de crecimiento es el incremento de numero de células o masa celular por unidad de tiempo.
La velocidad característica para cada tipo de microorganismo y medio de cultivo (sustrato).
Por otro lado, el tiempo de generación es el tiempo requerido para que, a partir de una
célula, se forman dos células, es el tiempo en el que la población microbiana se duplica, por
lo que a este tiempo también se le llama tiempo de duplicación y esta variable es totalmente
dependiente del tipo de microorganismo, de las condiciones del medio, de la temperatura
y de la presión.

Dentro del crecimiento microbiano, se tienen varias fases, de entre las cuales están:

• Fase de latencia: Es la fase de adaptación del microorganismo en la cual el número

de microorganismos permanece constante
 • Fase logarítmica o exponencial: Esta es la fase en la cual los microorganismos se
replican con rapidez.
• Fase estacionaria: Esta es la fase en la cual no
varía el número de microorganismos debido a
la disminución de la cantidad de sustrato
• Fase de muerte: Esta es la fase donde los
microorganismos comienzan a morir debido a
la nulificación del sustrato en el medio de
cultivo Ilustración 1 Representación gráfica de las fases
de crecimiento microbiano

Para la facilitación de diversas

condiciones se han propuesto y realizado
múltiples herramientas que facilitan el
conocimiento de la supervivencia y
crecimiento de diferentes
microorganismos, en este caso se estudia la
base de datos “ComBase” en la que se
especializa en microorganismos patógenos

Ilustración 2 Base de datos ComBase en distintas condiciones ambientales y

conjuntos de herramientas de software
predictivo basadas en los mismos datos.

Dentro de este software se exploran distintas herramientas ofrecidas por el mismo, se

tiene un buscador en el cual se encuentran miles de curvas de crecimiento bacteriano que
han sido cotejadas y realizadas por múltiples laboratorios, institutos de investigación y
publicaciones, se encuentra a su vez un predictor el cual es una herramienta que predice el
crecimiento o inactivación de los microorganismos existentes en la base de datos, también
existen modelos predictivos y recursos varios que ayudan a la predicción e investigación de
curvas de crecimiento.

De entre las variables que afectan al crecimiento bacteriano están:

• Temperatura de almacenamiento: Este es uno de los parámetros ambientales

mas importantes, en este caso cada microorganismo tiene una temperatura
 mínima, optima y máxima de crecimiento. En el caso de la temperatura optima
es cuando se obtiene la velocidad máxima de crecimiento, pasa lo contrario si la
temperatura del microorganismo se encuentra lejos de la temperatura optima,
ya que en ese caso la velocidad de crecimiento se verá aminorada.
• pH del sustrato: En el caso de la acidez y pH del medio los microorganismos
también tienen un pH mínimo, optimo y máximo, y los limites de pH en los que
el microorganismo puede crecer varían mucho según el tipo de microorganismo
del que se trate. Muchos de los microorganismos crecen a una velocidad optima
a un pH de 7, pero muestran velocidades de crecimiento aceptables en torno a
valores de 5 y 8, mas sin embargo este valor también se adecua a cada tipo de
microorganismo, los cuales tendrán cada uno un valor propio según la especie y
género.
• Aw del alimento: Esta variable hace referencia a la cantidad de agua disponible
en un sustrato, esto debido a que el agua existente en un sustrato no se mide en
términos de fracciones o porcentaje, sino mediante el parámetro antes
mencionado, el valor de aw esta dado por una relacion entre la presión de vapor
de agua en el sustrato y la presión de vapor del agua pura, según la siguiente
formula.

𝑃𝑣 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑒𝑛 𝑒𝑙 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜

𝑎𝑤 =
𝑃𝑣 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑝𝑢𝑟𝑎

Como se puede ver el valor de aw debe de oscilar entre 0 y 0.1 al tratarse de una
fracción, este es un valor intrínseco de cada sustrato y tiene una gran influencia en el
crecimiento microbiano, cuya relevancia a nivel industrial es tal, que muchos métodos de
conservación se relacionan con modificar la aw para inhibir o retrasar el crecimiento
bacteriano.

Para especificar la cantidad de gramos de biomasa que es capaz de generar cada

gramo de biomasa por unidad de tiempo, se tiene la siguiente definición:

1 𝑑𝐶
𝜇= ∗
𝐶 𝑑𝑡
 Donde por lo tanto µ tiene dimensiones de inverso al tiempo (h-1). Un caso
interesante es cuando el medio se encuentra en las condiciones de saturación de nutrientes
donde µ es constante e igual a la máxima correspondiente a la temperatura establecido para
el medio. Existe una µmax optima la cual sucede cuando se tiene una concentración de
nutrientes cercana al punto de saturación mientras que se esta en la temperatura optima
del microorganismo

Ilustración 3 Grafica de biomasa vs tiempo

Hipótesis.
Se desarrollarán graficas que expliquen el comportamiento del crecimiento
bacteriano de una cepa, logrando asi obtener el valor de la velocidad de crecimiento
especifica, asi como obtener su valor máximo, haciendo uso de técnicas directas e
indirectas, a su vez de que se pretende obtener valores por triplicado de las gráficas
planteadas.

Objetivos
• Desarrollar graficas de cantidad de biomasa vs tiempo y de absorbancia vs tiempo
• Calcular valores de velocidad de crecimiento especifica, asi como su valor máximo,
constante de semi-saturacion de sustrato y otros valores obtenidos a través de la
graficación.
• Desarrollar métodos de linealización para datos de crecimiento bacteriano

Metodología.
Para el desarrollo de la práctica se necesitó: 10 muestras de agares conformados por:
extracto de levadura, peptona y dextrosa estas tienen que estar en estado liquido en
matraces Erlen Meyer, un inoculo de una muestra bacteriana de un hongo que será usado
como inoculo, un espectrofotómetro, una cámara de neubauer, un microscopio, celdas de
cuarzo para el análisis colorimétrico, autoclave, dos pipetas esterilizadas, un propipetero 3
vías, agua destilada y una incubadora.

Primeramente, será necesario asegurarnos de que nuestras muestras de agar,

pipetas y propipetero se encuentren estériles, esto haciendo uso del autoclave, una vez
realizada la esterilización, se comenzara a realizar el inoculo en el caso de contar con 150ml
de agar se usarán 8ml de inoculo y en el caso de tener muestras de 250ml se requerirán de
12ml. En nuestro caso se usaron 5 muestras de 250ml y 5 muestras de 150ml, una vez
realizado el inoculo en todos los matraces se dejaron en la incubadora a 30°C durante 3
horas, las cuales la transcurrir se tomo una muestra y se realizo un conteo con microscopio,
con ayuda de la cámara de neubauer siguiendo la siguiente técnica de conteo.

Ilustración 4 técnica de conteo en Cámara de

neubauer

En este caso y como puede verse en la imagen 4, los cuadrantes localizados en las
esquinas y el cuadrante central serán los relevantes para un buen conteo, una vez aclarada

Tabla 1 Formato de vaciado de datos

la técnica para el conteo, será necesario aclarar los tiempos de conteo de células, los cuales
serán bajo la siguiente tabla.

Donde se puede ver que las primeras dos tomas de datos serán cada 3 horas después
de realizado el inoculo, a partir de ahí se realizarán cada 2 horas hasta terminar todas las
muestras de cultivos. Para realizar la toma de absorbancia se hará uso de un
espectrofotómetro donde se colocara una muestra de cultivo en una celda y se registrará la
absorbancia obtenida, mas sin embargo, en caso de que el conteo se complique por la
densidad celular que exista en el microscopio o que el valor de la absorbancia sea un valor
mayor a 1, será necesario diluir la muestra y tomar en cuenta el factor de dilusión a la hora
de registrar los datos según las fórmulas:

𝜀 = (𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑔𝑖𝑠𝑡𝑟𝑎𝑑𝑎) ∗ (𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑎𝑔𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑎)

1
((𝑛𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠) ∗ (𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑎𝑔𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑎) ∗ ( ))
𝑛𝑜. 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 . 02𝑚𝑚
=
𝑚𝑙 0.001

Los datos obtenidos serán registrados en la tabla para su posterior análisis, ya que,
con ellos, serán con los que se construirán las gráficas y se linealizarán por el método
seleccionado.

Resultados.
Posteriormente pasadas las 24 horas se obtuvieron los siguientes resultados:

Ilustración 5 Tabla con los datos pasadas las 22 horas

 Al haber llenado la tabla con los datos, se realizó el análisis de datos, en este caso
fue necesario realizar ajustes a la gráfica debido a las intermitencias de los datos, donde
primeramente se graficó el número de células por mililitro contra el tiempo teniendo asi la
siguiente grafica.

Posteriormente y como se puede ver se tuvo que omitir el 4 valor debido a la poca
precisión que este tendría a la hora de realizar el cálculo, al momento de graficar se debe
de observar el dato que indique el inicio de la fase de crecimiento exponencial del
microorganismo, teniendo asi que el inicio de dicha fase es a partir de la hora 10 y concluye
hasta la hora 18, por lo que al haber identificado dichos valores, será necesario construir
otra tabla con los datos de la fase exponencial, teniendo asi el siguiente resultado:

Ilustración 7 Tabla de datos de la

fase exponencial

Ilustración 6 Grafica de numero de células vs tiempo

Ilustración 8 Grafica del logaritmo natural del número de células

vs tiempo

Como se puede ver en la ilustración 7 al número de células se le aplico un logaritmo

natural esto con el fin de que a la hora de graficar se obtengan datos de una forma lineal y
evitar el comportamiento de curva que adopta este crecimiento, por lo que, a la hora de
graficar se obtuvo el resultado siguiente:

Gracias al software de Excel es sencillo obtener la ecuación de la gráfica, el cual será

de mucha utilidad para obtener la ecuación de la recta la cual contiene valores que se
adecuan a la siguiente expresión:

1 𝐾𝑠 1 1
= ∗ +
𝜇 𝜇max 𝑆 𝜇max

Mas, sin embargo, para la obtención de µ, haremos uso de la siguiente ecuación:

𝐿𝑛(𝑁𝑡 ) − 𝐿𝑛(𝑁0 ) = 𝜇 ∗ (𝑡 − 𝑡0 )

Donde despejando µ, obtenemos:

𝐿𝑛(𝑁𝑡 ) − 𝐿𝑛(𝑁0 )
𝜇=
𝑡 − 𝑡0

Para la sustitución de datos necesitaremos los datos obtenidos de la ilustración 7

donde t0 será 10, t será 18, N0 será 16.333 y Nt será 18.435. Una vez sustituidos los datos se
obtuvo el valor de µ igual a 0.262795291 el cual adquiere unidades de h-1, con esta
información podremos calcular el tiempo de duplicación según la siguiente expresión:
ln(2)
𝑡𝑑 =
𝜇

Y sustituyendo el valor del tiempo de duplicación especifico resulto ser 2.6375 horas.
Por ultimo se calculo el valor del tiempo de duplicación especifico máximo, con ayuda de la
siguiente expresión:

1 𝐾𝑠 1 1
= ∗ +
𝜇 𝜇max 𝑆 𝜇max

Donde con ayuda de la ecuación de la recta obtenido de la gráfica de la ilustración 7 y

sustituyendo el valor de b en el último término de la ecuación tenemos el que el valor del
tiempo de duplicación especifico máximo es igual a .07276432h-1

Conclusión.
 Según los objetivos planteados, la practica fue concluida con resultados
satisfactorios, mas sin embargo, se tuvieron irregularidades en tanto a la cuantificación de
las muestras resulta, esto debido a que, se realizaron en medidas de tiempo inexactas,
además de que la manipulación de la muestra no fue realizada en condiciones de esterilidad,
por lo que si bien, los resultados obtenidos se ajustan bien a la gráfica, aun se pueden
realizar estudios estadísticos mas exactos para la obtención de datos mas fidedignos en lo
que a las tasas de crecimiento refieren, asi como, la obtención de una ecuación general a
este microorganismo en este sustrato en especifico.