TÉCNICAS Y PRUEBAS DE INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO:

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN:
 Fundamento: basada en una fase estacionaria (columna) y una fase móvil
(gel), que permite la separación de proteínas en función de su tamaño y su
peso molecular, donde las proteínas pequeñas quedan retenidas, las
fraccionables entran parcialmente y las más grandes pasan rápidamente.
 Procedimiento:
o Columna: con ayuda de una sustancia llamada matriz que puede ser de tipo
agarosa, poliacrilamida o dextrano (material poroso) permite el paso y
separación de moléculas dependiendo de su tamaño.
o Equilibrar y lavar la columna: mediante la adición de un buffer al inicio
o Tubos colectores: se colocan inferior a la columna
o Aplicar la muestra: adicionar la mezcla de proteínas que se quiere separar
en el medio líquido (aplicarla a la columna)
o Eluir la muestra: Se vuelve a adicionar el buffer con la finalidad de no alterar
y mantener la composición isoeléctrica, que ayuda a transportar los solutos.
o Esperar un tiempo mientras se separan las proteínas.
o Detectar y cuantificar proteínas por cromatograma, y observar el resultado.
 Resultados: representación gráfica (la curva de distribución se obtiene de
representar la cantidad de polímero en el eje Y y el peso molar en el X) de la
separación de las proteínas en cuanto a su tamaño y peso, en donde el primer
pico corresponde a las proteínas más grandes (exclusión total), mientras que a
lo largo de la gráfica nos representa las distintas proteínas. Una vez obtenido
esto, lo podemos comparar con un patrón para clasificar.
 Aplicaciones clínicas:
o Estudio de muestras biológicas (sangre, orina, LCR, etc..)
o Control de calidad en cuanto a pureza
o Determinación del contenido del principio activo de un medicamento
o Pruebas de Doping a deportistas
o Determinación de la masa molecular de las proteínas
o Distinción de anticuerpos más y menos eficaces
 Ventajas:
o Alta sensibilidad dada por las Bandas estrechas.
o Especialización en la separación de moléculas eluyendo por tamaño y peso
o No hay pérdida de muestra debido a que no interactúan física ni
químicamente.
o Permiten estimación rápida y fácil de la prueba.
 Desventajas:
o Baja especificidad (minuciosofallos), dado que únicamente retiene a las
moléculas en función de su tamaño, mas no en un análisis cualitativo.
o Uso limitado de bandas debido a la corta escala de tiempo.
 o Requiere de una diferencia de mínimo del 10% en la masa de los analitos
para obtener buena resolución (una muestra a la vez).
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA-PCR
 Fundamento: replicación y amplificación de un segmento específico de ADN
para poder analizarla
 Procedimiento (repetida en un rango de 20-40 ciclos):
o Desnaturalización: separación de las cadenas a una temperatura superior a
90 grados centígrados para romper puentes de hidrógeno sin afectar los
enlaces fosfodiéster.
o Hibridación: alineamiento de cebadores con hebras sencillas de ADN para
formar regiones de doble cadena unidos a cebadores y cadenas dobles de
ADN original. Se da a una temperatura entre 50-60 grados centígrados.
o Elongación: se da a una temperatura de 62 grados centígrados. ADN
polimerasa duplica el material genético. Taq ADN polimerasa replica en
dirección 5´-3´ para obtener copias exactas de hebras de cadena doble del
fragmento que fue seleccionado.
 Resultados: se visualizan mediante la técnica de electroforesis en gel, se
puede enviar a secuenciar, digerir con enzimas de restricción o clonar en un
plásmido. Un resultado positivo o negativo puede reflejar correctamente la
presencia o ausencia de material genético en la muestra presentada, pero
puede no reflejar correctamente el estado de infección del animal del que se
obtuvo la muestra.
 Aplicaciones clínicas:
o Se puede usar tanto en la práctica como en investigación.
o Huella digital genética
o Analizar ADN antiguo
o Test de paternidad
o Detección de enfermedades hereditarias
o Comparación de la expresión génica
o Clonamiento de genes
o Mutagénesis
o Genotipificación de polimorfismos
 Ventajas:
o Rapidez y sencillez de uso
o Sensibilidad ya que puede amplificar secuencias de cantidades pequeñas.
o Resistencia
 Desventajas:
o Peligro de contaminación.
o Infidelidad por falsos positivos
o Tamaño de la muestra (difícil obtener una amplificación eficiente)
o Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana.
LÁTEX:
 Fundamento: se basa en una serie de reacciones inmunológicas antígeno-
anticuerpo donde las partículas sensibilizadas de látex provocan aglutinación.
 Procedimiento (repetida en un rango de 20-40 ciclos):
o Toma de muestra: saliva, orina, sangre y LCR.
o Se mezcla con gotas de látex cubiertas con un anticuerpo o un antígeno
específico (control + (se aglutina porque el látex reacciona con el antígeno
adecuado) en el círculo 1 de la placa y control – (no se aglutina porque no es el
antígeno adecuado) en el círculo 3 de la placa.)
o Se agregan 50 microlitros de la prueba del paciente en el círculo 2 de la
placa.
o Se agrega una gota de látex a cada una de las anteriores.
o Se toma un palillo para mezclar las muestras (no reutilizarlos)
o Agitar de manera rotatoria por 2 minutos y observar el resultado.
 Resultados:
o Normales: No hay aglutinación.
o Anormales: Si hay compatibilidad antígeno-anticuerpo, si hay aglutinación.
 Aplicaciones clínicas:
o Diagnóstico de enfermedades infecciosas de los animales, como:
brucelosis, tifus y paratifus, tularemia, pullorosis, muermo y vibriosis.
o Identificación y clasificación de bacterias como: streptococcus
spp,salmonella spp y shigella spp.
o Identificar diferentes enfermedades reumatológicas, ya que identifica el
factor reumatoide, por ejemplos: Síndrome de Sjögren, enfermedad mixta
del tejido conectivo, LES.
o Se recomienda cuando hay un paciente con sospecha de meningitis
bacteriana y el síndrome de Guillain-Barré
 Ventajas:
o Es una prueba rápida: máximo 15minutos para obtención de resultados.
o Alta especificidad y sensibilidad
o No requiere equipos y materiales de alto costo.
o Es una prueba de fácil acceso.
 Desventajas:
o Resultados semicuantitativos.
o Puede llegar a dar falsos positivos.
o Método para un diagnóstico presuntivo.
o La calidad de la prueba depende de la capacidad inmunogénica de los
antígenos parasitarios que estimulen al sistema inmune del huésped.
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES-ANA:
 Fundamento: detecta anticuerpos antinucleares (es aquel que está dirigido en
contra de histonas, DNA, RNP (ribonucleoproteínas), entre otros componentes
nucleares) en sangre, orina o LCR, indicando trastornos autoinmunes, SLE,
infecciones crónicas y enfermedades linfoproliferativas. Incluye evaluación
manual con microscopio, electroforesis, inmunofijación, citometría de flujo,
entre otros.
 Técnicas empleadas:
o Principal: inmunofluorescencia indirecta
o Confirmación: Western blot, ELISA, microinmunoensayos enzimáticos, y
técnicas luminométricas de detección múltiple
 Aplicaciones clínicas:
o Diagnóstico en pacientes mayores de 65 años, embarazadas, con
enfermedades crónicas y con neoplasias, de trastornos autoinmunes del
tejido conjuntivo, realizar seguimiento a enfermedades o diversas
condiciones como: artritis reumatoides, esclerodermia, síndrome de
Sjögren, y lupus eritematoso sistémico.
FACTOR REUMATOIDE:
 Fundamento: auto anticuerpos de diferentes clases de inmunoglobulinas con
especificidad contra los fragmentos fc (fragmento cristalizable) de la ig G
humana o animal. Mide la cantidad o la presencia de factor reumatoide en
suero.
 Técnicas empleadas:
o Test de Siger-plotz, teste de Waaler-rose, Ria, Elisa y método turbidímetro
con látex
 Aplicaciones clínicas:
o Diagnóstico de artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes

ELISA INDIRECTA:

 Fundamento: detección y cuantificación (antígenos y anticuerpo). Absorción de

proteínas, mediante 3 elementos principales: antígeno, anticuerpo primario y
anticuerpo secundario unido a enzima.
 Procedimiento:
o Fijación del antígeno a la placa
o Adición de un anticuerpo primario sin marcar, uniéndose este al antígeno
o Adición de anticuerpo conjugado con una enzima que se unirá al anticuerpo
primario
o Adición del sustrato
o Incubación
o Lectura de la placa en busca de la reacción del sustrato y la enzima
 Resultados:
 o Se realiza de manera visual y/o por espectrofotómetro para un resultado
más preciso
o Positivo: se identifica un resultado positivo cuando el color de la muestra
cambia por la presencia de anticuerpos específicos, debido a la rotura del
sustrato de la enzima, que libera oxígeno oxidando el cromógeno.
o Negativo: La muestra permanece del color inicial.
 Aplicaciones clínicas:
o Determinación de hormonas y proteínas plasmáticas (Gonadotropina
Coriónica Humana (hCG) en la orina en mujeres como prueba de
embarazo)
o Planificación para un tratamiento o prevención de enfermedades (IgM para
el diagnóstico temprano de Leptospirosis humana)
o Estudios endocrinológicos, oncológicos, trasplantes y medicina forense
(biomarkers de cáncer para su detección temprana)
 Ventajas:
o Diagnóstico rápido
o Alta flexibilidad
o Pequeñas cantidades de reactivos
o Alta sensibilidad
o Peligro biológico
o Resultados objetivos
 Desventajas:
o Alta complejidad
o Reactividad cruzada
o Tiempo de detección corto

ELISA DIRECTA:
 Fundamento: detección de la presencia de antígenos en el organismo
mediante el reconocimiento de la unión entre un antígeno y un anticuerpo por
medio de una señal fluorescente, donde la magnitud es directamente
proporcional a la cantidad del antígeno
 Procedimiento:
o Fijación del antígeno a la placa
o Adición de la muestra del paciente en la que se sospecha la presencia de
anticuerpos contra el antígeno
o Se agrega un anticuerpo conjugado a una enzima, dirigido contra el
anticuerpo del paciente
o Se lava el exceso de anticuerpos
o Se añade el sustrato
o Se detecta por reacción colorimétrica
 Resultados: Al sacar las muestras de la incubadora por última vez, la tinción ya
se ha tenido que desarrollar, mostrando en la mayoría de los casos que los
resultados positivos tienen una tinción más fuerte que los negativos.
 Aplicaciones clínicas:
o Detección de presencia de distintos antígenos patológicos de distinto
origen: parasitaria, bacteriana o viral.
o Cuantificación de Ig
o Enfermedades autoinmunes.
o Coadyuvan a la planificación de tratamientos
 Ventajas:
o Técnica simple y rápida (12-36 horas)
o Poca probabilidad de error y segura
o No reactividad cruzada con el anticuerpo secundario
 Desventajas:
o Uso limitado
o Lector ELISA o espectrómetro
o No amplificación (menor sensibilidad)
o Falsos negativos y positivos

INMUNOFLUORESCENCIA-IFI INDIRECTA:
 Fundamento: Determinar la presencia de un anticuerpo hacia un antígeno
específico en el plasma sanguíneo a través de un anti-anticuerpo
 Procedimiento:
o Incubación Antígeno-Anticuerpo en una muestra de suero plasmático
o Primer lavado, se deja el complejo inmune formado.
o Incubación del complejo inmune con el antianticuerpo o conjugado marcado
con fluorocromo (isotiocianato de fluoresceína)
o Segundo lavado, queda el complejo antígeno-anticuerpo-conjugado
o Montaje de la muestra
o Lectura de la muestra con microscopio de epifluorescencia
 Resultados: crithidia luciliae
o Reacción negativa (El suero control negativo no presenta fluorescencia)
o Reacción positiva (El suero control positivo presentaba fluorescencia en el
25% de las células con la morfología típica del antígeno)
 Aplicaciones clínicas:
o Enfermedades autoinmunes
o Lupus
o Chagas
o Toxoplasmosis
o VIH
o Leptoespirosis
 o Rickettsiosis
 Ventajas:
o Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto
o Se obtienen resultados rápidos
o No es necesario realizar cultivos
 Desventajas:
o No es específico
o Sensible al fotoblanqueo
o No son posibles los análisis in-vivo

INMUNOFLUORESCENCIA-IFI DIRECTA:
 Fundamento: Es una técnica inmuno-histológica que consiste en el uso de un
conjugado de anticuerpos monoclonales con fluorocromo para localizar
antígenos diana mediante el complejo antígeno-anticuerpo.
 Procedimiento:
o Fijación: se mantienen las características biológicas para el estudio
detallado de sus componentes.
o Permeabilización: genera orificios en la membrana celular con el fin de que
ingresen anticuerpos primarios a la célula.
o Buffers: se suele utilizar tampón fosfato salino (PBS) para mantener el pH
en niveles cercanos a los fisiológicos
o Bloqueo: evita uniones inespecíficas de los anticuerpos por medio de
soluciones proteicas como albúmina de suero bovino (BSA).
o Incubación: se incuba la muestra junto al sustrato antigénico. Si el
anticuerpo está presente se formará el complejo antígeno-anticuerpo.
o Lavado: realizar un lavado para eliminar el exceso de cuerpos celulares.
 Resultados:
o Reacción negativa (ausencia de fluorescencia)
o Reacción positiva (presencia de fluorescencia en la muestra)
 Aplicaciones clínicas: (confirmación)
o Enfermedades dermatológicas
o Identificación de microorganismos
o Trastornos de tejido conectivo
o Vasculitis
 Ventajas:
o Resultados rápidos
o Disminuyen los pasos necesarios para su desarrollo
o Realizar cultivos no es necesario
o Posee mayor sensibilidad y especificidad
o Menos sensible a interferencias
 Desventajas:
 o Resultados poco efectivos
o Debe realizarse por personal muy especializado
o Propensa a fotoblanqueo (destrucción fotoquímicca de un fluoróforo)
o Costos elevados por el reactivo y equipo

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS SÉRICAS-EFP:

 Fundamento: se basa en la migración equitativa de las moléculas según su
peso molecular por medio de un campo eléctrico. Las proteínas plasmáticas se
separan en función a su carga eléctrica.
 Procedimiento:
o Ensamblaje de la cámara de electroforesis
o Preparación de geles de poliacrilamida
o Preparación del gel de resolución
o Preparación del gel de empacamiento
o Preparación de la muestra biológica
o Electroforesis
o Coloración y visualización de las proteínas usando azul brillante de coomsie
o Interpretación de resultados
 Resultados:
o Región alfa 1: alfa 1-antitripsina
o Región alfa 2: Alfa 2 - macro bulina
o Región beta: IgA, IgM
o Región gamma: IgG
 Aplicaciones clínicas: (confirmación)
o Útil en el diagnóstico de: Mieloma múltiple y enfermedades autoinmunes
como: el lupus
o Marcador para detectar: proceso inflamatorio, una enfermedad autoinmune,
una infección aguda o crónica, una enfermedad renal y hepática
o Apoyan el diagnóstico de procesos hemolíticos
o Apoyan el diagnóstico a la esclerosis múltiple
o Evalúan el grado de afectación de la integridad de la barrera
hematoencefálica
 Ventajas:
o La inducción del alto potencial eléctrico permite:
1.) que la separación sea más sensible entre las diferentes moléculas
(aumento de la resolución)
2.) que el tiempo de análisis sea más corto.
o En cada separación de utilizan unos pocos (10 – 50) nano litros de muestra.
o Es una prueba de alta resolución
 Desventajas:
 o Los resultados no logran identificar con exactitud, el nivel de moléculas en
una muestra. Para un mejor resultado se recomienda la aplicación de la
técnica de inmunofijación.
o Es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores
experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida
del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del
reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.
PROTEÍNA C REACTIVA:
 Fundamento: La PCR es una proteína producida por el hígado. Se envía al
torrente sanguíneo en respuesta a una inflamación.
 Técnicas empleadas:
o Técnica de látex y PCR
 Aplicaciones clínicas:
o Infecciones bacterianas, infección por hongos, enfermedad intestinal
inflamatoria, trastorno autoinmune, e infección del hueso