RP - Coprologico

Universidad de Guanajuato
Bacteriología Médica
Laboratorio de
División de Ciencias Naturales y Exactas

NELI06025
Docente: Dra. Claudia Leticia Mendoza Macías
Reporte Integrador GI
Cynthia Donají Negrete Palacios

Cecilia Patricia Magno Paleo
José Ángel Rosas Arroy
1
Bacteriología Médica.
Cultivo de heces con antibiograma positivo para Salmonella serotipo Typhi
Datos de identificación del paciente Fecha 19/Mayo/2021

Folio NB3141590
Nombre: Carlos Ramírez Delgado Edad: 58 años Sexo: Masculino
Nombre del médico solicitante: Dr. Alejandro Macías Hernández
Muestra recibida: Heces (16/Mayo/2021)
Paciente con diabetes mellitus tipo 2 y visita reciente a un país en vías de
desarrollo, presenta intenso dolor e hinchazon pronunciada abdominal,
Información clínica:
evacuaciones intestinales frecuentes acompañadas de fiebre, emesis, fatiga,
cefalea y deshidratación; cuadro clinico sugestivo de gastroenteritis.
Con base tanto en las manifestaciones como datos clínicos del paciente y el tipo de muestra obtenida,
se procederá a realizar un coprocultivo, el cual se emplea para la búsqueda del agente etiológico
causante de la infección, la evidencia orienta a la presencia presuntiva de una enterobacteria. Aunado
a ello, si el cultivo e identificación son positivos para algún enteropatógeno, se procederá a determinar
su correspondiente evaluación de susceptibilidad antimicrobiana por el método de Kirby-Bauer.
I. Toma de muestra.
Muestra de heces
La muestra obtenida se emplea para el cultivo, búsqueda e identificación de enteropatógenos,
agentes etiológicos muy frecuentes en personas con dicho cuadro clínico. En este caso, debido a la
condición del paciente fue posible obtener una muestra de heces.
Aspectos para recordar
Verificar que todo el material empleado se encuentre en sellado, estéril y cercano al sitio de la toma
de muestra. Exponer al paciente el procedimiento a seguir. Mostrar una actitud amable y respetuosa
en todo momento.
La muestra de heces debe ser recolectada durante el período agudo de la enfermedad, antes de
iniciar el tratamiento antimicrobiano. Utilizar un envase de boca ancha, tapa hermética,
preferiblemente estéril, en caso de muestras líquidas se recomienda recolectarla en un envase
para recolección de orina.
Procedimiento
A. Pida al paciente que coloque el dispositivo de B. El paciente deberá defecar en el dispositivo

recolección entre la taza y la tapa del inodoro. En de recolección, con guantes de plástico deberá
caso de no contar con este dispositivo, cubra toda depositar la muestra en un envase de plástico
la taza con un envoltorio de plástico. estéril, puede utilizar la pala pequeña anexada
a
la tapa para un mejor manejo y seguridad.
Nota: Al finalizar el procedimiento deseche el dispositivo de recolección, coloque la muestra en una
[1]
bolsa de plástico y lávese las manos correctamente. Lleve inmediatamente la muestra al laboratorio.
[2]
Conservación y transporte de la muestra: Si la muestra no se cultiva de inmediato, antes de las

dos horas, se recomienda colocarla en un medio de transporte Cary Blair y mantenerla a
temperatura ambiente por un lapso no mayor a 5 días.
II. Medios para el aislamiento.

En las muestras de heces, las bacterias entéricas patógenas se encuentran siempre asociadas a una
gran variedad de bacterias comensales, es por ello, que para facilitar el aislamiento y posterior
identificación de estas bacterias, se emplean diferentes medios de enriquecimiento, selectivos y
selectivos diferenciales.
La inoculación de la muestra de heces se realiza en dos momentos. En el primero de ellos se realiza la

siembra directa de rutina en las placas de agar sangre (AS), agar Salmonella-Shigella (ASS), agar
MacConkey (McC), agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) y agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS).
Por otro lado, se inocula la muestra en dos medios enriquecidos: caldo selenito y agua peptonada, los
cuales se incuban a 36°C por 8 horas; una vez que pasó este lapso se subcultivan, del tubo con caldo
selenito se toman muestras para las placas ASS, McC y XLD; mientras que del cultivo presente en agua
peptonada se resiembra en el agar TCBS.
Figura. Esquema parcial del tratamiento analítico de la muestra en distintos medios de cultivo.
Medios para el aislamiento de Salmonella serotipo Typhi.
[3]
 Agar MacConkey.
MacConkey es un medio selectivo y diferencial que contiene lactosa, rojo
neutro, sales biliares y violeta cristal, estos dos últimos componentes inhiben
el crecimiento de bacterias grampositivas. Por lo tanto, este medio permite
aislar y diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae según su
capacidad de fermentar la lactosa. Las colonias de las especies
fermentadora de lactosa se vuelven rosadas mientras que las no
fermentadoras mantiene la coloración del medio.
En el caso de Salmonella serotipo Typhi sus colonias son incoloras debido a Figura. Coprocultivo en agar
que es una especie que no fermentan la lactosa, así mismo algunas pueden o MacConkey positivo de
no presentar un precipitado negro en el centro de la colonia. Salmonella serotipo Typhi.
[4]
 Agar sangre.
Es un medio enriquecido, no selectivo e indefinido debido a la adición de la
sangre, dicha proporciona al medio factores esenciales que permiten el
crecimiento de una gran cantidad de bacterias. No obstante, permite
diferencias a estos microorganismos en función de su capacidad hemolítica,
la cual se debe a la producción de exotoxinas llamadas hemolisinas.
Se distinguen tres tipos de hemólisis, β-hemólisis se refiere a la lisis
completa de hematíes, las colonias presentan un halo claro entorno a ellas;
por su parte la α-hemólisis presenta una degradación parcial y las colonias se
tornan verdosas. En cambio, la γ-hemólisis se diferencia por la ausencia de
hemólisis, las colonias adquieren un tono blanco grisáceo.
En el caso de Salmonella serotipo Typhi sus colonias son blancas grisáceas Figura. Coprocultivo en agar
grandes, presentan γ-hemólisis, de consistencia cremosa, lisas y con bordes sangre positivo de Salmonella
definidos, como se observa en las fotografías adjuntas. serotipo Typhi
 Agar XLD
El agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) es un medio selectivo-diferencial
empleado para el aislamiento y diferenciación de patógenos entéricos gram
negativos: Salmonella y Shigella a partir de muestras clínicas.
El desoxicolato de sodio actúa como un agente selectivo ya que inhibe a los
gram positivos, en tanto que la xilosa se incorpora en el medio dado que la
fermentan prácticamente todas las enterobacterias, excepto Shigella. La
lisina se incluye para permitir la diferenciación del grupo Salmonella.
Además, se incluye un sistema indicador de H2S, formado por tiosulfato
sódico y citrato férrico amónico, se observa un precipitado negro.
En el caso de Salmonella serotipo Typhi sus colonias son rojas-rosadas Figura. Coprocultivo en agar
debido a la fermentación de la xilosa, algunas pueden o no presentar un XLD positivo para Salmonella
precipitado negro en el centro de la colonia, como se observa en la imagen serotipo Typhi.
adjunta.
 Agar Salmonella-Shigella
El agar Salmonella-Shigella es un medio selectivo diferencial que permite el
aislamiento de estas dos especies de microorganismos. Las sales biliares, el
indicador rojo neutro y el citrato férrico inhiben a las bacterias gram
positivas y algunas gram negativas. La diferenciación de estas especies se
logra en función de su capacidad de fermentar la lactosa, los fermentadores
se tornan de color rojo-anaranjado; en tanto que los no fermentadores
permanecen incoloros.
El tiosulfato sódico y el citrato férrico permiten la detección de producción
de ácido sulfhídrico.
Figura. Coprocultivo en agar
En el caso de Salmonella serotipo Typhi sus colonias son incoloras, algunas SS positivo para Salmonella
pueden o no presentar un precipitado negro en el centro de la colonia, serotipo Typhi.
como se observa en la foto de la derecha.
 Agar TCBS
El agar tiosulfato citrato bilis sacarosa) es un medio altamente selectivo
diferencial para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae y otras especies
Vibrio a partir de muestras clínicas.
El citrato sódico, el tiosulfato sódico, la bilis y el colato son agentes
proporcionan un pH alcalino para inhibir los organismos gram positivos y
suprimir los organismos coliformes, las especies de Vibrio son
halotolerantes. Las colonias de V. cholerae son amarillas, otras especies son
verde azulado o son más grandes. Salmonella serotipo Typhi no crece en Figura. Salmonella serotipo
[5]
este medio. Typhi no crece en el agar TCBS
[6]
Técnica de inoculación por agotamiento de estría.

Los coprocultivos deben realizarse de manera semicuantitativa usando asas metálicas normales.
Con este método se obtiene información sobre la cantidad del microorganismo presente en la
muestra de estudio acorde al crecimiento bacteriano en las distintas estrías realizadas en el medio:
escaso, moderado o abundante.
De igual manera, la técnica permite obtener colonias aisladas que facilitan tanto las pruebas de
identificación como el desarrollo del antibiograma. La técnica de inoculación es la siguiente:
Inóculo
Figura. Técnica de inoculación de la placa de agar para cultivo de heces.

1. Introducir de manera vertical un hisopo estéril en la muestra de heces, en seguida se coloca
y estría completamente una sección de la superficie de la placa.
2. Con un asa metálica previamente esterilizada en la flama del mechero, toque la muestra
colocada y estríe una parte de la superficie del medio suavemente. La estría debe ser
estrecha para favorecer el aislamiento y análisis de las muestras.
3. Esterilice y enfríe el asa, proceda a estriar el segundo sector, para ello cruce tres de las
estrías con el primer sector para arrastrar microorganismos.
4. Realice el proceso anterior para estriar el tercer sector de la superficie del agar. Al término
del proceso esterilice el asa.
Incube a 36 °C durante 18 a 24 horas en condiciones de microaerofilia la placa de agar sangre, en
tanto que la placa con el agar MacConkey, agar Salmonella-Shigella, agar XLD y agar TCBS se incuba
bajo los mismos parámetros, pero en aerobiosis.
Resultados coprocultivo
(a)
(b) (c)
(d)
Figura. Análisis de las placas correspondientes al cultivo de heces.
(a) Agar sangre. A las 24 horas de incubación se observó en cantidad moderada microbiota normal
en la placa que fue inoculada directamente, no se apreció alguna colonia en mayor proporción al
resto, esta misma situación sucedió en la placa sembrada con la muestra que fue previamente
inoculada e incubada en el caldo selenito. Sin embargo, en esta última se observó el crecimiento
abundante de microbiota, como se aprecia en la imagen correspondiente.
[7]
Bacteriología Médica. Nathael Briseño Núñez
(b) Agar MacConkey. A las 24 horas de incubación se observaron tanto colonias fermentadoras
como no fermentadoras de lactosa, la propoción de esta última morfología fue menor. Dentro de las
colonias no fermentadoras se identificaron algunas que tenía un precipitado negro en el centro de
la colonia, dicha evidencia orienta a la presencia presuntiva de un enteropatógeno.
Por otro lado, en la placa que fue sembrada con el inóculo proveniente del caldo selenito se apreció
el crecimiento de microbiota en modera cantidad, en tanto que las colonias no fermentadoras con
precipitado negro crecieron hasta la última estría, como se muestra en la imagen superior.
(c) Agar XLD. Una vez transcurrido un día de incubación se analizó la placa, se observaron colonias
fermentadoras de xilosa y lactosa en moderada cantidad (microbiota), así mismo se identificaron
colonias rosadas traslúcidas que contenía un precipitado negro, , esta misma evidencia se observó
también en la placa sembrada con la muestra que fue previamente inoculada e incubada en el caldo
selenito. Se apreció crecimiento de este tipo de colonias en abundante cantidad en ambas placas.
(d) Agar SS. En el caso de este medio de cultivo, se observó el crecimiento abundante de colonias
incoloras que contenía un precipitado negro tanto en el centro como entorno a la colonia, como se
aprecia en la imagen adjunta. La evidencia encontrada se comparó y confirmó al momento de
analizar la placa que fue sembrada con el inóculo proveniente del caldo selenito, por lo cual estas
colonias orientan a la presencia presuntiva de un enteropatógeno como Salmonella.
Agar TCBS. No se observó crecimiento bacteriano a las 24 horas de incubación. Sin embargo, para
eliminar cualquier duda o sospecha se decidió reincubar por 12 horas adicionales, una vez que
transcurrió este lapso se analizó la placa, no se observó crecimiento del inóculo.
III. Análisis microscópico y descripción macroscópica de la muestra.

Descripción macroscópica de la muestra
La muestra de heces presentaba una consistencia
semilíquida, mucoide, de aspecto purulento de color
marrón amarillento. El olor que desprendía era fétido e
intenso al mínimo contacto.
No se observó la presencia de coágulos o residuos
sanguíneos, tampoco se apreciaron residuos orgánicos,
Figura. Muestra de heces. alimenticios u otros hallazgos de interés clínico.
Análisis microscópico de la muestra

Tinción con azul de metileno.
Objetivo: determinar rápidamente la naturaleza del proceso infección de la enfermedad diarreica, lo
cual es de gran ayudad, así mismo la técnica tiene un alto grado de confiabilidad ya que se
fundamente en la cuantificación de leucocitos fecales.
Especificaciones Material y reactivos.
o Tipo de análisis: fresco
 Solución de azul de metileno al 1%.
o Tinción: azul de metileno
 Lámina y laminilla nuevas.
o Aumento: 10X y 40X
o Análisis cuantitativo: leucocitos  Muestre de heces.
[8]
Procedimiento de la
1. Colocar una pequeña cantidad de moco o heces en una lámina
nueva, adiciones 2-3 gotas de azul metileno al 1% y mezcle.
2. Cubra con una laminilla, espere de 2 a 3 minutos con la finalidad
de
obtener una buena coloración nuclear.
3. Observar al microscopio al menos 20 campos de amplificación Figura. Tinción del fresco.
efectivos y distintos con los objetivos secos: 10X y 40X.
Interpretación
La presencia de 5 o más leucocitos por campo microscópico sugiere la presencia de un agente
enteroinvasor. La ausencia de células inflamatorias sugiere la presencia de un agente toxigénico.
Resultados
En el análisis en fresco de la muestra de heces se
obtuvo un rango promedio de 7-9 leucocitos por
campo de amplificación, lo cual sugiere la presencia
de un agente enteroinvasor. En la imagen adjunta se
representa los leucocitos encontrados en un campo
Figura. Análisis de un campo de amplificación. de amplificación.
Ahora
Ahorabien,
bien,para
para orientar de mejor
orientar de mejor manera
maneraelelprocedimiento
procedimientoanalítico
analítico a seguir
a seguir concon la muestra
la muestra de
de l
heces se hará una tinción de Gram, la cual permitirá relacionar los resultados microscópicos con el
heces se hará una tinción de Gram, la cual permitirá relacionar los resultados microscópicos con
posible agente enteroinvasor causante de la infección diarreica.
Tinción de Gram
Objetivo: permite orientar al laboratorista acerca del posible agente enteroinvasor con base en el
conteo diferencial de leucocitos polimorfonucleares y mononucleares.
Especificaciones Reactivos
o Tipo de análisis: frotis  Solución de cristal violeta.
o Tinción: Gram  Solución de yodo lugol

(mordiente).
o Aumento: 100X
 Solución de acetona-alcohol
etílico 95% 1:1 (decolorante).
o Análisis: conteo diferencia de leucocitos
mononucleares y polimorfonucleares;  Solución de safranina
morfología bacteriana u otros hallazgos de
interés clínico.
Procedimiento de la técnica
 Preparación de frotis.
1. En este caso, al tener una muestra de heces semilíquida, se debe
colocar una pequeña cantidad de muestra con un asa estéril en el
centro de la lámina, en seguida se realiza un extendido circular
para favorecer la dispersión y el análisis; evite la formación de
grumos.
2. Permita el secado por algunos minutos de la muestra, o bien
pase la lámina rápidamente por la flama del mechero, evite el
sobrecalentamiento.
3. Una vez que la muestra está seca se fija pasándola rápidamente
3 veces por la flama del mechero. Evite el sobrecalentamiento y, Figura. Representación gráfica de la
[9]
con ello, la alteración de las estructuras bacterianas elaboración de un frotis.
[1
0]
 Procedimiento de la tinción de Gram.

1. Tome cuidadosamente el frotis realizado, coloque la lámina cuidadosamente sobre una bandeja.
2. Cubra la superficie de la laminilla con solución de cristal violeta. Después de 1 minuto de
exposición, lavar minuciosamente con agua destilada o buffer.
3. El siguiente paso consiste en cubrir el extendido con la solución de yodo (mordiente), de igual
manera una vez pasado 1 minuto de exposición, escurra el reactivo y lave con chorro suave de agua.
4. Sostener el extendido entre el pulgar y el índice en forma vertical y usando un fondo blanco,
decolore añadiendo gota a gota la solución de alcohol-cetona hasta que no se arrastre más cristal
violeta. Este es el paso crítico de la tinción. Lave inmediatamente con un chorro suave de agua.
5. Finalmente, cubrir la muestra con safranina y déjela actuar durante 1 minuto. Después escurra el
colorante y lave con un chorro suave de agua. Deje secar al aire el portaobjeto.
6. Coloque un cubreobjeto sobre la muestra. Observe la preparación al microscopio bajo el objetivo
de inmersión, analice al menos 20 campos de amplificación efectivos y distintos.
Figura. Representación gráfica del procedimiento correspondiente a la tinción de Gram.
Nota: respete tanto los intervalos establecidos para reactivos como la cantidad de cada uno de ellos.
Resultados
En el frotis de la muestra se heces se analizaron Se observaron abundantes bacilos intracelulares

20 campos de amplificación distintos, se obtuvo gram negativos sin disposición o arreglo entre
un rango promedio para los leucocitos ellos, como se muestra en la imagen superior.
polimorfonucleares de 2-4, mientras que para Posible agente etiológico de la infección.
los
leucocitos monoculares el rango fue de 17-19.
[1
1]
IV. Diagrama dicotómico para la identificación.

Salmonella serotipo Typhi
Tinción de Gram y morfología de la colonia

Bacilos gram negativos Bacilos gram positivos
Diferenciación inicial de bacilos gram negativos de acuerdo con

la prueba de la oxidasa
Negativa Positiva
Diferenciación de bacilos gram negativos oxidasa negativa de acuerdo con su

crecimiento en el agar hierro de Kligler y agar hierro triple azúcar.
K/A(+), no gas
K = superficie
alcalina A = fondo
ácido
(+) = producción de H2S
Diferenciación inicial de bacilos gram negativos oxidasa negativa con crecimiento en

el agar hierro de Kligler y agar hierro triple azúcar K/A(+);no gas de acuerdo con la
prueba de ureasa, movilidad e indol.
Ureasa: –
Movilidad: +
Indol: -
Pruebas serológicas para la diferenciación de especies de Salmonella.
Vi y D serología en lámina positivas
Salmonella serotipo Typhi
[12]
V. Protocolo para pruebas bioquímicas.

a. Tinción de Gram.
Consulte el apartado III, en donde se describe el procedimiento de la técnica.
Se observó la presencia de bacilos gram negativos sin agrupación o arreglo específico.
b. Prueba de la oxidasa.
Prueba de la oxidasa
 Fundamento.
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se
debe a la presencia de un sistema citocromo c oxidasa que activa la oxidación del citocromo, el cual
es reducido por el oxígeno molecular produciendo agua o peróxido de hidrógeno según la especie
bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena
transportadora de electrones.
Por lo general, el sistema citocromo c oxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos
anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo, pero los anaerobios estrictos
carecen de actividad oxidasa.
Se emplean tiras o disco de papel impregnadas con el reactivo p-amino-N-dimetil-anilina, que se
oxida por la presencia de la citocromo-oxidasa, como se aprecia en la siguiente ecuación química,
produciendo un color azul-morado en una reacción positiva.
Procedimiento de la técnica
1. Recoja de una a dos colonias puras de un cultivo fresco de la
bacteria sospechosa con un asa o palillo de madera.
2. Coloque uniformemente la muestra sobre la tira o disco de
papel impregnado con el reactivo mencionado.
3. Observe el cambio de coloración instantáneo. Negativo Positivo
Resultados: Control de calidad:
Control calidad:
 Positivo: coloración púrpura, es decir, el Control positivo: Pseudomonas
 Streptococcus aeruginosa
pyogenes
microorganismo sí tiene está enzima. ATCC 27853. ATCC 19615
 Negativo: coloración amarilla o grisácea, el Control sensible.
negativo: Escherichia coli ATCC
microorganismo carece de la enzima. 25922
 Streptococcus agalactiae
El bacilo gram negativo aislado presentó una prueba negativa a la prueba de la oxidasa.
[13]
c. Pruebas bioquímicas empleadas en el sistema API 20E.
El sistema API 20E permite la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros

bacilos Gram negativos, mediante 23 pruebas bioquímicas estandarizadas, miniaturizadas y
relacionadas con una base de datos. Este sistema puede identificar 108 géneros y 104 especies de
estas bacterias. La galería API 20E consta de 20 microtubos que contienen los sustratos liofilizados
de las pruebas bioquímicas tradicionales.
Por lo tanto, si se sospecha que el microrganismo aislado en el coprocultivo es un bacilo gram
negativo enteropatógeno, oxidasa negativa debe seleccionarse este sistema.
Montaje API 20E

1. Preparación del estándar del McFarland 0.5
Reactivos:
 Solución de cloruro de bario dihidratado (BaCl2•2H2O) al 1.175 % (p/v)
 Solución de ácido sulfúrico (H2SO4) al 1 % (v/v).
Procedimiento:
I. Añada 0.5 mL de cloruro de bario dihidratado (BaCl2•2H2O) al 1.175 % (p/v) a 99.5 mL de
una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) al 1 % (v/v).
II.
Mezcle suavemente por algunos minutos, una vez que se haya obtenido la suspensión de
interés sepárela de tal manera que se coloquen volúmenes iguales a distintos tubos de
ensayo o viales.
III.
El siguiente paso consiste en sellar cada tubo con cera, parafilm u otro medio similar para
prevenir su separación.
IV.
Realice una evaluación espectrofotométrica o microbiológica del estándar 0.5 de McFarland
recién elaborado.
Nota: la turbidez estándar 0.5 de Mc Farland se puede guardar o almacenar hasta 6 meses en la
oscuridad a temperatura ambiente después de su elaboración. Antes de tomar como referencia este
patrón, es necesario verificar tanto el nivel como el estado de la suspensión, si nota un cambio
deseche el estándar. Si cumple con lo anterior agite vigorosamente el tubo antes de hacer la
comparación.
El patrón 0.5 de McFarland equivale a una suspensión bacteriana de 1.5X108 UFC/mL.
Montaje API 20E
2. Preparación de la suspensión bacteriana 0.5 del estándar de McFarland.
Coloque en un tubo de ensayo 5 mL de solución de NaCl 0.85 %.
Identifique en el medio de cultivo una colonia aislada, en seguida
esterilice el asa en el mechero, abra la caja y cuidadosamente tome la
colonia, colóquela en el tubo con la solución salina, esterilice tanto la
boquilla del tubo como el asa. Agite vigorosamente en el vórtex o
manualmente.
Compara la turbidez de la suspensión con el estándar 0.5 de
McFarland, como se aprecia en la figura adjunta. Realice el
procedimiento anterior con cada colonia bacteriana que coloque en
la solución salina hasta obtener la turbidez deseada.
Figura. Comparación de la
suspensión bacteriana con el
Nota: si la turbidez es mayor, se recomienda comenzar de nuevo. estándar 0.5 de McFarland
[14]
2. Inoculación de los sustratos liofilizados.

a. Antes de iniciar cualquier procedimiento, sin retirar la tira de su cámara identifique que cada
pocillo tiene un tubo y una cúpula. En seguida retire tanto la tapa como la tira de la cámara y
coloque agua estéril en lo pocitos que se encuentran en la base, los cuales proporcionaran la
humedad necesaria durante la incubación.
Figura. Sistema API 20E sin inocular, note que cada pocillo tiene un tubo y una cúpula.
b. Coloque la tira sobre su correspondiente base, el sistema puede

colocarse en la base del mechero para facilitar el llenado de los
pocitos debido a la inclinación.
Vierta el volumen adecuado de la suspensión bacteriana
estandarizada en cada uno de los pocitos, como se aprecia en la
figura adjunta. Evite en todo momento la generación de burbujas,
la adición incorrecta de volumen y la contaminación de la punta de
Figura. Proceso de inoculación de la
la micropipeta. primera sección de la galería.
c. Una vez que haya terminado el llenado de los pocitos, recueste la placa sobre la mesa de trabajo y
adicione aceite mineral en las cúpulas de las pruebas subrayadas: ADH, ODC, H2S, URE para obtener
condiciones de anaerobiosis. Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de
bacterias estandarizada.
Figura. Llenado de las cúpulas con aciete mineral (imagen izquierda) y solución bacteriana (imangen derecha) acorde
a las pruebas bioquímicas mencionada anteriormente.
d. Cubra la cámara con su respectiva tapa e incube a 37 °C durante 18-24 h.
Revelado API 20E

Antes de analizar los resultados obtenidos, es preciso recordar que la galería API 20E consta de 20
microtubos que contienen los sustratos liofilizados de las pruebas bioquímicas tradicionales, es
decir, cada prueba evalúa una actividad metabólica del microrganismo de estudio; por ende, es muy
importante recordar el principio bioquímico de cada una a fin de que sea posible hacer una relación
entre la evidencia colorimétrica con el perfil fenotípico de la bacteria.
A continuación, se presenta una tabla que describe brevemente las pruebas que contiene el sistema
junto con los posibles resultados.
[15]
1. Revelado del sistema API 20E.

a. Retire la cámara de la incubadora, déjela reposar por unos minutos. En seguida adicione a las
pruebas VP, IND y TDA los reactivos correspondientes señalados por el proveedor, con lo cual será
posible obtener un resultado en cada una de ellas.
Figura. Proceso de adicion de los reactivos a las pruebas IND (ilustración izquierda) y VP (ilustracion derecha).
[16]
b. Una vez que hayan pasado 10 minutos después de la adición de los reactivos anteriores, realice el
análisis correspondiente. Recuerde que la lectura de los resultados se lleva a cabo por
comparación de los colores de cada pocillo con los de la tabla de lectura, en ella se muestra
gráficamente la diferencia entre una prueba positiva y una negativa.
Figura. Resultados esperados para la identificación de Salmonella spp. con el sistema API 20E.
Figura. Tabla de lectura del sistema API 20E.
c. Del conjunto de reacciones anteriores con sus respectivos resultados, derivados de la comparación
con la tabla de lectura, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Observe que los pocillos están
separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (la prueba número
21 corresponde a la prueba de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4.
  Si Si
lala reacción
reacción eses negativa
negativa
Figura. sese
Perfil pone
pone 0.0. esperado para Salmonella spp.
numérico
  Si Silalareacción
reacciónesespositiva
positivasesepone:
pone:1 1sisieseselelprimer
primerpocillo
pocillode
deununtriplete,
triplete,22sisieseselel
segundo,
segundo,4 4si si eseselel
tercero.
tercero.Anote
Anote cada
cada valor
valorenen
lala
hoja
hoja
dederegistro.
registro.
  SeSe suman
suman loslos valores
valores dede cada
cada tripletey se
triplete y se obtiene
obtiene unun código
código dede
7 7digitos.
dígitos.
 Busque el código en la tabla de identificación o
 Con este código se busca en la tabla de identificación o en la base de en la base de datos la especie
datos la especie dede
lalabacteria
bacteriainoculada
inoculadaenen elel sistemaAPI
sistema API20E.
20E.
-+++++-----+++++-+-+-
6 7 0 4 7 5 2
[17]
d. Con base en la clave numérica obtenida se realiza la búsqueda del perfil numérico en la Tabla de
identificación del sistema API 20E (API 20E Analytical Profile Index, Bio-Mériux 2019) o en el
software APILAB (Bio-mériux), para determinar el género y la especie de la cepa aislada. En caso
de no contar con la bibliografía mencionada, se podrá consultar el Bergey’s Manual para la
identificación de la cepa aislada con base en los resultados de las pruebas bioquímicas.
e. En este caso, tomando como referencia el perfil numérico 6704752 el manual que contiene la
Tabla de identificación del sistema API 20E, nos señala que el microrganismo aislado pertenece al
género Salmonella, de igual manera nos señala que la identificación tiene una confianza del 99.9%
como nota adicional. Por lo tanto, para determinar la especie de este enteropatógeno se procederá
a realizar su identificación serológica con el kit correspondiente.
d. Prueba serológica para la determinación de la especie de Salmonella.
Kit de prueba para Salmonella mediante aglutinación de látex
Las especies de Salmonella se serotipifican según sus antígenos O (somáticos), antígenos V i
(capsulares) y antígenos H (flagelares). La fórmula antigénica de los serotipos de Salmonella se
enumera en el esquema de Kauffman-White.
La prueba utiliza partículas de látex sensibilizadas con antisueros polivalentes contra la amplia
gama de antígenos de Salmonella y puede detectar la mayoría de las especies comunes de
Salmonella, este sistema permite obtener resultados sencillos, rápidos y sensibles.
Procedimiento para la determinación serológica
Si se sospecha de la presencia de Salmonella serotipo Typhi deben analizarse serológicamente
1. Preparación de la suspensión bacteriana.
con
Coloque en un
antisueros de tubo de ensayo
Salmonella 5 mLdel
Vi y “O” degrupo
solución de cuales
D, los NaCl 0.85 %.positivos.
serán
Identifique en un medio de cultivo puro, no selectivo y fresco
En algunas ocasiones, algunas cepas de Salmonella serotipo Paratyphi C serán también positivas
una colonia aislada de Salmonella de interés clínico, en seguida
con el antisuero Vi, la diferenciación se puede realizar analizando su crecimiento en el agar
con un asa estéril tome la colonia y colóquela en el tubo con la
solución salina, esterilice tanto la boquilla del tubo como el asa.
Agite vigorosamente en el vórtex o manualmente.
Compara la turbidez de la suspensión con el estándar 0.5 de
McFarland, como se aprecia en la figura adjunta. Realice el
procedimiento anterior con cada colonia bacteriana que coloque
en la solución salina hasta obtener la turbidez deseada o bien
Figura. Elaboración de la suspensión
hasta que perciba turbidez en el tubo. bacteriana para la determinación
serológica del grupo de Lancefield.
2. Adición de los anticuerpos de Salmonella
Coloque una gota de la suspensión bacteriana en cada uno de
los pozos señalados en la lámina del kit. Adicione una gota del
antisuero O del grupo D a un pocito, al siguiente adicione una
gota del antisuero Vi. El tercer sitio se usa como control.
Notan: antes de agregar los antisueros los frascos deben ser
mezclados cuidadosamente. Durante la adición deben estar
totalmente en vertical, la distancia entre la punta del frasco y la
superficie de la tarjeta no sea mayor a 1 cm. Figura. Montaje y adición de los
antisueros de grupo en la lámina.
3. Mezcla de la muestra con su respectivo anticuerpo.
[18]
Con ayuda de un aplicador estéril mezcle ambas gotas

suavemente por toda la superficie circular del pozo.
Al finalizar, puede realizar lentamente movimientos circulares
de la lámina, como se observa en la imagen adjunta. Evite la
contaminación cruzada entre los pocitos o el derrame de estos.
Figura. Proceso de homogenización.
4. Análisis de lámina.
Observe la aglutinación en la circunferencia de cada pocito,
compruebe su resultado con los controles tanto positivo como
negativo.
En este caso, la fórmula antigénica obtenida corresponde a
Salmonella serotipo Typhi, debido a que se observó
aglutinación tanto para el antisuero de Salmonella Vi y “O” del Figura. La cepa de Salmonella
grupo D. aislada arrojó una fórmula
antigénica para S. serotipo Typhi.
5. Desecho de la lámina.
Al finalizar el análisis, se colocó la placa en solución de hipoclorito de sodio, posteriormente se
desechó en el bote de basura.
VI. Protocolo para antibiograma.

Antibiograma para Salmonella serotipo Typhi
Salmonella serotipo Typhi, es una bacteria gram negativa perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae, es el agente etiológico causante de la fiebre tifoidea. La OMS estima que cada
año contraen este padecimiento clínico entre 11-20 millones de personas en todo el mundo; por
ende, tanta su identificación como correspondiente prueba de sensibilidad antimicrobiana son
fundamentales para el control de brotes, vigilancia epidemiológica, estudio e investigación de
nuevos medicamentos.
Tomando como referencia los datos clínicos del paciente, la muestra procesada y el documento CLSI
M100-ED31:2021, la lista de antibióticos seleccionados para su evaluación de rutina en el
antibiograma es:
Ampicilina Ciprofloxacina Trimetoprima-sulfametoxazol
Nota: paraSalmonella
Nota: para Salmonellaspp.
spp. los aminoglucósidos,
los aminoglucósidos, las cefalosporinas
las cefalosporinas de yprimera
de primera segunday segunda
generación
generación y las cefamicinas pueden parecer activas in vitro, pero no son efectivas clínicamente y
y las
no cefamicinas
deben pueden
notificarse como parecer activas in vitro, pero no son efectivas clínicamente y no
susceptibles.
A continuación, se presenta una tabla con la selección de los antibióticos a evaluar con sus
respectivos rangos para la interpretación y asignación de categorías.
[1
El documento CLSI M100-ED31:2021 señala que el antibiograma se montará con el método Kirby-
Bauer. A continuación, se describe con más detalle las características que debe tener la técnica, las
cuales fueron obtenidas de la referencia señalada.
Características de la técnica Selección de antibióticos

 Medio de cultivo: Agar Mϋeller-Hinton.  Ampicilina
 Inóculo: suspensión bacteriana equivalente al
estándar 0.5 de McFarland.
 Cepa control: Escherichia coli ATCC 25922  Ciprofloxacina
 pH: 7.2 – 7.4
 Grosor del medio: 4mm  Trimetoprima-sulfametoxazol
 Incubación 35°C ± 2°C por 16-18 horas.
Notas: para la difusión del disco, pruebe un máximo de 12 discos en una placa de 150 mm y no más de
6 discos en una placa de 100 mm; los discos deben colocarse a no menos de 24 mm de distancia, de
centro a centro.
El caldo de hemocultivo positivo se puede usar como inóculo para la prueba de difusión directa en
disco para ampicilina y trimetoprima-sulfametoxazol. La incubación se realiza en las mismas
condiciones.
Diseño antibiograma
Tomando como referencia el valor bibliográfico acerca del punto de corte para la zona de inhibición de
cada uno de los halos de sensibilidad de Salmonella serotipo Typhi para la serie de antibióticos
seleccionados:
Antibiótico Diámetro del halo sensibilidad (mm)
Ampicilina ≥ 17
Ciprofloxacina ≥ 31
Trimetoprima-sulfametoxazol ≥ 16
Con base en el dato anterior, se optó por montar el antibiograma por el Método de Kirby-Bauer en una
placa de 10 cm, en el siguiente esquema se muestra el diseño del antibiograma.
[16]
Ampicilina
Trimetoprima-sulfametoxazol
Ciprofloxacina
10 cm
Figura. Diseño del antibiograma para P. aeruginosa aislado de la muestra de heces.
Método Kirby-Bauer
1. Preparación de la suspensión bacteriana.
Coloque en un tubo de ensayo 5 mL de solución de NaCl 0.85 %.
Identifique en el medio de cultivo una colonia aislada, con un asa
estéril tome la colonia, colóquela en el tubo con la solución salina y
esterilice tanto la boquilla del tubo como el asa. Agite vigorosamente en
el vórtex o manualmente.
Compara la turbidez de la suspensión con el estándar 0.5 de McFarland,
como se aprecia en la figura adjunta. Realice el procedimiento anterior
con cada colonia bacteriana que coloque en la solución salina hasta Figura. Comparación de la
obtener la turbidez deseada. suspensión bacteriana con el
estándar 0.5 de McFarland
Nota: si la turbidez es mayor, se recomienda comenzar de nuevo.
2. Siembra del inóculo en el medio Mϋeller-Hinton.
Introduce un hisopo estéril a la suspensión bacteriana estandarizada,
elimine el exceso de muestra rotando el hisopo en la pared del tubo. En
seguida inocule toda la superficie de la placa con el hisopo. Gire 90° la
placa y extienda nuevamente el hisopo por todo el medio. Realice el
proceso anterior tres veces.
Al finalizar el paso anterior, pase el hisopo por toda la circunferencia de Figura. Inoculación de la
la placa en un par de ocasiones. Deseche el hisopo en su contenedor suspensión bacteriana por
correspondiente. toda la superficie de la placa.
3. Aplicación de los discos e incubación.

 Colocación manual.
Con unas pinzas estériles tope cuidadosamente uno de los discos,
colóquelo en la posición predeterminada en el del antibiograma.
Presione un poco la superficie del disco para asegurar su posición.
Esterilice la punta de las pinzas, deje enfriar un momento y repita el
proceso anterior con cada uno de los cinco discos.
Figura. Colocación manual de
los discos en el medio.
[17]
 Dispensador de discos.
En este caso, coloque cuidadosamente el contenedor de cada uno de
los discos en la posición y orden acorde al diseño previamente
elaborado. En seguida, ubique el dispensador sobre la placa, presione
ligeramente el dispositivo y retire el dispensador. Verifique la posición
de cada uno de los discos.
Nota: los discos deben de encontrarse a temperatura ambiente antes
de ser colocados, para ello retírelos del refrigerador y manténgalos en
una Figura. Colocación de los discos
posición segura por una o dos horas. No tome el disco con las pinzas
con el dispensador.
calientes.
4. Incubación.
Coloque la placa en la incubadora a 35°C ± 2°C por 16-18 horas.
Posibles resultados: Antibiograma
Resultado obtenido en el antibiograma por el Método de Kirby-Bauer de la cepa de Salmonella serotipo

Typhi aislada de la muestra de heces.
Ampicilina
Trimetoprima-sulfametoxazol
Ciprofloxacina
10 cm
Figura. Resultado del antibiograma para Salmonella serotipo Typhi aislada de la muestra de heces.
Punto de corte para cada zona (mm) Resultado halo

Antibiotico S SDD I R Interpretación
(mm)
Ampicilina ≥ 17 - 14-16 ≤ 13 10 Resistente
Ciprofloxacina ≥ 31 - 21-30 ≤ 20 22 Intermedio
Trimetoprima-
≥ 16 - 11-15 ≤ 10 9 Resistente
sulfametoxazol
Por lo tanto, la cepa aislada de Salmonella serotipo Typhi de la muestra de heces es resistente a
ampicilina y trimetoprima-sulfametoxazol, pero presenta una sensibilidad intermedia a ciprofloxacina.
[18]
Resumen coprocultivo con antibiograma

Sección Resultado
a) Análisis microscópico
Fresco: azul de metileno al 1 %
Se observaron 7-9 leucocitos por campo de amplificación 40X, el valor de referencia para un coteo de más
de 5 leucocitos por campo de amplificación sugiere la presencia de microorganismo enteroinvasor.
Frotis: tinción de Gram
1. Leucocitos polimorfonucleares: 2-4 por campo de amplificación 100X
2. Leucocitos mononuclares: 17-19 por campo de amplificación 100X
3. Bacterias Abundantes bacilos intracelulares gram negativos por campo

de amplificación 100X
b) Cultivo
Micorbiota normal en moderada cantidad a las 48 horas de incubación.
Se aisló Salmonella serotipo Typhi en abundante cantidad a las 48 horas de incubación.
c) Antibiograma
1. Ampicilina Resistente
2. Ciprofloxacina Intermedio
3. Trimetoprima-sulfametoxazol Resistente
VII Referencias consultadas.

 MacFaddin, J. F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia
clínica. Ed. Médica Panamericana, páginas :344-346, 673-677
 Leboffe, M. J., & Pierce, B. E. (2011). A photographic atlas for the microbiology laboratory. Morton
Publishing Company, páginas: 9, 13, 16-20, 87-89, 156
 Ryan, I., & Kenneth, J. (2005). Sherris Microbiología Médica: una introducción a las enfermedades
infecciosas. McGraw-Hill Interamericana, páginas: 301-303, 702-708
 OMS (2004) Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los
Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en
Desarrollo. Centro de Recursos de Información
 Vila, J., Álvarez-Martínez, M. J., Buesa, J., & Castillo, J. (2009). Diagnóstico microbiológico de las
infecciones gastrointestinales. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 27(7), 406–411.
doi:10.1016/j.eimc.2008.11.009
 Sanz, C., Usera, M., Reina, J., Vasallo, F., & Cardeñoso, L. (1994) Gastroenteritis bacteriana, víricas,
parasitarias y toxi-infecciones alimentarias. Procedimiento de Microbiología Médica; Sociedad
Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica
 ISSSTE, (2011) INSTRUCTIVO PARA LA TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS DE HECES PARA DIAGNÓSTICO
DE ENFERMEDAD DIARREICA AGUDA. Red Institucional de Vigilancia Epidemiológica por Laboratorio
(RIVELISSSTE).
[19]
 CLSI M100-ED31:2021 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 31st Edition
 API BIOMERIEUX. (2010) SISTEMAS MINIATURIZADOS API. API 20E. Recuperado de
https://www.biomerieux.com.mx
 Thermo Scientific™. (2016) Kit de prueba para Salmonella mediante aglutinación de látex.
Recuperado de https://www.fishersci.es/shop/products/salmonella-test-kit-using-latex-
agglutination/10557473
[20]

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Universidad de Guanajuato

División de Ciencias Naturales y Exactas

Cynthia Donají Negrete Palacios

Cultivo de heces con antibiograma positivo para Salmonella serotipo Typhi

Datos de identificación del paciente Fecha 19/Mayo/2021

A. Pida al paciente que coloque el dispositivo de B. El paciente deberá defecar en el dispositivo

Nota: Al finalizar el procedimiento deseche el dispositivo de recolección, coloque la muestra en una

Conservación y transporte de la muestra: Si la muestra no se cultiva de inmediato, antes de las

II. Medios para el aislamiento.

La inoculación de la muestra de heces se realiza en dos momentos. En el primero de ellos se realiza la

Medios para el aislamiento de Salmonella serotipo Typhi.

Técnica de inoculación por agotamiento de estría.

Figura. Técnica de inoculación de la placa de agar para cultivo de heces.

III. Análisis microscópico y descripción macroscópica de la muestra.

Análisis microscópico de la muestra

o Análisis cuantitativo: leucocitos  Muestre de heces.

o Tinción: Gram  Solución de yodo lugol

 Procedimiento de la tinción de Gram.

Figura. Representación gráfica del procedimiento correspondiente a la tinción de Gram.

En el frotis de la muestra se heces se analizaron Se observaron abundantes bacilos intracelulares

IV. Diagrama dicotómico para la identificación.

Tinción de Gram y morfología de la colonia

Diferenciación inicial de bacilos gram negativos de acuerdo con

Diferenciación de bacilos gram negativos oxidasa negativa de acuerdo con su

Diferenciación inicial de bacilos gram negativos oxidasa negativa con crecimiento en

Pruebas serológicas para la diferenciación de especies de Salmonella.

Vi y D serología en lámina positivas

Salmonella serotipo Typhi

V. Protocolo para pruebas bioquímicas.

Consulte el apartado III, en donde se describe el procedimiento de la técnica.

Se observó la presencia de bacilos gram negativos sin agrupación o arreglo específico.

c. Pruebas bioquímicas empleadas en el sistema API 20E.

El sistema API 20E permite la identificación de bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otros

Montaje API 20E

2. Inoculación de los sustratos liofilizados.

b. Coloque la tira sobre su correspondiente base, el sistema puede

d. Cubra la cámara con su respectiva tapa e incube a 37 °C durante 18-24 h.

Revelado API 20E

1. Revelado del sistema API 20E.

Figura. Tabla de lectura del sistema API 20E.

Con ayuda de un aplicador estéril mezcle ambas gotas

VI. Protocolo para antibiograma.

Características de la técnica Selección de antibióticos

3. Aplicación de los discos e incubación.

Posibles resultados: Antibiograma

Resultado obtenido en el antibiograma por el Método de Kirby-Bauer de la cepa de Salmonella serotipo

Punto de corte para cada zona (mm) Resultado halo

Resumen coprocultivo con antibiograma

Fresco: azul de metileno al 1 %

Frotis: tinción de Gram

1. Leucocitos polimorfonucleares: 2-4 por campo de amplificación 100X

2. Leucocitos mononuclares: 17-19 por campo de amplificación 100X

3. Bacterias Abundantes bacilos intracelulares gram negativos por campo

Micorbiota normal en moderada cantidad a las 48 horas de incubación.

Se aisló Salmonella serotipo Typhi en abundante cantidad a las 48 horas de incubación.

VII Referencias consultadas.

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