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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

PROGRAMA EDUCATIVO
QUÌMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

UNIDAD DE APRENDIZAJE VIROLOGÍA

MANUAL DE LABORATORIO

ELABORARON:
Dr. en C. JONNATHAN GUADALUPE SANTILLÁN BENÍTEZ
Dr. En C. ENRIQUE MORALES AVILA
Dra. en C. SARA VEGA GARCÍA
Septiembre 2014

1
Contenido

Introducción....................................................................................................................................... 3
Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje ................................ 4
Formato de la práctica y simbología ............................................................................................... 5
Evaluación del curso ......................................................................................................................... 6
Reglamento del laboratorio de Virología ........................................................................................ 7
Manejo de residuos peligrosos ......................................................................................................... 8
Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o diagnóstico. ............ 9
Práctica 2. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad alantoidea ............... 13
Práctica 3. Hemaglutinación .................................................................................................... 19
Práctica 4. Inoculación intracerebral de ratón lactante .............................................................. 22
Práctica 5. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers) ............................................ 26
Práctica 6. Cultivo Celular ............................................................................................................. 30
Práctica 7. Conteo Celular.............................................................................................................. 34
Práctica 8. Titulación Viral ............................................................................................................ 37
Práctica 9. Inhibición de la Hemaglutinación ............................................................................... 41
Práctica 10. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola ................................................... 44
Práctica 11. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus ..................................... 47

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Introducción

El término virus viene del latín veneno, se utilizó a finales del siglo XIX para describir a los
agentes más pequeños que las bacterias causantes de enfermedades. En 1940 el desarrollo
del microscopio electrónico posibilitó por primera vez, la visualización de los virus, años
después la centrifuga de alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos.

En la década de los 50’s con el desarrollo del cultivo celular, actual soporte de la replicación
viral, junto con la inoculación de huevos embrionado y el uso de algunos animales de
laboratorio, se descubren nuevos virus, la mayoría de los cuales fueron analizados en la
década de los 60’s y 70’s con el fin de determinar sus características físicas, químicas y
antigénicas para poder establecer las metodologías apropiadas para diagnosticarlos por el
laboratorio.

El diagnóstico de la etiología viral de las infecciones se ha ido generalizando gracias al


desarrollo tecnológico que ha permitido disponer de métodos cada vez más sencillos, rápidos
y económicos como las técnicas de biología molecular (PCR y RT-PCR). Se debe eliminar
la antigua creencia de que el diagnostico viral es costoso, sumamente tardío y de interés
puramente académico o epidemiológicos.

Es necesario crear en los profesionales de la salud la conciencia de la utilidad del diagnóstico


virológico rápido y de la disponibilidad de nuevos fármacos antivirales, las infecciones
virales impactan la calidad de vida de quienes la padecen, por lo tanto, un resultado correcto
y oportuno emitido por el laboratorio, permite contribuir al diagnóstico y seguimiento del
paciente.

Este manual está dirigido a los estudiantes del noveno semestre de la licenciatura de Químico
Farmacéutico Biólogo de la facultad de química de la UAEM y pretende proporcionar a los
alumnos los conocimientos y habilidades básicas para el manejo de las principales técnicas
diagnósticas de laboratorio relacionadas con las infecciones virales humanas.

El programa de prácticas está integrado por cuatro secciones:

1. Inoculación en embrión de pollo


2. Animales de laboratorio
3. Cultivo celular
4. Diagnóstico Inmuno virológico

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Congruencias con el contenido programático de la unidad de aprendizaje

Práctica Nombre de práctica Sesiones Tema


1 Constitución de un laboratorio de
virología de investigación o 1
diagnóstico.
2 Inoculación de huevo embrionado 2 1.3. Métodos de identificación y
en saco vitelino y cavidad purificación.
alantoidea 2.2. Relación virus huésped
3 Hemaglutinación 1 1.1. Relación virus célula.
4 Inoculación intracerebral de ratón 1 3.7. Manejo de animales de
lactante. laboratorio
5 Diagnostico rápido de virus rábico 1 1.3. Métodos de identificación.
(tinción de Sellers)
6 Cultivo celular 2 3.4. Nutrientes necesarios para la
replicación viral
7 Conteo celular 1 3.1 Preparación de medios de
cultivo de crecimiento y
mantenimiento viral
8 Titulación viral 1 3.0 Replicación viral
9 Inhibición de la Hemaglutinación 1 4.1. Métodos citológicos directos
10 Determinación de anticuerpos IgM 1 4.3. Métodos inmunoserológicos
anti-rubeola
11 Determinación de anticuerpos IgG 1 4.3. Métodos inmunoserológicos
anti-citomegalovirus

Nota: el manual de laboratorio se realizó tomando en cuenta los conocimientos que se generan en una
práctica y son necesarios en la mayor parte de los casos para el desarrollo de prácticas posteriores,
además los materiales obtenidos en algunas prácticas se reutilizan en las practicas consecutivas, tal
es el caso de la práctica 2, de donde se obtienen productos útiles en la prácticas 3, 6 y 9.

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Formato de la práctica y simbología

Introducción

Objetivo

Fundamento teórico

Aspectos de seguridad e higiene

Procedimiento. Este puede ser considerado como actividad o ejercicios


demostrativos.

Actividades de comprobación o evaluación

Observaciones

Bibliografía
Actividades de comprobación o evaluación

Observaciones

Bibliografía

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Evaluación del curso

El discente tendrá derecho a presentar las evaluaciones correspondientes, con base a los
lineamientos establecidos en el Reglamento Interno de la Facultad de Química. Así mismo
debe ser puntual a cada actividad académica, mostrar un comportamiento adecuado en cada
sesión y cumplir con el 80% de asistencia. La unidad de aprendizaje se va a evaluar con base
en la construcción de conocimientos y habilidades adquiridos durante el proceso de
aprendizaje; se tomarán en cuenta los valores y la actitud mostrados por los estudiantes en
las actividades académicas, en la participación con exposiciones y la entrega de trabajos
escritos como evidencia, propios de cada una de las unidades de competencia.

La evaluación del curso se integra de la siguiente forma:

Evaluación Ponderación

1ª Examen Parcial 50%

2ª Examen Parcial 50%

Promedio de Exámenes Parciales 80 %

Calificación de Laboratorio 20%

Si el alumno en esta ponderación alcanza una evaluación igual o mayor a 8.0 (ocho puntos),
estará exento de presentar el Examen Final; si la evaluación obtenida en esta ponderación es
menor de 8.0 (ocho puntos), el alumno tendrá que presentar el Examen Final

Examen Final 100 %

Laboratorio

Reportes 20%

Bitácora 10%

Desempeño en el laboratorio 20%

Examen final de laboratorio 50%

Total 100%

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Reglamento del laboratorio de Virología

1. Uso obligatorio de bata blanca de manga larga y abotonada, sin bolsas y en cada área
usar batas desechables sobre la blanca.
2. Uso obligatorio de guantes en el manejo de animales y muestras clínicas.
3. Usar cubre bocas o careta en el caso de prácticas de mayor riesgo.
4. Limpiar las mesas de trabajo con solución antiséptica (benzal o hipoclorito de sodio
al 1 % al inicio y al finalizar la práctica.
5. No abandonar el laboratorio una vez que ha iniciado la práctica, salvo emergencia
justificada.
6. No correr en el laboratorio.
7. Contar con gasas o papel adsorbente en cada mesa de trabajo.
8. Prohibido tomar alimentos dentro del laboratorio.
9. Evitar corrientes de aire en el laboratorio.
10. Disponer de recipiente con agua clorada para inactivar las puntas de las micropipetas,
material contaminado con reactivos y/o muestras biológicas.
11. Utilizar jabón líquido para aseo de las manos antes de abandonar el laboratorio al
término de la sesión.
12. Esterilizar en autoclave el material que así lo requiera.
13. En caso de algún accidente o percance avisar al profesor de la práctica.
14. Respetar las normas internacionales de bioseguridad en los laboratorios para trabajar
virus.

LA REGLA DE ORO
Toda muestra: sangre, suero, cultivos bacterianos, cultivos celulares, virus y
productos radiactivos deben manipularse con extremo cuidado, como si fuesen
muestras potencialmente patógenas.

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Manejo de residuos peligrosos

Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las
siguientes características: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas, radioactivas,
volátiles, corrosivas y/o tóxicas, que pueden causar daño a la salud humana y/o al medio ambiente.
Así mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en contacto
con ellos.

Al final de cada práctica se presentará una propuesta de clasificación, registro y recolección de los
residuos químicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento.

Los residuos peligrosos biológico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de acuerdo
a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los siguientes:

Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.

Los cultivos generados en los procedimientos diagnósticos y de investigación, asi como los generados
en la producción de agentes biológicos.

Su activación y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por métodos químicos o térmicos, es el caso
de la desinfección con hipoclorito de sodio y esterilización por calor seco o calór húmedo
frecuentemente utilizados en las áreas de microbiología.

Fuente: Guía para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).

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Práctica 1. Constitución de un laboratorio de virología de investigación o


diagnóstico.

Introducción

El material y equipo de un laboratorio de virología es muy parecido a muchos laboratorios,


aunque para muchas metodologías diagnósticas y de investigación se precisa de equipo
especializado como las cámaras de flujo laminar, incubadoras de CO2, instrumentos ópticos
de observación como el microscopio de epifluorescencia y el microscopio invertido,
congeladores e instalaciones de criogénia como el tanque de nitrógeno líquido, refrigeradores
de -20 °C, centrifuga refrigerada, autoclave, micropipetas multicanal, microdilutores.

Un laboratorio de virología debe tener las paredes pintadas con pintura epóxica, las esquinas
redondeadas y tener un flujo de aire positivo en las puertas para evitar que el aire externo
entre, además debe cumplir con la normatividad vigente así como tener un control de calidad
externo.

Objetivo

El alumno investigará y conocerá el equipo y características fundamentales de un laboratorio


de virología y conocerá las diferencias que tiene respecto a otros laboratorios biológicos.

Fundamento teórico

La esencia de un laboratorio de virología son el equipo y la asepsia, tanto de las instalaciones


como del aire. El aire se debe mantener bajo presión positiva, después de ser pasado por un
filtro, esta presión positiva creará condiciones para que el polvo y los microorganismos sean
arrastrados hacia fuera. Debe existir un área para el cultivo de tejidos, instalada en la zona
alejada de las vías de paso. Las cámaras de flujo laminar reducen las necesidades del
aislamiento del área, pero aun así es necesario mantener un gradiente de esterilidad, lo ideal
es disponer de una habitación aislada.

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A continuación se describen los instrumentos de un laboratorio de cultivo celular.

1. Campana de flujo laminar. Su función es mantener un área libre de contaminantes, esto se


consigue mediante un dispositivo mecánico que fuerza el paso del aire a través de un filtro
superficial (HEPA).
2. Incubadora de CO2. Son estufas que regulan la temperatura a 37 °C, ya que las células en
cultivo no pueden sobrevivir a temperaturas superiores a 39 ° C, además se regula la
presión de CO2 esto controla el pH que hay en el interior de la incubadora, regulan también
la humedad, teniendo todas estas condiciones ideales, se augura un buen desarrollo y
crecimiento de las células.
3. Microscopio de contraste de fases invertido. Permite monitorear el desarrollo morfológico
del cultivo, el hecho de que las muestras observadas se encuentren en recipientes anchos,
precisa el uso del invertoscopio, cuya fuente de luz y objetivos se encuentran invertidos
respecto a un microscopio óptico convencional. Como las muestras no presentan color, el
microscopio está equipado con un dispositivo de contraste de fases que permite obtener
imágenes de calidad.
4. Congeladores y equipo de criogénia. Es el sistema que permite guardar las células durante
años a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 °C).
5. Equipo de filtración, muchas soluciones y medios de cultivo que se utilizan para hacer
crecer a las células necesitan ser esterilizadas por filtración a través de un dispositivo de
filtración de 0.22 micrómetros de poro.
6. Equipo de esterilización o autoclave. Es un sistema que permite la esterilización por calor
tanto de sólidos (material e instrumentos) como de líquidos (medios de cultivo). La
esterilización habitualmente se realiza a 121 °C y 2 atmosferas de presión durante 20
minutos.
7. Centrífugas. Deben ser refrigeradas preferentemente con posibilidades de usar en ellas
tubos con volúmenes de 1 a 2 mL, hasta botellas de 250 a 500 mL, deben instalarse lejos
de las campanas de flujo laminar para evitar las turbulencias de aire que generan.
8. Contador electrónico de células. Este instrumento es capaz de medir y contar partículas
en suspensión, consta de 2 electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis
los cambios de resistencia que detectan, cada vez que una célula en suspensión los
atraviesa.

Aspectos de seguridad e higiene

1. Durante la visita al Laboratorio de Biología Molecular del CICMED será necesario el uso
de equipo de protección básico como la bata blanca de manga larga y abotonada.
2. Conducirse con compostura dentro del laboratorio y seguir las indicaciones del
coordinador.

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Procedimiento

1. Se realizará una visita al laboratorio 2. El alumno elaborará un trabajo de


de Biología Molecular del investigación documental describiendo el
CICMED UAEMéx equipo y los aspectos más importantes de
un laboratorio de virología.

3. Investigará la normatividad que debe


cuidarse para el buen funcionamiento de
un laboratorio de virología

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Cuáles son los usos del tanque de nitrógeno líquido y que temperatura alcanzan?

2. Describe las características de las campanas de seguridad biológica o campanas de flujo


laminar.
3. Describe las diferencias que hay entre los microscopios de epifluorescencia, de luz
ordinaria y el invertoscopio.

4. Describe las diferencias elementales entre una centrifuga ordinaria y una centrifuga
refrigerada.

Observaciones

Bibliografía

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1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica
2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol.
1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona.
5. http://www.virology.net/

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UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 2. Inoculación de huevo embrionado en saco vitelino y cavidad


alantoidea

Introducción

Los huevos embrionados se usan de manera limitada en la actualidad para el diagnóstico


viral, pues son baratos, de fácil manipulación, estériles y contienen varias cavidades que
permiten inocular varios virus a la vez. Este sistema biológico ha sido utilizado para la
investigación viral en el laboratorio, además en la producción de ciertas vacunas.

Objetivo

Que el alumno conozca la importancia diagnóstica y usos de los huevos embrionados así
como su anatomía, técnicas de inoculación y la susceptibilidad viral al cultivarse en las
diferentes cavidades y observando los efectos citopáticos que producen ciertos virus
humanos.

Fundamento teórico

Los virus pueden inocularse en las diferentes estructuras de los huevos embrionados de pollo
o pato, los huevos se inoculan entre los 5 a los 14 días post-fertilización, dependiendo del
estado de desarrollo de la membrana o cavidad que se desee infectar, el sitio de inoculación
se elige según el tropismo viral y puede ser:

a. En la superficie de la membrana corioalantoidea


b. En la cavidad corioalantoidea
c. En el saco vitelino
d. En el saco amniótico
e. En el sistema vascular (vena corioalantoidea)
f. En el propio embrión (intracerebral)

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Para la inoculación del embrión (7-14 días) se practica un pequeño orificio en el cascarón del
huevo, previa asepsia y se inyecta el inoculo, se incuba a 37 ° C, la replicación viral puede
producir la muerte del embrión, lesiones características o la manifestación de antígenos
virales por ejemplo las hemaglutininas.

Los huevos embrionados presentan la ventaja de ser bacteriológicamente estériles y de fácil


manipulación, actualmente su uso está restringido al aislamiento, propagación y elaboración
de vacunas mixovirus, paramixovirus y poxvirus.

Aspectos de higiene y seguridad

El riesgo de infección en el caso de inoculación de pollo y animales se asocia con el peligro


inherente al manejo de agujas y jeringas, las cuales deben purgarse usando un tubo que
contenga un material absorbente para evitar salpicaduras o aerosoles, después de su uso
desecharlas en recipientes rígidos para residuos peligrosos biológico infecciosos (RPBI), o
en el contenedor de punzocortantes, jamás re-encapuchar. La cosecha de líquidos y/o tejidos
de los embriones debe realizarse de manera cuidadosa, depositando los residuos en una bolsa
amarilla de RPBI’s.

Materiales y reactivos

Embriones de pollo libres de patógenos de 9 a 11 días de incubación.


Virus de New Castle.
Solución de azul de metileno al 2 %.
Solución de alcohol-benzal (1:1).
Jeringas para insulina estériles.
Gasas y torundas.
Tubos de ensayo.
Vasos de pp de 100mL.
Lápiz y marcador.
Esmalte para uñas o pegamento blanco.
Cajas petri.
Equipo de disección (pinzas y tijeras de punta fina).
Ovoscopio.
Estufa a 37 °C.
Recipiente de desechos de RPBI.
3 jeringas de insulina con aguja No. 22

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Procedimiento

A. Metodología de inoculación

1. Al llegar los embriones al laboratorio,


A. Inoculación. 2. Con ayuda del ovoscopio verificar
revisar que se encuentren en condiciones que cada huevo tenga un embrión
satisfactorias para su uso en la inoculación vivo, de tamaño adecuado al
de virus, deben tener el cascaron completo, desarrollo normal de 7-9 días de
sin áreas frágiles o fracturadas. incubación.

3. Con el ovoscopio marcar con un lápiz sobre 4. Encontrar y marcar el saco o cámara
el cascarón la membrana que separa al de aire en la parte superior del
embrión de la cámara de aire. huevo.

5. Antes de inocular, limpiar el área y 6. Desinfectar la superficie marcada en


asegurarse que todos los implementos de el cascarón con la solución alcohol-
trabajo estén a la mano. benzal o de lugol.

8. Usando el ovoscopio localizar la porción 7. Con ayuda de la jeringa hipodérmica


del embrión para inocular en el saco hacer una punción en el centro de la
amniótico y alantoideo. cámara de aire.

9. A través del orificio hecho en el cascaron y 10. Retirar la aguja de la región


con Angulo de 10 a 20° introducir amniótica, aproximadamente 1 cm,
cuidadosamente la aguja dirigiéndola a un para situarla en la cavidad
lado del embrión. Tratando de no lastimarlo alantoidea e inocular 0.1 mL de
e inocular 0.1 mL de la muestra. muestra.

6. Los testigos no reciben ningún tratamiento, 5. Sellar el orificio del cascarón con
y se incuban en las mismas condiciones que parafina, pegamento blanco o
los inoculados. esmalte de uñas e incubar a 34 ° C
por 72 h.

7. Al terminar, limpiar y desinfectar


perfectamente el área de trabajo.

B. Otra formas de inoculación

Inoculación en el Saco Vitelino:

1. El saco vitelino se encuentra en posición contraria al embrión.

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2. Observar al ovoscopio y marcar el límite de la cámara de aire, marcando la posición del
embrión. La cámara de aire debe estar en el polo.
3. Realizar un pequeño agujero en el límite de las ¾ partes del huevo.
4. Tomar el inoculo con aguja de inoculación No. 22 con una jeringa de insulina.
5. Inocular en el agujeto hecho en posición directa al embrión con ángulo de 90°.

Inoculación en la Cavidad Alantoidea:

1. Colocar el huevo con posición vertical y con un taladro hacer un orificio en posición
directa del embrión.
2. Con aguja N° 22 pinchar en forma oblicua formando un ángulo de 45° en el borde (en
relación al polo de la cámara de aire); introducir las 1½ pulgadas.
3 . Otra forma es marcar la cámara de aire, a 0.5 cm de la marca hacer un agujero e inocular
0.3 mL del inoculo con un aguja número 26 ó 27 de insulina.
4 . Hacer un agujero por encima de la cámara de aire y en posición contraria al embrión e
inocular.

Inoculación en la Cavidad Amniótica:

1. Practicar un agujero en posición directa al embrión; con aguja 22 de 1½pulgadas. Inocular


directamente al embrión, introduciendo toda la aguja.
2. Podemos también abrir toda la cámara, añadir 1 gota de solución salina fisiológica o agua
destilada, para que la membrana fárfara, que inicialmente es blanca se haga transparente.
3. Introducir la pinza y levantar la membrana de la cavidad amniótica, observar el embrión
e inocular.

Inoculación en la Cavidad Coriolantoidea:

1. Se práctica un agujero en el polo más ensanchado del huevo


2. Para inocular:
Utilizando la cámara natural: inoculando por debajo de fárfara que cubre,
depositando el líquido sobre la membrana corioalantoidea, usando jeringa de
insulina y aguja 26 ó 27.
Fabricando una cámara de aire artificial: practicar dos agujeros; uno en el
polo más ensanchado y otro en uno de los costados del huevo en posición contraria
al embrión. Colocar una jeringa en la el agujero y obtener el aire del polo más ensanchado
(cuando sale el aire). La membrana corioalantoidea baja; es decir este se separa más de la
cáscara.
3. Evitar abrir demasiado para que no se contamine.
4. Se inocula con ayuda de una jeringa de 25 o 27 x 1 ó ½ de pulgada.
5. Para inocular se introduce la aguja y enseguida se inocula el fluido, en la inoculación
puede girar la jeringa para que el líquido, quede depositado en la membrana.
6. Después de realizadas las inoculaciones, los agujeros son cubiertos con parafina cera.

Cosecha del virus


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Figura 1. Rutas de inoculación de virus en los huevos embrionados. 1. En la cavidad
alantoidea, 2. En la cavidad amniótica, 3. En el saco vitelino, 4. En la membrana
corioalantoidea.

1. Cortar con las tijeras la cáscara a nivel 2. Cortar con las tijeras la cáscara a nivel
del límite de la cámara de aire. del límite de la cámara de aire.

4. Extraer con pipeta Pasteur el líquido 3. Con ayuda de una jeringa retirar el líquido
amniótico. alantoideo.

5. En caso de no haber líquido, hacer un


lavado con suero fisiológico estéril
(1mL) y luego se colecta este líquido

Actividades de comprobación o evaluación


Menciona tres usos de los huevos embrionados en el laboratorio de virología.

1. Esquematiza un huevo embrionado, señalando cada una de las cavidades que los
caracterizan.

2. ¿En qué cavidad es susceptible inocular un herpes virus?

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3. Los poxvirus ¿en qué cavidad se inoculan?

4. ¿Qué efecto produce el herpes virus en el embrión?

Identifica las partes de los huevos embrionados.

Observaciones

Bibliografía.

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol.
1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorail Masson. S.A. Barcelona.

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UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 3. Hemaglutinación

Introducción:

La hemoaglutinación es un método donde no se mide la capacidad infecciosa de las partículas


virales. Es una técnica indirecta para medir partículas virales, pues en realidad mediante esta
técnica se mide la cantidad de partículas hemaglutinantes (proteínas virales)
independientemente si estas están incluidas en la partícula viral o libres como antígeno.

Objetivo
Se realizará el reconocimiento del virus de New Castle mediante la Hemoaglutinación
Directa, por su acción sobre los glóbulos rojos de pollo.

Fundamento teórico

La hemoaglutinación es uno de los métodos indirectos más comunes para cuantificar


partículas virales y/o antígenos virales hemaglutinantes en suspensión. En esta los eritrocitos
se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden usar como un sistema indicador.
Así, si se descubren los anticuerpos, la reacción se revelará como una hemoaglutinación que
se puede advertir a simple vista. Existe una gran cantidad de antígenos que se pueden unir a
los glóbulos rojos, entre ellos los carbohidratos que se adhieren con rapidez. En el caso de
las proteínas se requiere un proceso de pre-tratamiento con ácido tánico o con cloruro de
cromo. Este sistema se usa para demostrar anticuerpos contra toxinas como la de la difteria
o del tétanos. También para descubrir anticuerpos contra el virus de la fiebre amarilla, VZV,
influenza, parainfluenza y dengue.

Un virus hemaglutinante es aquel capaz de aglutinar glóbulos rojos de determinada especie


animal, p.ej. los virus ya mencionados anteriormente.

El título de una hemoaglutinación está determinado por la última dilución de una serie, en
donde se observa, macroscópicamente, una malla formada por la unión del virus y/o antígeno
libre a receptores en la membrana de los glóbulos rojos y en la siguiente dilución un
sedimento o “botón” de glóbulos rojos.

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Aspectos de seguridad e higiene

1. Desinfectar el área de trabajo al inicio y al final de la práctica.


2. Uso de protección personal.
3. Adecuada disposición de los residuos en una bolsa amarilla de RPBI’s.
4. Tratamiento químico adecuado para la desinfección del material que tuvo contacto con
los productos biológicos.

Materiales y reactivos

Virus New Castle.


Glóbulos Rojos de pollo lavados.
Para el caso de seres humanos: usar grupo sanguíneo “O”.
Solución Salina Fisiológica.
Gradillas.
Tubos de ensayo.
Pipetas.
Espejo.
Centrífuga.

Procedimiento:

Preparación de Glóbulos Rojos Lavados:

1. Extraer la sangre de pollo


(previamente vacunado); y conservarla 2. Centrifugar a 1500 rpm por 5 min.
en un tubo con anticoagulante.

3. Extraer la sangre de pollo (previamente


4. Eliminamos el sobrenadante (plasma). vacunado); y conservarla en un tubo
con anticoagulante.

5. Agregar al tubo (Paquete Celular) 6. Volver a centrifugar a 1500 rpm por 5


solución salina fisiológica y mezclar. min.

8. Luego, tomamos de 0.7 ml. de glóbulos 7. Eliminamos el sobrenadante y volvemos


rojos del paquete celular y lo a repetir el proceso de lavado 2 – 3 veces
suspendemos en 100 ml. de SSF, para más.
20
Reacción de Hemoaglutinación:

1. Colocamos 8 tubos en un gradilla, 2. Con una pipeta tomar 0.2 ml. de cepa de
colocándole al primero 0.8 ml. de SSF Newcastle y depositarla en el tubo No.
y del tubo 2 al 8 añadir 0.5 ml. de 1 (dilución 1/5).
Suero Fisiológico.

4. Repetir hasta obtener las diluciones 3. Tomamos 0.5 ml. del tubo 01 y lo
1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640 (el depositarnos en el tubo Nº 02, (dilución
tubo N° 08 es el control se le añadirá 0.5 1/10).
ml. de la cepa New Castle).

5. A cada tubo colocamos 0.5 ml. de los 6. Dejamos reposar al medio ambiente por
glóbulos rojos lavados al 0.7 % 15 a 20 minutos.
(incluyendo el tubo control).

7. Pasado el tiempo, colocamos debajo de


8. La última dilución en la cual aparece la gradilla un espejo, para observar si
HA es el título del virus (este es el hay “hemaglutinación positiva”
inverso de dicha dilución). (formación de una malla delgada, gris) o
hemoaglutinación negativa (se observa
un punto rojo).

Actividades de comprobación o evaluación

1. Describe el fenómeno de hemaglutinación


2. ¿Cuál es la diferencia entre aglutinación directa e indirecta?
3. ¿Cuál es la utilidad de la técnica de hemaglutinación por virus?

Observaciones

Bibliografía.

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica Vol.
1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona.
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Práctica 4. Inoculación intracerebral de ratón lactante

Introducción

La primer técnica emplead en el aislamiento de los virus fue la inoculación en animales de


experimentación. L a prueba de infección se lograba si él animal moría o si se observaban
síntomas o lesiones. La aplicación de este método es limitado, los animales son caros así
como su mantenimiento, no todos los animales son susceptibles a las enfermedades que
atacan al hombre, a pesar de estas dificultades, son esenciales para el aislamiento de algunos
virus que causan enfermedades del sistema nervioso central como los arbovirus, enterovirus,
coxsackievirus y rabdovirus.

Objetivo

Que el alumno aprenda a realizar la correcta inoculación de ratones por las vías
intracerebral, intraperitoneal, subcutánea y oral.

Fundamento teórico

Los animales habitualmente utilizados en el laboratorio son ratones lactantes o adultos,


cobayos, conejos y en algunos casos primates, numerosos virus pueden aislarse y cultivarse
en animales de experimentación, resultan indispensables en la investigación de la
patogénesis e inmunidad de las enfermedades virales, en el ensayo de vacunas, en el estudio
de los virus oncogénicos y de la preparación de antisueros con fines diagnósticos.

Debido a la legislación en cuanto a su uso, el alto costo de mantenimiento, a la complejidad


de las instalaciones y al riesgo de manipulación de animales infectados, se utilizan de manera
cada vez más restringida. La inoculación en animales es el método más antiguo para aislar y
conservar virus, dependiendo del virus por aislar se elige el animal, la vía de inoculación que
asegure que el virus alcance el tejido u órgano donde se multiplique con mayor facilidad, es
importante seguir las precauciones de esterilidad necesarias para que la muestra no se
contamine con microorganismos que enmascaren el desarrollo viral. Los ratones y hámsteres
recién nacidos de menos de 48 horas son especialmente susceptibles a los enterovirus,

22
cocksakievirus y rabdovirus, pueden ser inoculados por vía intracerebral o intraperitoneal, en
cambio los ratones adultos son susceptibles a la rabia, la fiebre amarilla y linfogranuloma, la
inoculación se hace por vía intracerebral y los síntomas principales son la falta de
coordinación y ataxia.

Aspectos de seguridad e higiene

1. Purgar las jeringas usando un tubo que contenga material absorbente para evitar aerosoles.
2. Asegurar que el animal este completamente sedado antes de inocularlo.
3. Aplicar correctamente las técnicas de inoculación y sujetar firmemente al animal para
evitar autoinoculaciones.
4. Las jeringas usadas, jamás se re-encapuchan, desechar en el recipiente rígido para RPBI
o en el contenedor de punzocortantes.
5. Los animales que quedan vivos al final de la práctica los animales muertos se colocan en
una bolsa amarilla para RPBI, la cual será refrigerada antes de su destino final.

Material y equipo

Ratón joven de 30 días y ratón lactante de 2-3 días de nacido.


Jeringas para insulina.
Torundas y gasas.
Equipo de disección.
Ampolleta de agua inyectable estéril.
Solución de alcohol-yodo (1:1)
Solución de azul de metileno al 2 %.
Éter
Vaso de precipitado de 100 y 250 mL
Recipiente rígido para RPBI’s y bolsa amarilla de RPBI.

23
Procedimiento

Inoculación intracerebral. En el lactante se pueden observar los huesos y las estructuras


cerebrales por la transparencia de la piel.

1. Anestesiar al ratón en un frasco que 2. Colocar el ratón de cúbito ventral sobre la


contenga torunda humedecidas con éter. mesa, se selecciona el sitio de inoculación
entre el conducto auditivo externo y el ojo,
a un lado de la línea media.

4. Se carga la jeringa con 0.01 mL para


ratón lactante y de 0.05 mL para ratón 3. Se desinfecta el área, evitando introducir
adulto con agua destilada estéril. desinfectante al ojo.

5. La aguja debe penetrar el cráneo en 6. Sentir como la aguja penetra el hueso,


forma perpendicular para evitar que la controlar la presión que se ejerce, la aguja
punta resbale. solo debe penetrar de 1 – 2 mm.

8. El ratón lactante es difícil de anestesiar 7. Se realiza la inoculación, se retira la aguja


por lo que se realiza la inoculación y se desinfecta nuevamente.
rápido y sin anestesia.

Inoculación oral

2. Se carga la jeringa con 0.05 mL de 1. Se carga la jeringa con 0.05 mL de


solución de azul de metileno. solución de azul de metileno.

4. Se acerca la jeringa a la boca y se 3. Se toma al ratón en posición dorsal.


deposita el inoculo.

5. Se puede seguir la trayectoria del


inoculo por la transparencia de la piel.

Actividades de comprobación o evaluación


1. Menciona tres usos de los ratones en el laboratorio de virología

2. Cita 3 vías de inoculación en animales

24
3. Que precauciones debes tomar en cuenta al realizar una inoculación.

4. Esquematiza la anatomía abdominal del ratón.

5. Para qué tipo de aislamiento viral es útil la inoculación intracerebral.

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica
Vol.1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 5. Diagnóstico rápido de virus rábico (tinción de Sellers)

Introducción.

Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones óptimas de precisión,
rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la investigación microscópica de los
corpúsculos de Negri, que se realizan en un frótis de tejido encefálico infectado con el virus
rábico y es teñido por la técnica de Sellers.

Objetivo.

Aprender a efectuar el diagnóstico rápido del virus rábico usando la técnica de Seller
(simulando que el ratón está inoculado o infectado con este virus).

Fundamento teórico

El virus rábico pertenece a la familia Rhabdoviridae, es un RNA virus de una sola cadena,
tiene forma de bala. La rabia se transmite por mordedura o contacto directo de las mucosas
o heridas con la saliva del animal infectado, es la zoonosis más antigua, cuya importancia
radica en su letalidad cercana al 100 %.

La rabia se caracteriza por un cuadro encefálico cuyo diagnóstico diferencial con otras
encefalitis es difícil y solo el examen del laboratorio permitió establecer un diagnostico
seguro.

El diagnóstico clínico de la rabia en un animal justifica el inicio del tratamiento antirrábico


de la persona que estuvo en contacto con el virus y el diagnostico posterior permite
continuarlo o interrumpirlo. Sin embargo las pruebas de laboratorio son adecuadas cuando
se cumplen ciertos requisitos:

 Buena calidad de la muestra


 Condiciones de transporte correctos

26
 Rapidez con la que se obtiene resultado
 Notificación inmediata de los resultados

La tinción de Sellers es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo para el diagnóstico de la
rabia, que es una de las infecciones virales de notificación obligatoria para el sector salud.
Esta tinción pone de manifiesto los corpúsculos de Negri en el cerebro del animal infectado
o que se sospecha tenia rabia. Se ha observado que los corpúsculos de Negri son
especialmente visibles en el asta de Ammon, en las células piramidales de la corteza cerebral
y en las células de Purkinje en el cerebro.

El colorante de Sellers tiñe los corpúsculos de Negri de color rojo violaceo o rojo ladrillo,
con inclusiones basófilas de color azul oscuro a negro. Dejándolos claramente diferenciados
de las células nerviosas y del tejido intersticial que se tiñe de azul claro y rosa
respectivamente. Los corpúsculos de Negri están constituidos por partículas virales y
constituyentes celulares rodeados de una matriz citoplasmática, contienen DNA (sustrato
eosinófilo) y RNA (granulaciones basófilas).

Aspectos de seguridad e higiene

5. Uso de protección personal.


6. Asegurarse que el ratón está completamente sedado antes de sacrificarlo.
7. Sujetar firmemente al ratón para evitar accidentes.
8. Realizar los cortes con el bisturí sujeto del mango (evitar manejar el bisturí directamente
con la mano).
9. Los restos del ratón serán colocados en una bolsa amarilla para RPBI la cual deberá ser
refrigerada.

Materiales y reactivos

Estuche de disección
Abate lenguas
Papel filtro
Colorante de Sellers
Puente y charola de tinción
Solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5
Cronómetro
Microscopio
Ratones de 3 -5 semanas de nacidos

27
Procedimiento
1. Con ayuda del equipo de disección y de las 2. Se levanta la piel y músculos de la
tijeras de punta fina se realizará un corte cara y cabeza para exponer el cráneo.
entre ambas fosas orbitales del ratón.

4. Se inserta la punta de una tijera para cortar el 3. Se dobla el cuello del ratón para
hueso y se corta la bóveda hasta exponer el exponer el agujero magno.
cerebro.
6. Se saca integro el cerebro
5. Se saca integro el cerebro desprendiéndolo desprendiéndolo de la base del cráneo
de la base del cráneo (incluyendo cerebelo (incluyendo cerebelo y parte de la
y parte de la medula). medula).

7. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando


un fragmento del cerebro que contenga el asta de
Ammon o cuerpo de Ammon del hipocampo donde los
corpúsculos de Negri son especialmente visibles.

Preparación de la impronta

1. En el extremo de un abate lenguas se coloca 2. Se toma un portaobjetos y se hacen


una banda de papel filtro y sobre este se de 3 a 4 impresiones del cerebro,
pone el corte del cerebro del ratón. tomando ligeramente y haciendo
presión hasta que quede marcado en
3. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al el porta objetos la silueta de la pieza
siguiente metodología: de cerebro a estudiar.

a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos


b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5.
c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

2. Observar y describir las células


nerviosas, no se apreciarán los
corpúsculos de Negri pues el riego de
manejar virus rábico es muy alto (solo
se simulará que el ratón está infectado)

28
Figura 1. Corpúsculos de Negri en tejido neuronal

Actividades de comprobación o evaluación

1. Mencione 3 técnicas para el diagnóstico de virus rábico.

2. Define en qué consiste un estudio histológico.

3. Realiza un esquema de la anatomía macroscópica y microscópica cerebral del ratón.

4. Cita el procedimiento para la preparación del colorante de Sellers.

5. ¿Cuál es el sustrato ideal para la obtención de vacuna antirrábica?

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica
Vol. 1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
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Práctica 6. Cultivo Celular

Introducción.

Los cultivos celulares son actualmente una herramienta elemental en el laboratorio de


Virología. El cultivo celular es un procedimiento “in vitro” en el que se cultivan las células
disociadas que se pegan a una superficie de vidrio o plástico. Se les provee de nutrientes de
acuerdo a sus exigencias para que puedan multiplicarse, el cultivo celular se maneja bajo
estrictas condiciones de esterilidad.

Básicamente hay tres tipos de cultivos celulares:

1. Cultivos primarios los cuales derivan de tejidos, se mantienen vivos por tiempo
limitado y resistente a dos subcultivos
2. Cultivo de células diploides resisten entre 50 y 70 subcultivos
3. Líneas continuas provienen de células diploides transformadas o de tejidos
neoplásicos como VERO, HeLa, Hep- 2 y KB que pueden ser cultivadas sin límite
aparente.

Objetivo.

El alumno realizará el subcultivo celular, con el conocimiento previo de las condiciones


generales que requiere un cultivo celular.

Fundamento teórico

Enders descubrió que los virus podrían desarrollarse en cultivo de células “in vitro” y esto
constituyó un hito fundamental en el desarrollo de la Virología. Los cultivos celulares
constituyen el método de elección para la replicación de la mayoría de los virus. El cultivo
celular consiste en mantener vivas en botellas o tubos con medios nutritivos enriquecidos con
sueros y antibióticos.

Hay tres tipos de cultivos:

30
Cultivos primarios se obtienen por tratamiento con tripsina de pequeños fragmentos de
tejido humano o animal. Las células disgregadas se lavan, se cuentan en cámaras de Neubauer
o cuenta de eritrocitos y se siembran en tubos cónicos o botellas de Roux, adicionando
medios nutritivos y antibióticos. Se incuban a 37°C, luego de pocas horas las células se
adhieren a la superficie del recipiente y se multiplican formando islotes, que van cubriendo
toda la superficie plástica hasta formar una monocapa.

Estas células pueden usarse para replicar virus e identificarlos, o bien para replicarse las
células y obtener nuevos cultivos. Esto se denomina pasaje o subcultivo. Los cultivos
primarios son altamente sensibles a la replicación viral, su mayor inconveniente es que las
células mueren después de pocos pases.

Cultivo de células diploides. Provienen de células de cultivos primarios que se conserva


intacta su morfología diploide, resiste hasta 70 pases, sin perder su alta sensibilidad a muchos
virus y son aptas para la producción de vacunas. Las cepas más usadas son la MRC-5 (de
riñon de mono Rhesus) y las WI-38 (de origen humano).

Líneas Celulares. Denominadas líneas inmortales porque pueden replicarse de manera


ilimitada. Las hay de origen normal como las células VERO provenientes de riñón de mono
verde africano y las de origen neoplásico como las HeLa derivadas del carcinoma de cérvix
o Hep-2 provinientes del carcinoma de laringe. Se usan para aislar el virus de la polio, Herpes,
Rubéola, Sincitial Respiratorio, Adenovirus, etc. Sin embargo su sensibilidad es más
limitada.

Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o
pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca.
4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que
contengan hipoclorito de sodio al 1%.
5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular.
6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta


(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)
Medio de Eagle 20X
Agua tridestilada y desionizada estéril
Suero fetal de ternera frasco de 100mL

31
Amortiguador de bicarbonato al 4.4%
Matraces de Erlenmeyer y pipetas estériles
Solución de antibióticos (penicilina/estreptomicina)
Solución de fosfatos
Microscopio invertido o invertoscopio
Incubadora de CO2

Procedimiento
1. Prepara el medio de Eagle de 2. Descongelar y resuspender las
crecimiento y el de mantenimiento células RD o Hep 2c en 5 mL de
Medio

4. Observar en el invertoscopio el porcentaje 3. Incubar A 37°C por una hora


de células sedimentadas

5. Eliminar el medio y colocar 6. Observar el cultivo a las 24, 28 y


nuevamente 10 mL e incubar toda la 72 hrs hasta la formación de una
noche a 37°C monocapa confluente.

8. Posteriormente el cultivo celular se inoculará con un


virus para demostrar el efecto citopático

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Qué condiciones fisicoquímicas son necesarias controlas en el desarrollo de un


cultivo celular?.

2. ¿Qué diferencia hay entre un medio de mantenimiento y uno de crecimiento?.

3. ¿Cada cuánto debe cambiarse el medio nutritivo a un cultivo celular y por qué?

4. En un cultivo celular ¿A qué se le denomina inhibición por contacto?

32
Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica
Vol. 1
3. Carballa IG., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorail Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 7. Conteo Celular

Introducción.

Para obtener monoesteratos reproducibles, los tubos o frascos deberán ser sembrados con un
número regulado de células o de una concetración celular determinada. Las células se deben
contar con el hemocitómetro y usando un colorante vital se pueden diferenciar las células
viables de las no viables.

Objetivo.

Realizar el conteo de células a partir de un subcultivo celular, determinando el número de


células viables por mililitro.

Fundamento teórico

Las propiedades de las células de adherirse a superficies adecuadas está condicionada a la


presencia de iones de Calcio (Ca) y Magnesio (Mg). En los subcultivos el monoesterato se
puede desprender usando un agente quelante, el cual actúa retirando los iones Ca y Mg, con
lo cual se liberan las células de la superficie a la cual se hallan adheridas.

El monoesterato celular es dispersado con EDTA y tripsina, ya sea por agitación manual de
la suspensión celular durante 10 minutos o usando un agitador magnético, procediendo al
conteo celular.

El cultivo celular permite realizar subcultivos para obtener nuevas generaciones de células
disponibles para su uso inmediato o como reserva conservándolas en criogenia.

De acuerdo al nivel y equipamiento con que cuenta el laboratorio, el conteo celular puede
realizarse ya sea mediante un contador electrónico o de manera manual. El contador
electrónico de células es un instrumento capaz de medir y contar partículas en suspensión,
consta de dos electrodos que transmiten al equipo de amplificación y análisis, los cambios de
resistencia que detectan, cada vez que una de las células en suspensión los cruza. La otra
manera de realizarlo consiste en el uso de un hemocitómetro, usando un colorante que
permite diferenciar las células viables de las no viables.

34
Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores
automáticos. Nunca pipetear con la boca.
4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que
contengan hipoclorito de sodio al 1%.
5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular.
6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Botellas de Roux con células en cultivo de rabdomiosarcoma/ RD o de cáncer de garganta


(Hep-2c), células de riñón de mono verde (VERO)
Medio de Eagle 20X
Colorante azul de Tripán
EDTA
Tripsina
Pipetas Pasteur estériles
Hemocitómetro o Cámara de Neubauer
Campana de flujo laminar
Mechero
Contador de Colonias

Procedimiento
1. Observar en el invertoscopio la botella
2. En campana de flujo laminar y
con el monoestrato celular para
con mechero, abrir la botella y
verificar viabilidad y confluencia
decantar el medio de cultivo.
celular.

4. Observar periódicamente hasta 3. Agregar 2 mL de la solución de


desprendimiento de la monocapa. tripsina- verseno a la botella e incubar a
37°C

5. Adicionar 1 mL de medio por cada 6. Agitar vigorosamente con la pipeta para


integrante que vaya a realizar la disgregar perfectamente las células
práctica.

Nota. Este paso debe realizarse rápidamente y por una


persona porque las células se unen formando coágulo y
se pierden.

35
7. En un tubo estéril colocar 0.8 mL de
suspensión celular y añadir 0.2 mL de
8. Dejar reposar 3 minutos y llenar
azul de Tripán disuelto en soln. salina
la cámara de recuento.
al 0.85% se Teñirán las células no
viables

10. Realizar los cálculos necesarios 9. Observar al microscopio y se cuentan


los cuatro cuadrantes primarios de las
esquinas de la cámara.

Actividades de comprobación o evaluación

1. ¿Qué función desempeña la solución tripsina-verseno en el cultivo celular?

2. ¿Por qué se tiñen las células no viables?

3. ¿Qué Dimensiones tiene un hemocitómetro?

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología
médica Vol. 1
3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da
Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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Práctica 8. Titulación Viral

Introducción.

El desarrollo de la replicación viral, es decir, la amplificación del virus inoculado en el


cultivo, puede identificarse por diferentes procedimientos. Todos ellos tienden a detectar las
modificaciones producidas en el cultivo por efecto de la replicación viral (efecto citopático).
Muchos virus se replican produciendo alteraciones de la monocapa celular, que pueden
observarse directamente en el microscopio invertido y estas alteraciones pueden ser las
formación de sincitios o células gigantes multinucleadas, inclusiones en el núcleo y
citoplasma, redondamiento de las células, lisis o necrosis.

Objetivo.

Que el alumno utilice el cultivo celular como medio de multiplicación del virus de la
poliomielitis y determine el título viral a través del efecto citopático generado.

Fundamento teórico

La detección de los virus en cultivo celular y la replicación viral en un cultivo permite


identificarlo por las alteraciones producidas en las células, el cual es denomindao efecto
citopático o acción citopatogénica, estos pueden ser observados en un microscopio invertido,
sin necesidad de efectuar alguna otra coloración.

Por ejemplo el virus de la poliomielitis y los herpesvirus producen redondamiento de las


células y desprendimiento de la monocapa. Por otra parte existen virus que tienen en su
envoltura proteínas de fusión como el virus de la influenza y el virus sincitial respiratorio los
cuales inducen unión de las células vecinas formando sincitios (células gigantes
multinucleadas). El efecto citopático también se manifiesta por cuerpos de inclusión que
pueden ser intranucleares, intracitoplasmáticos o ambos.

Algunos virus se replican en los cultivos celulares sin producir efecto citopático visible al
microscopio, sin embargo como producto de la replicación liberan al medio proteínas virales
como las hemaglutininas, que pueden ser detectadas por otros procedimientos. El recuento

37
de placas en agarosa (plaqueo) también se puede emplear como técnica de identificación
viral, ya que se pueden cuantificar los viriones presentes en el inóculo, por medio de unidades
formadoras de placa. Para los virus replicables en cultivo celular, que no producen placas, se
utilizan las pruebas de punto final o dilución, que permiten determinar en forma aproximada
la cantidad de virus presentes en una muestra.

Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o
pipeteadores automáticos. Nunca pipetear con la boca.
4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que
contengan hipoclorito de sodio al 1%.
5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del cultivo celular.
6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Equipo de microtitulación
Microplacas de 96 pozos de fondo en U
Microdilutores de 25 L
Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L
Puntas para pipeta automática estériles
Antígeno (virus polio vacunal)
Medio Eagle
Botellas de Roux con monocapa confluente entre el 80 – 100%
Solución de antibióticos (penicilina-estreptimicina)
Invertoscopio
Incubadora de CO2
Mechero
Marcador de tinta indeleble

38
Procedimiento
1. Con el cultivo de células RD o Hep 2c
con el 100% de Confluencia 2. Desprender las células con
tripsina-EDTA

4. Realizar el conteo de células viables en 4. Ajustar a 1000000 de células /mL


cámara de Neubauer

5. En una microplaca de 96 pozos 6. Adicionar 25 L de virus vacunal de


colocar 25 L del medio Eagle de polio en los primero tres pozos.
crecimiento.

7. Realizar las diluciones seriadas del virus de arriba


hacia abajo, es decir, de la fila A a la H con la pipeta
multicanal ajustada a 25 L, se hacen las diluciones de
la primera a la última hilera

8. Adicionar 25 L de la suspensión celular en 9. Se cubre la palca y se incuba a


cada pozo 37°C

10. Observar a las 24,48 y 72 hrs. Las


alteraciones citopatogénicas o efecto
citopático en la monocapa.

Actividades de comprobación o evaluación

¿Qué caracteriza a una línea celular definida?

4. Menciona tres líneas celulares usadas para el aislamiento viral diferentes a las que
se mencionan en este manual.

5. ¿Qué significa en Virología Titulación?

Observaciones

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Bibliografía

5. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


6. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología médica
Vol. 1
7. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
8. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da Edición.
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Práctica 9. Inhibición de la Hemaglutinación

Introducción.

La prueba de hemaglutinación se basa en una característica inherente de la estructura de


ciertos virus como lo de la influenza y rubéola, los cuales contienen en su superficie
componentes que se asocian a moléculas de superficie de los eritrocitos y los aglutinan. El
virus hemaglutinante forma puentes entre los eritrocitos y cambia su patrón normal de
asentamiento, este fenómeno se llama hemaglutinación, el bloqueo de este fenómeno es
conocido como inhibición de la hemaglutinación.

Objetivo.

Que el alumno conozca el fundamento de la técnica de la inhibición de la hemaglutinación y


su aplicación en el diagnóstico, así como determinar si están protegidos contra la rubéola de
acuerdo al título de anticuerpos presentes en suero y principalmente en alumnas.

Fundamento teórico

Muchas de las familias de virus poseen la capacidad de aglutinar eritrocitos de diversas


especies animales (pollos, patos, bovinos, etc) Esta propiedad fue descubierta en 1941 por
Hirst y McClelland en virus de la gripe. El fenómeno básico se da por la unión de
hemaglutininas virales (proteínas de la membrana de los virus) con los receptores
mucoproteicos presentes en las membranas de muchas células y que son especialmente
abundantes en los eritrocitos.

Si la concentración de viriones es suficiente, se formarán múltiples puentes entre ellos y los


eritrocitos, depositándose en el fondo del tubo en forma de retículos, los eritrocitos que no
fueron aglutinados, se depositarán en el fondo del tubo en forma de botón.

Los anticuerpos presentes en el suero pueden inhibir la hemaglutinación originada por ciertos
virus. Si se hace reaccionar a un virus con capacidad de hemaglutinación con su anticuerpo
específico, este anulará su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las hemaglutininas
presentes en la envoltura del virión. La inhibición de la hemaglutinación es un método
diagnóstico utilizado con frecuencia, tanto para identificar virus, como para determinar la
presencia de anticuerpos específicos. Es necesario tratar los sueros para eliminar inhibidores
específicos de la hemaglutinación.

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Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, mascarilla y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. La succión y vaciado de líquidos se realiza utilizando pipetas con bulbos o pipeteadores
automáticos. Nunca pipetear con la boca.
4. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que
contengan hipoclorito de sodio al 1%.
5. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico.
6. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Equipo de microtitulación
Microplacas de 96 pozos de fondo en U
Microdilutores de 25 L
Pipeta automática multicanal con rango de 25 a 100 L
Puntas para pipeta automática estériles
Suero Humano tratado
Eritrocitos en solución de PBS al 85% (pollo, cobayo o de pato)
Antígeno (virus de la rubéola inactivado)
Solución salina de fosfatos pH 7.2 (PBS)

Procedimiento
1. Estandarizacíón de los eritrocitos 2. Tratamiento de los sueros

4. Colocar 25 L de la solución en los 10 pozos 3. Marcar la palca destinando 10 pozos


destinados para cada muestra. para cada muestra, realizarlo por
duplicado.

6. Realizar diluciones, pasando 25 L de


5. Colocar en el microdilutor 25 L del
muestra del primer al segundo pozo, así
suero tratado en el primer pozo,
hasta el octavo los últimos 25 L se
mezclar 10 veces.
desechan

7. Agregar 25 L del antígeno (virus de la rubéola) que


deberá contener 4 UI hemaglutinantes (UIA) en cada
uno de los 9 pozos.

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8. Reposar de 30 a 45 minutos a temperatura 9. Agregar 25 L de eritrocitos de
ambiente. pollo al 5% en cada uno de los
pozos.

11. El título del suero será la dilución en la cual


10. Reposar de 40 a 45 minutos a
se aprecie claramente inhibida la
temperatura ambiente.
hemaglutinación. (Sedimento con formación de
botón rojo)

12. En la hemaglutinación se observa una


agregación de las células sanguíneas sobre la
superficie del pozo, formando una especie de
red.

Actividades de comprobación o evaluación

1. Cita 3 virus con capacidad hemaglutinante diferentes a los que se mencionan en esta
práctica

2. ¿Qué diferencia macroscópica hay entre una sedimentación eritrocitaria y una


hemaglutinación?

3. ¿Por qué se utilizan los glóbulos rojos tipo O?

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología
médica Vol. 1
3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da
Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo
UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 10. Determinación de anticuerpos IgM anti-Rubéola

Introducción.

La Rubéola es una enfermedad infantil de síntomas benignos, caracterizada por un exantema


generalizado, sin embargo, la rubéola en pacientes gestantes, puede asociarse con graves
complicaciones congénitas, como pueden ser ceguera, sordera, defectos cardíacos o retraso
mental. La evidencia de infección puede fácilmente obtenerse por serología mediante la
prueba ELISA específica.

Objetivo.

Determinar anticuerpos del tipo IgG o IgM contra Rubéola mediante la aplicación de un
inmunoensayo.

Fundamento teórico

La inmunidad adquirida contra el virus de la Rubéola se mantiene durante un largo tiempo,


frecuentemente durante toda la vida del individuo, ya que existe un solo serotipo. Las mujeres
en edad fértil deben vacunarse al menos 3 meses antes de embarazarse contra este virus. Su
control debe ser parte rutinaria de la asistencia prenatal, ya que el mayor riesgo de padecer
alteraciones en el feto, es más común durante el primer trimestre de gestación.

Las manifestaciones clásicas son: exantema maculopapular de inicio en cara, presencia de


linfadenopatías de localización post auricular, que aparecen antes del exantema y perdura por
más de una semana, febrícula y ocasionalmente aparecen complicaciones de vías
respiratorias altas. En los adultos son frecuentes las manifestaciones articulares como las
artralgias.

Numerosos métodos se han desarrollado para realizar el diagnóstico, la inhibición de la


hemaglutinación fue el primer método utilizado y es el considerado estándar por la
Organización Mundial de la Salud, la prueba es fundamentada en que los antígenos
glicoproteícos de superficie inducen anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación.

La evidencia de infección puede obtenerse por serología, mediante ELISA específicos el


empleado en esta práctica es inmunensayo en fase sólida. En la madre infectada los

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anticuerpos anti- Rubéola tipo IgM o IgG aparecen poco después del comienzo de los
síntomas. En neonatos los anticuerpos IgM pueden persistir durante más de un año y son
indicativos de infección congénita.

Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes
que contengan hipoclorito de sodio al 1%.
4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de
la paciente.
5. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Micropipetas de volumen variable


Puntas para micropipeta, Gradilla, Tubos de ensaye, Muestra de suero por equipo
Kit comercial para detectar IgG anti- Rubéola el cual debe contener
Controles positivo y negativo
Amortiguador de dilución de la muestra
Conjugado
Cromógeno
Solución de lavado
Solución de paro
Placa de reacción
Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 nm y 620
nm

Procedimiento
1. El procedimiento dependerá del kit 2. Cada integrante del equipo deberá
comercial que se disponga y la marca. anotar en su bitácora el procedimiento
previo a la práctica.

4. Preparar los reactivos necesarios y solicitar 3. Solicitar el inserto del kit al técnico del
las micropipetas adcuadas laboratorio.

6. Comparar los resultados obtenidos con


5. Cada equipo deberá colocar su
la guía de referencia del kit y controles,
muestra de suero en un tubo rotulado
anotar observaciones y concentración
en una gradilla.
obtenida de anticuerpo anti- Rubéola.

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Actividades de comprobación o evaluación

1. Defina los siguientes términos


Artralgia
Artritis
Enfermedad congénita
Enfermedad teratógenica

2. ¿Qué tipo de inmunoglobulina se denomina de memoria?

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología
médica Vol. 1
3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da
Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA EDUCATIVO: Químico Farmacéutico Biólogo
UNIDAD DE APRENDIZAJE: Virología

Práctica 11. Determinación de anticuerpos IgG Anti-Citomegalovirus

Introducción.

Los citomegalovirus (CMV) es un virus con ADN de la familia de los herpesvirus, son
agentes infecciosos muy comunes en el humano ya que infecta a la mayoría de las personas
en alguna fase de la vida, el 80% de la población adulta en todo el mundo cuenta con
anticuerpos contra CMV, presentando una infección subclínica persistente, la infección es
asintomática, pero puede causar serias complicaciones; infección en el primer trimestre del
embarazo conduciendo a anormalidades en el feto y en pacientes inmunodeficientes.

Objetivo.

Determinar anticuerpos del tipo IgG anti -CMV Rubéola mediante la aplicación de un
inmunoensayo.

Fundamento teórico

La infección por CMV es especialmente grave en dos tipos de casos:

1. En pacientes inmunocomprometidos o inmunosuprimidos ya que pueden presentar


infecciones recurrentes, las cuales, se asociación con complicaciones como
neumonías, hepatitis, corioretinitis, así como la co-infección con el VIH.
2. En los recién nacidos la infección por CMV es la causa más importante de
malformación congénita, los neonatos infectados por vía transplacentaria, desarrollan
infección de inclusión citomegálica que es la responsable del 1% de todas las muertes
neonatales y la causa más importante de microcefalia.

El diagnóstico para detectar CMV puede realizarse por aislamiento del virus a partir de orina
y secreciones orales o genitales en cultivos de células diploides, el efecto citopático llega a
retardarse entre una a tres semanas. La detección de antígenos virales mediante anticuerpos
posibilita un diagnóstico rápido. El hallazgo de conversión serológica de los títulos de
anticuerpos detectados por el método de ELISA indica infección reciente. La determinación
de anticuerpos IgG anti CMV, es utilizada para establecer el contacto previo con CMV.

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Aspectos de seguridad e higiene

1. Uso de aditamentos de protección son la bata, guantes, y/o anteojos.


2. Se debe desinfectar el área de trabajo antes de iniciar y al concluir la práctica.
3. Las puntas y pipetas contaminadas deberán colocarse dentro de recipientes que contengan
hipoclorito de sodio al 1%.
4. Evitar derrames o salpicaduras del material biológico, es decir, del suero de la paciente.
5. Esterilizar o desechar adecuadamente las muestras.

Materiales y reactivos

Micropipetas de volumen variable


Puntas para micropipeta
Gradilla
Tubos de ensaye
Muestra de suero por equipo
Kit comercial para detectar IgG anti-CMV el cual debe contener
Controles positivo y negativo
Amortiguador de dilución de la muestra
Conjugado
Cromógeno
Solución de lavado
Solución de paro
Charola de reacción
Si se determina por ELISA se empleará un lector de placas con dos filtros de 450 y 620 nm

Procedimiento inmunoensayo indirecto en fase sólida


1. Preincubar la charola de reacción 3 hrs. 2. Prediluir las muestras y controles (10
Antes de iniciar a temp. amb. o a 37°C L de muestra o control + 100L de
durante 30 min. diluyente.

4. Insertar el peine en la fila A, agitar e incubar 3. Agregar 25 L de muestra y controles


por 30 minutos, retirar el peine y absorber el prediluidos en la fila A de la charola y
líquido adherido a los dientes. mezclar.

6. Perforar la línea C, insertar el peine,


5. Perforar la línea B, insertar el peine,
mezclar e incubar por 20 minutos, retirar
mezclar e incubar por 2 minutos,
el peine y absorber el líquido adherido a
retirar el peine y absorber el líquido
los dientes.
adherido a los dientes.

8. Perforar la línea E, insertar el peine,


7. Perforar la línea D, insertar el peine, mezclar mezclar e incubar por 2 minutos, retirar
e incubar por 2 minutos, retirar el peine y el peine y absorber el líquido adherido a
absorber el líquido adherido a los dientes. los dientes. 48

10. Incube el peine por 1 minuto en la línea E, y 9. Perforar la línea F, insertar el peine,
seque al aire. mezclar e incubar por 10 minutos, retirar
Actividades de comprobación o evaluación

1. Defina los siguientes términos


Inmunoensayo indirecto
Perinatal
Postnatal
Corioretinitis

2. ¿Qué tipo de inmunoensayos se pueden emplear para diagnóstico virológico?

Observaciones

Bibliografía

1. Fenner-Whitte (1998). Virología Médica. Ed. Prensa Medica


2. InDRE (1995). Manual de técnicas de laboratorio de virología y bacteriología
médica Vol. 1
3. Carballal G., Oubiña J. (1998). Virología Médica. Ed. El ateneo, Argentina
4. Díaz R., Gamazo C. y López Goñi (1999). Manual práctico de virología. 2da
Edición. Editorial Masson. S.A. Barcelona.

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