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com
Generación de células madre pluripotentes humanas
hipoinmunógenas
Xiaohana,b, Mengning Wanga,b,1, Songwei Duana,b,1, Pablo J. Francoa,b, Jennifer Hyoje-Ryu Kentya,b, Preston Hedricka,b,
Yulei Xiaa,b, Alan Allena,b, Leonardo M.R. Ferreiraa B C, Jack L. Stromingera,b,2, Douglas A. Meltona,b, Torsten B.
Meissnera,b,d,e,2y Chad A. Cowana,b,d,e,f,2
aDepartamento de Células Madre y Biología Regenerativa, Universidad de Harvard, Cambridge, MA 02138;bInstituto de Células Madre de Harvard, Universidad de Harvard,
Cambridge, MA 02138;CDepartamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de Harvard, Cambridge, MA 02138;dDivisión de Medicina Cardiovascular, Centro Médico Beth
Israel Deaconess, Boston, MA 02115;miDepartamento de Medicina, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA 02115; yFBroad Institute del MIT y Harvard, Cambridge, MA
02142
Contribuido por Jack L. Strominger, 27 de marzo de 2019 (enviado para revisión el 12 de febrero de 2019; revisado por Marco Colonna y David H. Sachs)
Los HLA polimórficos forman la principal barrera inmunitaria para la terapia
celular. Además, la vigilancia inmune innata afecta el injerto celular, pero falta
una estrategia para controlar tanto la inmunidad adaptativa como la innata.
Aquí empleamos la edición múltiple del genoma para eliminar específicamente
la expresión de HLA-A/-B/-C y HLA clase II altamente polimórficos en células
madre pluripotentes humanas. Además, para prevenir el rechazo inmunológico
innato y suprimir aún más las respuestas inmunes adaptativas, expresamos los
factores inmunomoduladores PD-L1, HLA-G y la señal de macrófago "no me
comas" CD47 delAAVS1lugar de puerto seguro. Utilizando inmunoensayos in
vitro e in vivo, encontramos que las respuestas de las células T estaban
atenuadas. Además, la destrucción de células NK y la fagocitación de
macrófagos de nuestras células diseñadas fueron mínimas. Nuestros resultados
describen un enfoque que se dirige eficazmente a las respuestas inmunes tanto
adaptativas como innatas y, por lo tanto, puede permitir la terapia celular a una
escala más amplia.
| | |
alobarrera HLA células NK macrófagos terapia celular | a la vigilancia inmune por parte de las células T, las células NK y los macrófagos,
ingeniería de células madre
A
El principal obstáculo para la terapia celular es el rechazo de las células
alogénicas por parte del sistema inmunológico del receptor. Sin embargo,
múltiples limitaciones prohíben el uso más amplio de bancos de células con
haplotipos HLA definidos y células madre pluripotentes inducidas (iPSC)
específicas del paciente (1, 2), lo que enfatiza la necesidad de productos
celulares universales "listos para usar". La ablación de las moléculas HLA
altamente polimórficas de clase Ia y clase II es necesaria para prevenir la
activación del CD8 citotóxico.+T y CD4+Células T colaboradoras. Recientemente,
el poder del sistema de edición del genoma CRISPR/Cas9 nos proporcionó a
nosotros y a otros una herramienta para interferir con la expresión de HLA clase
I en células madre pluripotentes humanas (hPSC) o células hematopoyéticas al
eliminar la cadena accesoria beta-2-microglobulina ( B2M) (3–7) y eliminar la
expresión de HLA clase II dirigiéndose a su regulador maestro transcripcional,
CIITA (7, 8). Sin embargo, la eliminación de B2M también previene la expresión
superficial de las moléculas HLA de clase Ib no polimórficas HLA-E y HLA-G, que
son necesarias para mantener la tolerancia de las células NK (9, 10). Por lo tanto,
la deleción individual de los genes HLA-A/-B/-C puede representar una estrategia
más favorable para proteger las células del donante del CD8.+Citotoxicidad
mediada por células T sin perder la función protectora HLA clase Ib.
Anteriormente se ha demostrado que los inhibidores de puntos de control de
células T PD-L1 y CTLA-4Ig pueden proteger a las células madre del rechazo en
un modelo de ratón humanizado (11). Sin embargo, este enfoque dejó intacta la
barrera HLA, lo que puede provocar un rechazo hiperagudo de las células
injertadas precipitado por anticuerpos anti-HLA preexistentes (12, 13). Además,
CTLA-4Ig también puede alterar la homeostasis y la función de las células T
reguladoras (Treg), poniendo en peligro posiblemente el establecimiento de la
tolerancia inmunitaria operativa (14, 15).
Además de las respuestas inmunitarias adaptativas, las células inmunitarias innatas,
como las células NK y los macrófagos, desempeñan un papel importante en el rechazo
de injertos (16). Un informe reciente abordó la lisis mediada por células NK de células
deficientes en B2M mediante la expresión de una construcción de fusión B2M-HLA-E
(17). Sin embargo, esta estrategia no cubría las células NK que carecían de NKG2A, el
receptor inhibidor del HLA-E, cuya reactividad
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1902566116
todavía podría ser preocupante (18, 19). Por lo tanto, HLA-G, un ligando
inhibidor de las células NK expresado en la interfaz materno-fetal durante el
embarazo y que actúa a través de múltiples receptores inhibidores (9, 20),
podría ser un mejor candidato para superar completamente las respuestas de
las células NK. Además, los macrófagos, que contribuyen al rechazo de las
células trasplantadas, pueden controlarse mediante la expresión de CD47, una
señal de "no me comas" que evita que las células sean fagocitadas por los
macrófagos (21, 22); sin embargo, este enfoque aún no se ha explorado para
proteger las hPSC y sus derivados diferenciados de la absorción de macrófagos.
INMUNOLOGÍA Y
INFLAMACIÓN
Además, aún no se ha propuesto una estrategia convincente para atacar tanto la
inmunidad adaptativa como la innata.
Aquí, empleamos el sistema CRISPR/Cas9 para escindir selectivamente los
genes que codifican los miembros polimórficos de HLA clase Ia, HLA-A/-B/-C, y
eliminamos la expresión de HLA clase II dirigiéndonos CIITAen hPSC. Las células
"inmunopacas" deficientes en HLA resultantes se modificaron aún más para
expresar los factores inmunomoduladores PD-L1, HLA-G y CD47, que se dirigen
respectivamente. Nuestra estrategia aborda tanto las respuestas inmunes
adaptativas como las innatas y, junto con otras modificaciones genéticas, en
última instancia puede
Significado
Para permitir la terapia celular a una escala más amplia, se ha propuesto el
desarrollo de productos de células madre de donantes universales que
puedan administrarse a múltiples pacientes que lo necesiten, pero no se ha
informado de una estrategia que controle el rechazo inmunológico tanto
adaptativo como innato. En este estudio, empleamos la edición múltiple del
genoma para eliminar selectivamente las moléculas HLA altamente
polimórficas de clase Ia y clase II e introdujimos los factores
inmunorreguladores PD-L1, HLA-G y CD47 para controlar las respuestas
inmunes mediadas por células T y NK y la absorción de macrófagos. in vitro
e in vivo. Nuestra estrategia demuestra el poder de la ingeniería celular e
informa estudios futuros destinados a generar productos celulares
universales "listos para usar" que puedan hacer que la terapia celular esté
disponible para un grupo más grande de pacientes.
Contribuciones de los autores: investigación diseñada por XH, JLS, DAM, TBM y CAC; XH, MW,
SD, PJF, JH-RK, YX, AA y TBM realizaron investigaciones; XH, PH,
LMRF, DAM y TBM contribuyeron con nuevos reactivos/herramientas analíticas; XH, MW, SD,
Datos analizados por PJF, JH-RK, YX, LMRF, JLS, TBM y CAC; y XH, TBM y CAC escribieron el
artículo.
Revisores: MC, Universidad de Washington; y DHS, Centro Médico de la Universidad de Columbia.
Declaración de conflicto de intereses: CAC es fundador y director científico de Sana
Biotechnology. DAM es fundador científico y observador de la junta directiva de Semma
Therapeutics. En este estudio no se utilizó ni reactivo ni financiación de estas empresas. La
Universidad de Harvard ha presentado solicitudes de patentes que cubren estos inventos.
Publicado bajo ellicencia PNAS.
1MW y SD contribuyeron igualmente a este trabajo.
2¿Aquién puede dirigirse la correspondencia. Correo electrónico: jlstrom@fas.harvard.edu ,
tmeissner@fas.harvard.edu o ccowan@bidmc.harvard.edu .
Este artículo contiene información de respaldo en línea enwww.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.
1073/pnas.1902566116/-/DCSuplementario.
Publicado en línea el 30 de abril de 2019.
PNAS |21 de mayo de 2019 |vol. 116 | No. 21 |10441–10446
dar como resultado productos celulares universales “listos para usar” adecuados para
trasplantes a cualquier paciente.
A centrómero B C
HumanoHLAlugar
mi A h GRAMO F Telómero

Resultados Dos sgRNA en cada lado

B C
Ablación selectiva de HLA-A/-B/-C polimórficos y HLA clase II antes de Cristo eliminación de 95 kb

Expresión.Dado que los genes humanos MHC clase IHLA-A, HLA-B,y

HLA-Cson altamente homólogos, el diseño de ARN guía cortos B HumanoHLAlugar D CIITA
B C mi A h F 1 2 3 45 6
(sgRNA) específicos dirigidos a las regiones codificantes de cada gen
GRAMO

resultó un desafío. Por lo tanto, empleamos una estrategia múltiple A

de guía dual dirigida a regiones no codificantes para eliminar los tres
Un sgRNA en cada lado Un ARNg
genes del genoma de una línea hPSC (HUES8). En elHLA lugar,HLA-By A eliminación de 13 kb Se introdujeron los indeles
HLA-Cson adyacentes, mientras queHLA-ASe encuentra más cerca del
telómero. Para eliminar simultáneamenteHLA-ByHLA-C,Se diseñaron C 0,55% 0,41%
mi CE diferenciada
dos sgRNA aguas arriba deHLA-By aguas abajo deHLA-C (Figura 1A). 6
isotipo
Del mismo modo, para eliminarHLA-A,un sgRNA se diseñó aguas

HLA-DR (IMF)
4
arriba y otro sgRNA aguas abajo deHLA-A (Figura 1B).Ambas
2
eliminaciones fueron confirmadas mediante amplicones de PCR que 100,0% 99,5%

abarcan los sitios de corte de Cas9 (Apéndice SI,Figura S1A yB). La peso 0
isotipo peso KO
ablación de las proteínas HLA-A/-B/-C en el clon HLA knockout (KO)
final se verificó mediante citometría de flujo (Fig. 1).C). 0,21% 0,45% F
Para prevenir la expresión de HLA clase II, nos dirigimos a laCIITA gen, KO peso KO KI-APS KI-PC

SSC-H
CIITA
utilizando un sgRNA previamente informado (23). Un par de cebadores de
PCR que flanquean el sitio de escisión en el primer exón deCIITAse utilizó
HLA-A2 HLA-A/B/C
para amplificar la región que abarca el sitio de corte (Fig. 1D). Los
amplicones de PCR se secuenciaron mediante Sanger para identificar GRAMO SAT2A T2A P2A

cambios de marco bialélico (Apéndice SI,Figura S1CyD). Para demostrar la Construcción KI-PHC brazo de 5' EXPLOSIÓN CAGGS PD-L1 HLA-G CD47 brazo de 3'

SA T2A T2A
pérdida de la expresión de HLA clase II, diferenciamos las hPSC WT y KO en
Construcción KI-PC brazo de 5' EXPLOSIÓN CAGGS PD-L1 CD47 brazo de 3'
células endoteliales (CE). Es de destacar que las EC WT y KO diferenciadas
expresaron niveles equivalentes del marcador EC CD144 (VE-Cadherin), lo AAVS1lugar Exón 1

que indica que la eficiencia de diferenciación de las células resultantes no

se vio afectada por la edición del genoma (Apéndice SI,Figura S1mi). Es h isotipo peso KI-APS
I j peso KI-PC
importante destacar que la inducción de la expresión de HLA-DR tras la isotipo
estimulación con IFNγ se eliminó en las CE KO (Fig. 1).MI).

% del máximo
1peso
PD-L1

Integración dirigida de factores inmunomoduladores en elAAVS1
Lugar de puerto seguro.Nuestra hipótesis es que la ablación de las moléculas
polimórficas HLA de clase Ia y clase II eliminaría el rechazo inmunitario
adaptativo mediado por células T. Sin embargo, las células con deficiencia de
HLA probablemente aún serían susceptibles a las células inmunes innatas
involucradas en una alorrespuesta, como las células NK y los macrófagos, lo que
nos llevó a introducir factores inmunomoduladores por las siguientes razones: (
i)mientras dejamos lo no polimórficoHLA-E Si el gen está intacto, la expresión
superficial del HLA-E probablemente se verá gravemente afectada por la
PD-L1
1,55KI-APS
HLA-G CD47 CD47
Figura 1.La edición del genoma elimina la expresión polimórfica de HLA-A/-B/-C y HLA clase II y
permite la expresión de factores inmunomoduladores deAAVS1 lugar de puerto seguro. (A)
Representación esquemática de la estrategia de eliminación de HLA-B y HLA-C CRISPR/Cas9.
Cada par de tijeras representa dos sgRNA. Las flechas moradas, rojas y verdes indican los
cebadores utilizados para la detección por PCR. (B)Representación esquemática de la estrategia
de eliminación de HLA-A. Las flechas amarillas muestran los cebadores utilizados para la
detección por PCR. (C)Gráficos FACS que demuestran una ablación exitosa de HLA-A/B/C en

eliminación de los genes polimórficos del HLA de clase Ia (24). Por lo tanto, la
falta de expresión de cualquier HLA clase I puede hacer que las células del
donante sean vulnerables a la lisis mediada por células NK. Para proteger
nuestras células diseñadas de las células NK, buscamos introducir HLA-G en las
células HLA knockout. (ii)Para controlar la fagocitación de macrófagos, nuestro
objetivo fue sobreexpresar CD47. (iii)HLA-G puede presentar péptidos clásicos
derivados de proteínas intracelulares a las células T (25), lo que potencialmente
podría volver a exponer nuestras células modificadas al CD8.+Vigilancia inmune
de células T. Además, las células γδT pueden reconocer directamente antígenos
e iniciar una respuesta citotóxica incluso en un fondo HLAnull (26). Para
contrarrestar cualquier actividad residual de las células T, decidimos activar PD-
L1, suprimiendo directamente las respuestas de las células T (27). Además, la
expresión de PD-L1 también puede contribuir a proteger las células
trasplantadas del rechazo inmunológico innato al inhibir PD-1.+Células NK (28,
29) y PD-1+macrófagos (30).
Para evitar la integración aleatoria y los efectos posicionales en la
expresión transgénica, buscamos incluir los factores
inmunomoduladores en elAAVS1lugar de puerto seguro (31).
Diseñamos dos plásmidos donantes, uno que contiene un PD-L1;
HLA-G; casete de expresión CD47 y otro que contiene un PD-L1;
Casete de expresión CD47, ambos impulsados por un promotor
CAGGS (Fig. 1GRAMO).Los plásmidos donantes se electroporaron
junto con un sgRNA dirigido alAAVS1locus en el HLA-A−/−HLA-B−/−HLA-
C−/−CIITAindel/indelClon KO. Integración dentro del AAVS1el locus fue
verificado por PCR (Apéndice SI,Figura S1F). Se aislaron dos clones
siguiendo el flujo de trabajo enApéndice SI,Figura S1GRAMOy
analizado por citometría de flujo; uno llamado KI-PHC que expresaba
PD-L1, HLA-G, pero no sobreexpresaba significativamente
HUES8. Las hPSC WT o KO se trataron con IFNγ durante 48 h antes de teñirlas con los
anticuerpos indicados. (D)Estrategia de focalización deCIITAlugar. Las flechas azules indican los
cebadores utilizados para la PCR y la secuenciación de Sanger. (MI)Intensidad de fluorescencia
media (MFI) HLA-DR en CD144 diferenciado+CE WT y KO. (F) Esquema que describe los
genotipos de las líneas celulares WT, KO, KI-PHC y KI-PC. (GRAMO) Estrategia de activación de
moléculas inmunomoduladoras. Las tijeras representan el sgRNA dirigido alAAVS1lugar. Las
flechas negras y grises indican los cebadores utilizados para la detección por PCR. (h)Expresión
de PD-L1 y HLA-G en hPSC KI-PHC. (I)Expresión de CD47 en células KI-PHC. Las MFI relativas a
las células WT se indican a la derecha de los histogramas. (j)Expresión de PD-L1 y CD47 en hPSC
KI-PC.
CD47, en comparación con las células WT (Fig. 1hyI),y un segundo
llamado KI-PC que expresaba PD-L1 y mostraba un nivel elevado
de CD47 (Fig. 1).jyApéndice SI,Figura S2A). La pérdida de
expresión de HLA clase Ia y clase II se confirmó tanto en KI hPSC
como en EC (Apéndice SI,Figura S2B-D). Por lo tanto, insertamos
con éxito factores inmunomoduladores en elAAVS1locus de
refugio seguro de células HLA nulas. En total, generamos tres
líneas de hPSC diseñadas: KO, KI-PHC y KI-PC (Fig. 1F).
A continuación, buscamos confirmar la expresión del transgén en
derivados de las líneas de hPSC diseñadas. Para este propósito,
diferenciamos las hPSC diseñadas en células de músculo liso vascular
(VSMC). Las VSMC WT, KO, KI-PHC y KI-PC expresaron niveles equivalentes
del marcador VSMC CD140b (PDGFRB), lo que confirma eficiencias de
diferenciación similares (Apéndice SI,Figura S2mi). En las VSMC de KI-PHC,
observamos una subpoblación con una expresión modestamente mayor
de PD-L1 y HLA-G, en comparación con

10442 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1902566116 Han et al.

WT VSMC y una población importante que muestra niveles
significativamente elevados de PD-L1 y HLA-G (Apéndice SI,Figura S2F). Sin
embargo, no observamos un aumento de la expresión de CD47 en las
VSMC de KI-PHC (Apéndice SI,Figura S2F), lo que podría ser el resultado de
una expresión incompleta de nuestro casete de direccionamiento, donde
los tres productos genéticos están unidos por un péptido 2A (Fig. 1).
GRAMO).Se observaron patrones de expresión similares de los transgenes
en las VSMC KI-PC (Apéndice SI,Figura S2F).
Para evaluar si el tráfico de superficie de HLA-E se vio afectado en el fondo de
HLA KO, estimulamos las VSMC con IFNγ y teñimos las células con un anticuerpo
específico de HLA-E. Mientras que las VSMC WT aumentaron drásticamente la
expresión de HLA-E, sus niveles en la superficie celular se redujeron
considerablemente en las VSMC KO (Apéndice SI,Figura S2GRAMO), que no se
debió a una alteración de la expresión del gen HLA-E (Apéndice SI,Figura S2h).
Sorprendentemente, los niveles de superficie de HLA-E no se restauraron
mediante la expresión de HLA-G en las VSMC de KI-PHC (Apéndice SI,Figura S2
GRAMO), lo que no concuerda con un informe anterior de que el péptido líder
HLA-G es suficiente para promover el tráfico superficial de HLA-E (32). Sin
embargo, el tráfico de superficie de HLA-G no se vio afectado en las VSMC de KI-
PHC (Apéndice SI,Figura S2F), lo que proporciona un incentivo adicional para
introducir este factor tolerogénico en nuestros productos celulares diseñados
para compensar la reducción de la expresión superficial de HLA-E en un fondo
nulo de HLA-A/-B/-C.
Las líneas de células madre pluripotentes humanas modificadas conservan la pluripotencia y
Potencial de diferenciación.Para confirmar que nuestras líneas de hPSC
diseñadas conservaban la pluripotencia, se evaluó la expresión de
NANOG, OCT4, SSEA3, SSEA4 y TRA-1–60 mediante
inmunofluorescencia en hPSC KO, KI-PHC y KI-PC y se encontró que
era equivalente a eso. de hPSC no modificadas (Fig. 2A).Además, las
hPSC KO, KI-PHC y KI-PC se diferenciaron en las tres capas
germinales. Se llevó a cabo qRT-PCR para examinar la expresión de
marcadores de ectodermo, mesodermo y endodermo y se comparó
con las tres capas germinales derivadas de hPSC no modificadas. Se
encontró que todos los marcadores de linaje analizados se
expresaban en niveles similares en derivados de WT, así como en las
tres líneas celulares diseñadas (Fig. 2).B).Además, las hPSC KO, KI-PHC
y KI-PC mostraron un cariotipo normal (Fig. 2C).
Para analizar los posibles efectos fuera del objetivo de los sgRNA utilizados
para diseñar nuestras líneas de hPSC, amplificamos por PCR 21 sitios exónicos
fuera de objetivo predichos in silico de primer nivel de las líneas de hPSC
diseñadas, así como de las hPSC WT parentales. La secuenciación de Sanger de
los productos de PCR no reveló ninguna edición no deseada en estos sitios,
excepto el pseudogén.HLA-H (HFE),que mostró una coincidencia perfecta con el
sgRNA aguas arriba deHLA-A (Apéndice SI, Higos. S3 y S4). De manera más
amplia, realizamos una secuenciación de captura objetivo para los 648 sitios
fuera del objetivo previstos para los ocho sgRNA utilizados en este estudio.
Como resultado, además de los 12 sitios polimórficos/SNP identificados de
forma natural, confirmamosHLA-H (HFE)como un sitio fuera de objetivo en las
tres líneas celulares. Además, detectamos un sitio intrónico fuera del objetivo en
TRAF3en las tres líneas celulares resultantes de la focalizaciónHLA-C,así como un
sitio intrónico fuera de destino enCPNE5en la línea celular KI-PC como resultado
de laAAVS1 ARNg (Apéndice SI,Higos. S5 y S6yConjunto de datos S1). En total,
aunque se detectaron tres eventos fuera del objetivo, nuestras líneas de hPSC
diseñadas conservaron la pluripotencia y su capacidad para diferenciarse en
células de las tres capas germinales, así como en VSMC y EC con eficiencias de
diferenciación similares a sus contrapartes WT.
Respuestas reducidas de las células T contra las líneas celulares KO y KI.Para invertir-
Para determinar si la eliminación de las moléculas polimórficas de HLA es
suficiente para prevenir las respuestas inmunes mediadas por células T, o
puede ser suprimida aún más por PD-L1, cocultivamos células WT, KO o KI-
PHC con células T alogénicas de donantes sanos. Se realizaron tres
inmunoensayos de células T in vitro: ensayos de proliferación, activación y
destrucción de células T. Dado que la expresión de HLA clase I es modesta
en las hPSC (33, 34), diferenciamos nuestras hPSC diseñadas y WT en EC,
que expresan tanto HLA de clase I como II después de la estimulación con
IFNγ, o en VSMC, que expresan solo HLA de clase I. antes de utilizarlos en
los respectivos inmunoensayos.
Han et al.
A B
peso KO
10000 peso
expresión relativa
KO
nanog 1000
KI-APS
KI-PC
100
OCT4
10
SSEA3 1
MAP2
PAX6
FLK1
AFP
SOX17
SSEA4
braquiuria
ectodermo
endodermo
TRA-1-60
mesodermo
C KO KI-APS KI-PC
Figura 2.Las líneas celulares KO y KI conservan pluripotencia y potencial de diferenciación.
(A)Inmunofluorescencia que indica que los marcadores de pluripotencia fueron
expresados por hPSC WT, KO, KI-PHC y KI-PC. (Barras de escala, 200 μm.) (B)Se llevó a
cabo qRT-PCR para estudiar los marcadores de trilinaje después de que las hPSC WT,
KO, KI-PHC y KI-PC se diferenciaran en las tres capas germinales indicadas. La
INMUNOLOGÍA Y
INFLAMACIÓN
cuantificación relativa se normalizó para cada nivel genético en hPSC indiferenciadas.
(C)Las bandas G de cromosomas en líneas celulares KO, KI-PHC y KI-PC demostraron
cariotipos normales después de sucesivas rondas de ingeniería genómica.
Para los ensayos de proliferación de células T, las CE WT, KO y KI-PHC se
trataron previamente con IFNγ y posteriormente se cocultivaron con CD3
alogénico marcado con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE).
+Células T durante 5 d. Luego se analizaron las células T para determinar la
dilución de la señal CFSE mediante citometría de flujo como lectura de la
proliferación de células T en el sistema CD3/4/8.+Subpoblaciones de células
T (Apéndice SI, Figura S7A). Los gráficos FACS de un donante de células T
representativo se muestran enApéndice SI,Figura S7B. Como se predijo, el
porcentaje de células T proliferantes totales (CD3+) se redujo cuando se
incubó con EC KO (4,17 %) o EC KI-PHC (3,87 %) en comparación con EC WT
(8,29 %) (Fig. 3Una izquíerda).CD4+Las células T siguieron un patrón similar
(Fig. 3Un medio).Además, CD8+Las células T citotóxicas mostraron una
proliferación significativamente reducida cuando se cocultivaron con EC
KO (7,71%) o EC KI-PHC (5,95%), en comparación con EC WT (14,32%) (Fig.
3).A, Derecha).Es importante destacar que, en comparación con los
cocultivos con KO EC, CD8+Las células T proliferaron significativamente
menos en presencia de KI-PHC EC (Fig. 3A, derecha),indicando que CD8+La
activación de las células T se suprimió aún más mediante la
sobreexpresión de PD-L1 en un fondo HLA nulo. Para investigar más a
fondo el papel supresor de PD-L1 durante las respuestas de diferentes
subpoblaciones de células T, transdujimos hPSC con una construcción PD-
L1 inducible y las diferenciamos en EC antes de realizar un ensayo de
proliferación de células T. Encontramos que sólo CD8+, no CD4+, la
proliferación de células T se redujo en presencia de EC que expresan PD-
L1, en comparación con las EC WT, lo que aboga por un efecto inhibidor
específico de PD-L1 en el CD8+Subconjunto de células T (Apéndice SI,Figura
S7CyD).
Utilizando el mismo cocultivo de células T con CE como células diana,
examinamos la expresión del marcador de activación temprana de células
T CD69 en un cocultivo de 3 días y de CD154 (CD40L) en un cocultivo de 5
días (Fig. 3).B).Encontramos porcentajes reducidos de CD69.+y CD154+
células T (CD3+) en cocultivos con EC KI-PHC (2,27 y 0,4143%,
respectivamente) o EC KO (2,303 y 0,65%, respectivamente), en
comparación con células T coincubadas con EC WT (7,7 y 7,123%,
respectivamente) (Fig. 3B).Las mismas tendencias se observaron en el CD4
+y el cd8+Poblaciones de células T (Fig.3B).Sin embargo, no observamos
una expresión significativamente reducida de los marcadores de activación
en las células T contra las EC KI-PHC en comparación con las EC KO.
Para cuantificar la destrucción de células T, medimos la lactato deshidrogenasa
(LDH) liberada por las VSMC como sustituto de la citotoxicidad de las células T. En esta
configuración, sólo el CD8+Se esperaba que las células T se activaran
PNAS |21 de mayo de 2019 |vol. 116 | No. 21 |10443
A CD3+ CD4+
*
CD8+ aumento de volumen en comparación con los teratomas KO 7 días después de la
inyección de CD8+Células T, que no se debió a una tasa de crecimiento más lenta
% de proliferación de células T

100 **** 100 100 *

* ** del propio teratoma WT (Fig. 4ByC).Estos resultados sugieren que los teratomas
50 50 50
35 35 ** 35 KO estaban protegidos contra el rechazo mediado por células T. Además,
30 * pagp=0,1.8118212
30 30
25 25 *
* p=0.0
2.924924 25 aunque no fue significativo, los volúmenes promedio de los teratomas KI-PHC y
20 20 20
15 15 15 KI-PC también fueron mayores que los de los teratomas WT 7 días después de la
10 10 10
5 5 5 infusión de células T (Fig. 4).B).Además, los teratomas derivados de las líneas
0 0 0
celulares KO y KI mostraron una infiltración reducida de células T, como lo
demuestra la qPCR para los marcadores de células T efectoras humanas CD8 e
IL-2 (Fig. 4).D),así como por histología (Fig. 4MI).En conjunto, estas
B CD3+ CD4+ CD8+ observaciones sugieren que la eliminación de las moléculas polimórficas de HLA
***
*
de la superficie celular de las células trasplantadas puede bloquear eficazmente
**
100
22
100
*
80 el rechazo mediado por células T in vivo, lo que coincide con nuestras
** pagp=0,9.5922
5
* 63
pagp=0,4.54635
25 25 20
10 10 * p=0.0
5.3
254234 20 observaciones in vitro.
%CD69+

8 8 15
6 6
10
4 4 Las líneas celulares KI evaden las respuestas de macrófagos y células NK.Debido a la
2 2 5
Debido a la falta de moléculas HLA de clase Ia y a la alteración de la expresión en
0 0 0
la superficie de HLA-E, esperábamos que las hPSC HLA KO y sus derivados
fueran vulnerables a la lisis mediada por células NK, pero no la línea celular KI-
* **
PHC como resultado de la expresión de HLA-G. . Para probar nuestra hipótesis,
*
100 100 ** 100 coincubamos células NK alogénicas de donantes sanos con VSMC WT, KO o KI-
* p=0.0
3.8
031081
* p=0.0
3.1
337317
25 25 25
10 10 * p=0.0
4.8467867
20 PHC. CD56+Las células NK se analizaron mediante citometría de flujo para
%CD154+

8 8 15 determinar la expresión superficial del marcador de degranulación CD107a

6 6
4 4
10
2 2
0 0
C **
* ** *
80
% de citotoxicidad de células T
como lectura de la activación de las células NK (Apéndice SI,Figura S8B). Es de
5
destacar que la desgranulación de las células NK en presencia de VSMC KO
0
(13,51%) no fue significativamente mayor que en los cocultivos con VSMC WT
(10,16%) (Fig. 5).A),lo que sugiere la falta de una señal de activación de células
NK en las VSMC derivadas de hPSC. De acuerdo con nuestra hipótesis,
encontramos que el porcentaje de CD107a+Las células NK en cocultivos con
VSMC KI-PHC (5,43%) fueron significativamente más bajas que en los cocultivos
de VSMC KO (13,51%) (Fig. 5A),lo que sugiere que la actividad de las células NK

60 de hecho está inhibida por la expresión de HLA-G en las VSMC KI-PHC. Los
40 gráficos FACS de un donante representativo se muestran enApéndice SI,Figura
20 S8C. También examinamos la LDH liberada de VSMC apoptóticas después de la
0 coincubación con células NK para cuantificar la citotoxicidad de las células NK.
WT KO KI-PHC
De acuerdo con la desgranulación de las células NK, observamos que la
Fig. 3. Reducción de las actividades de las células T contra líneas celulares KO y KI-PHC in vitro. (A)
citotoxicidad de las células NK se redujo cuando las células NK se incubaron con
Diagramas de dispersión que muestran el porcentaje de células T proliferantes en CD3+( KI-PHC VMSC (Fig. 5).B).
Izquierda, n =8 donantes), CD4+(Medio, n =6 donantes), y CD8+Célula T (Derecha, n =6 Finalmente, examinamos la actividad de los macrófagos utilizando un
donantes) cuando se cocultivan con CE WT, KO o KI. Se utilizaron células T cultivadas solas tinte fluorescente sensible al pH (pHrodo-Red) que emite una señal tras la
como controles negativos; Las células T activadas con perlas CD3/CD28 sirvieron como absorción fagocítica. Nuestra hipótesis es que la sobreexpresión de CD47
controles positivos. ANOVA unidireccional emparejado seguido de la prueba de comparación en las VSMC de KI-PC reduciría la fagocitación de macrófagos. Como
múltiple de Tukey. Los datos son malos.±SEM; *PAG <0,05; **PAG <0,01. (B)Diagrama de control positivo, se utilizó un knockout de CD47 (CD47−/−) se generó una
dispersión que muestra el porcentaje de CD69+(Superior, n =3 donantes) y CD154+células línea celular y se verificó la pérdida de expresión de CD47 en la superficie
(Inferior, n =4 donantes) en CD3+(Izquierda),CD4+(Medio),y CD8+Célula T (Bien) poblaciones celular mediante citometría de flujo (Apéndice SI,Figura S8D). VSMC
después de un cocultivo con WT, KO o KI EC. Se utilizaron los mismos controles negativos y marcadas con pHrodo-Red diferenciadas de WT, CD47−/−, y las células KI-
positivos que enA.ANOVA unidireccional emparejado seguido de la prueba de comparación PC se trataron con estaurosporina (STS) para inducir la apoptosis o se
múltiple de Tukey. Los datos son malos.±SEM; *PAG <0,05; **PAG < 0,01. (C)Gráfico de barras
dejaron sin tratar y luego se incubaron con macrófagos derivados de
que representa el porcentaje de citotoxicidad de las células T frente a las CE WT, KO y KI (norte
monocitos de donantes sanos. La aparición de una señal roja, un indicador
=6 donantes). ANOVA unidireccional emparejado seguido de la prueba de comparación
de la fagocitación de las VSMC por los macrófagos, se controló mediante
múltiple de Tukey. Los datos son malos.±SEM; *PAG <0,05; **PAG <0,01.
imágenes de células vivas y se cuantificó la intensidad de la fluorescencia.
Es de destacar que, con o sin tratamiento STS, las VSMC KI-PC mostraron
una absorción significativamente menor por los macrófagos en
por la participación de HLA clase I-TCR (receptor de células T), dado que las
comparación con CD47.−/−o VSMC WT (Fig. 5CyD yApéndice SI,Figura S8mi).
VSMC expresan únicamente HLA clase I. Encontramos que el CD8+La
Estos datos demuestran que la sobreexpresión de CD47 puede minimizar
citotoxicidad de las células T contra las VSMC KI-PHC (15,31%) fue la más
la fagocitación de macrófagos de VSMC derivadas de hPSC diseñadas.
baja en comparación con las VSMC KO (18,86%) y WT (37,65%) (Fig. 3).C).
Esta observación sugiere que el CD8+La citotoxicidad de las células T se
suprimió aún más mediante la expresión de PD-L1 en VSMC KI-PHC, de Discusión
acuerdo con los resultados del CD8+Ensayo de proliferación de células T.
En este estudio, aplicamos la edición múltiple del genoma CRISPR/Cas9 para
hacer que las hPSC sean hipoinmunógenas para las respuestas inmunes tanto
Para evaluar las respuestas de las células T in vivo, WT y las hPSC diseñadas se
adaptativas como innatas. Eliminamos específicamente los genes HLA-A/-B/-C
trasplantaron sc en ratones inmunodeficientes y se les permitió formar teratomas en el
altamente polimórficos y previnimos la expresión de genes HLA clase II al
transcurso de 4 a 6 semanas. CD8 alogénico presensibilizado+Luego, las células T se apuntarCIITA.Además, introdujimos los factores inmunomoduladores PD-L1,
transfirieron adoptivamente mediante inyección en la vena de la cola y se monitoreó el HLA-G y CD47 en elAAVS1 lugar de puerto seguro. Descubrimos que los
crecimiento del teratoma durante 8 días adicionales (Fig. 4).A). Medido por la expresión derivados de hPSC diseñados provocaban una activación y destrucción inmune
de CD69 y PD-1 de CD8+Las células T antes y después del cebado, las células T utilizadas significativamente menor por parte de las células T y las células NK y mostraban
para la inyección se activaron (CD69+) sin signos de agotamiento (PD-1+) tras la una absorción mínima por parte de los macrófagos.
sensibilización (Apéndice SI,Figura S8A). De acuerdo con la hipótesis de que sólo las Durante el proceso de modificación genética se generó una deleción de
células WT serán rechazadas, los teratomas WT mostraron una tasa de crecimiento 95 kb que, además de los genes HLA-B/-C, también alberga MIR6891 y
más lenta. cuatro pseudogenes. Además, un exónico fuera del objetivo

10444 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1902566116 Han et al.

 A CD8 alogénico-células
Imprimado
teratoma
formación
Si bien el rechazo agudo del injerto está mediado principalmente por células
T, también se debe considerar el papel de otras células inmunes como los
Presensibilización CD8-células
macrófagos, las células NK y las células B con respecto a la supervivencia a largo
plazo de las células terapéuticas. Nuestros ensayos de células NK sugieren que
ESC
la expresión de HLA-G fue capaz de controlar las actividades de las células NK,
Peso adjunto
células del cuerpo embrioide Tasa de crecimiento del teratoma aunque no se puede descartar la contribución de PD-L1 en nuestra
Infiltración de células T
configuración experimental sin el uso de un anticuerpo bloqueador de HLA-G en

B *
*
C d0/d-2
este ensayo. De manera similar, la sobreexpresión de CD47 en combinación con
PD-L1 redujo efectivamente la fagocitación de macrófagos. Con respecto al
300 peso 300
250 KO injerto a largo plazo, en particular, en el futuro se debe considerar la

volumen del teratoma

volumen del teratoma

KI-APS 200
200 citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos por parte de las células NK y la

% Aumentó
% Aumentó

150 KI-PC
100 activación del complemento mediada por aloanticuerpos como los principales
100
0 impulsores del rechazo crónico del injerto (35-37). Si bien existen varios modelos
50
0 de ratones humanizados para evaluar la inmunogenicidad de las células
- 100
- 50 trasplantadas, están limitados a la hora de recapitular una respuesta inmune
d5/d0 d7/d0
completa. Por lo tanto, es imperativo el desarrollo de modelos in vivo mejorados
D *
mi peso KO
para probar el trasplante y el rechazo de células (38–41).
* *
Finalmente, superar la barrera inmune al trasplante también proporcionaría
*
0.006 ** 0.00010
* una nueva e interesante modalidad para tratar enfermedades autoinmunes.
expresión de ARNm
expresión de ARNm

0.00008
hCD8 relativa

IL-2 relativa

0.004 KI-APS KI-PC

0.00006
0.00004
0.002
0.00002 A B
pag= 88
p=0,14455 peso
0.000 0.00000 90 50 *

% degranulación de células NK
60 KO

% de citotoxicidad de células NK

INMUNOLOGÍA Y
30 ** 40 KI-APS

INFLAMACIÓN
pagpag==00..172211

30
30
20 ***
Figura 4.Respuestas reducidas de las células T contra líneas celulares KO y KI in vivo. (A) 20
*
Esquema que describe la presensibilización del CD8 alogénico.+Ensayo de respuesta de 10 10
recuperación de células T y células T in vivo. (B)Porcentaje de aumento del volumen del
0 0
teratoma el día 5 o 7 después de la inyección de células T en comparación con el día 0. 10:1 3:1 1:3
relación E/T
Genotipo de teratoma: WT (norte =9), KO (norte =7), KI-APS (norte =6), y KI-PC (norte =7).
ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los
datos son malos.±SEM; *PAG <0,05. (C)Porcentaje de aumento del volumen del teratoma el día
C Sin tratar STS tratado
0 de la inyección de células T en comparación con la preinyección de 2 días. Genotipo de 2.0x108 8x107 peso
Intensidad total integrada

CD47−/−
teratoma: WT (norte =9), KO (norte =7), KI-APS (norte =6), y KI-PC (norte =7). (D)hCD8 relativa KI-PC
1.5x108 6x107
(Izquierda)e IL-2 (Bien)Expresión de ARNm en WT (norte =8), KO (norte =7), KI-APS (norte = Mac. solo
Solo VSMC etiquetado
6), y KI-PC (norte =7) teratomas recolectados el día 8 después de la inyección de células T. La 1.0x108 4x107

expresión se normalizó a RPLP0. ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba de

5.0x107 2x107
comparación múltiple de Tukey. Los datos son malos.±SEM; *PAG <0,05; **PAG < 0,01. (MI)
Tinción representativa de hematoxilina y eosina de teratomas WT, KO, KI-PHC y KI-PC 0.0 0
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
recolectados el día 8 después de la inyección de células T. Las flechas negras indican los sitios Tiempo (horas) Tiempo (horas)
de infiltración de células T. (Barras de escala, 100 μm.)
D Sin tratar STS tratado

** *
El evento se observó en el pseudogen transcrito.HLA-H,sin embargo, estas 2.5x108 * 3x108 *
Intensidad total integrada

alteraciones genómicas no afectaron la tasa de crecimiento ni la eficiencia 2.0x108

2x108
de diferenciación de las líneas celulares KO y KI. 1.5x108

Como se esperaba, la eliminación de la expresión de HLA polimórfico en hPSC 1.0x108

1x108
y sus derivados, EC y VSMC, dio como resultado respuestas reducidas de células 5.0x107
T in vitro e in vivo (Figs. 3 y 4). Una observación interesante de nuestros ensayos 0
0.0
de células T es que la sobreexpresión del inhibidor del punto de control PD-L1
tuvo un impacto significativo sólo en la proliferación y citotoxicidad de CD8.+
Células T (Fig.3A).Esto puede tener varias explicaciones posibles: (i)los niveles del
Figura 5. Las líneas celulares KI están protegidas de las respuestas de las células NK y los macrófagos. (A)
receptor PD-L1, PD-1, son más altos en CD8+células T que en CD4+células T y (ii)
Diagrama de dispersión del porcentaje de CD56+CD107a+células como lectura de la desgranulación de
CD8+Las células T son el tipo de célula que mejor responde a la exposición de las las células NK contra las VSMC WT, KO o KI-PHC (norte =7 donantes). Se utilizaron células NK cultivadas
células diana en nuestros ensayos y, por lo tanto, también expresarán niveles solas como control negativo; Las células NK tratadas con PMA/ionomicina sirvieron como control
más altos del regulador negativo PD-1. Además, observamos que este efecto positivo. ANOVA unidireccional emparejado seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los
inhibidor de PD-L1 sobre CD8+La proliferación de células T se produjo incluso en datos son malos.±SEM; **PAG <0,01. (B)Gráfico de barras que representa el porcentaje de citotoxicidad
ausencia de HLA (Fig. 3A),lo que sugiere que no se requiere la interacción HLA- de NK frente a VSMC WT, KO y KI-PHC de un donante representativo en las proporciones indicadas de
TCR para que PD-L1 actúe como un factor tolerogénico. Curiosamente, en los efector/objetivo (E/T) (norte =3 réplicas). ANOVA unidireccional no apareado seguido de la prueba de

tres inmunoensayos de células T in vitro, todavía observamos actividad de comparación múltiple de Tukey. Los datos son malos.±DAKOTA DEL SUR; *PAG <0,05; ***PAG <0,001. (C)

células T residual incluso en cocultivos con la línea celular KI-PHC, en Gráficos de lapso de tiempo del ensayo de fagocitosis de macrófagos (norte =5 donantes de monocitos).
VSMC marcadas con pHrodor rojo de los genotipos indicados que fueron pretratadas (Bien)o no
comparación con el control negativo (Fig. 3) y, por lo tanto, las respuestas de las
pretratado (Izquierda)con STS se coincubaron con macrófagos derivados de monocitos durante 6 h. Las
células T a estas células parecieron atenuadas. pero no eliminado. Lo más
imágenes se adquirieron cada 20 minutos utilizando un sistema de imágenes de células vivas.
probable es que esto se deba a la configuración experimental, considerando que
Intensidad de fluorescencia total integrada de pHrodo-red+Se analizaron los fagosomas por imagen. Los
las células diana pueden secretar factores que promueven la activación de las
datos son malos.±SEM. (D)Diagramas de dispersión del ensayo de fagocitosis de macrófagos a las 4 h de
células T independientemente de la presencia de HLA. Alternativamente, la coincubación (norte =9 donantes de monocitos, tres experimentos independientes). Las condiciones
actividad residual de las células T puede ser el resultado de modificaciones en experimentales fueron las mismas que enC.ANOVA unidireccional emparejado seguido de la prueba de
nuestras líneas celulares, que pueden haber introducido antígenos adicionales comparación múltiple de Tukey. Los datos son malos.±SEM;
reconocibles por el sistema inmunológico.
*P<0,05; **PAG <0,01.

Han et al. PNAS |21 de mayo de 2019 |vol. 116 | No. 21 |10445
enfermedades como la diabetes tipo 1 y la esclerosis múltiple, donde un tipo de
célula particular es atacado por el sistema inmunológico del paciente y necesita
reemplazo. Por lo tanto, la generación de células que pueden trasplantarse de
forma segura a cualquier persona, sin rechazo inmunológico, promete
desbloquear todo el potencial de la medicina regenerativa.
Materiales y métodos
Los materiales y métodos detallados se describen enApéndice SI, materiales y métodos
complementarios.
El uso de células madre pluripotentes humanas fue aprobado por el Comité de Supervisión
de la Investigación de Células Madre Embrionarias (ESCRO) de la Universidad de Harvard.
Todas las muestras de sangre humana utilizadas para este estudio fueron material clínico
descartado y anonimizado. El Comité sobre el Uso de Sujetos Humanos [la junta de revisión
institucional de Harvard (IRB)] determinó que este uso está exento de los requisitos de la
revisión del IRB. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las
regulaciones del Comité Internacional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de
Harvard.
Cultivo de células ES humanas y diferenciación de CE y VSMC.Se cultivaron células
HUES8 (42) en placas recubiertas con Geltrex (Life Technologies) en mTeSR1 (StemCell
Technologies). Las células se pasaron con reactivo de disociación celular suave
(StemCell Technologies) y se volvieron a sembrar en medios suplementados con
RevitaCell (ThermoFisher Scientific). Las CE y las VSMC humanas se diferenciaron
siguiendo nuestros protocolos publicados anteriormente (43).
Ensayos de células T.Para evaluar la proliferación de células T, CD3+Las células T se marcaron con
CellTrace CFSE (ThermoFisher Scientific). Las CE se trataron previamente con IFNγ antes de la
coincubación con células T marcadas con CFSE durante 5 días en medios suplementados con
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10446 |www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1902566116
20 U/mL de IL-2. Luego, las células T se tiñeron con anticuerpos anti-CD3/4/8 antes de analizar
la intensidad de CFSE en un LSR II. Los marcadores de activación de células T CD69 y CD154 se
analizaron 3 y 5 días después del cocultivo, respectivamente. La destrucción de células T se
evaluó después de un cocultivo de 5 días con VSMC en la relación efector/objetivo indicada. Los
sobrenadantes se analizaron mediante el kit de ensayo de citotoxicidad Pierce LDH
(ThermoFisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ensayos de células NK.La desgranulación de las células NK se determinó como se describe en la
ref. 44. Las células NK se tiñeron con α-CD56 PE (Biolegend) y la expresión de la superficie de
CD107a se analizó en un FACSCalibur. La actividad de destrucción de NK se determinó
utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad Pierce LDH (ThermoFisher Scientific) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Ensayo de fagocitosis de macrófagos.Las VSMC se trataron previamente con estaurosporina
200 nM (Sigma) o se dejaron sin tratar y posteriormente se disociaron y marcaron con pHrodo-
Red (IncuCyte). Se agregaron VSMC marcadas a macrófagos derivados de monocitos humanos
y se tomaron imágenes de los cocultivos utilizando la plataforma de imágenes de células vivas
Celldiscover 7 (Zeiss). Intensidad total integrada (intensidad media de fluorescencia×área total)
se analizó utilizando el software de imágenes ZEN (Zeiss).
Análisis estadístico.Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism7 (Graphpad).
EXPRESIONES DE GRATITUD.Agradecemos al Dr. Bin Gui (Brigham and Women's Hospital) por
su ayuda con el análisis fuera de objetivo basado en secuenciación de próxima generación y a
Caroline Becker (núcleo de iPSC, Harvard Stem Cell Institute) por sus consejos sobre ensayos
de pluripotencia. Este trabajo fue apoyado por premios del Instituto de Células Madre de
Harvard y el Programa Acelerador Biomédico Blavatnik, así como de la Fundación de
Investigación de Diabetes Juvenil.
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