Universidad Politécnica Salesiana

TEMA
ANÁLISIS EN BASE AL COSTO Y EFICACIA DE
PRUEBAS DIAGNÓSTICO PARA EL VIRUS Flavivirus
PRECURSOR DEL DENGUE HEMORRÁGICO EN EL
SECTOR DEL GUASMO, PROVINCIA DE GUAYAQUIL.

• Dangerly Gutiérrez
• Camila Tello
• Cinthya viveros
• Mario Zapata
 PROBLEMA DE LA INVESTIGACIÓN

• La falta de desinformación en la población ecuatoriana con relación a las pruebas de

diagnóstico relacionadas al virus Flavivirus precursor del dengue. Este virus al no ser
tratado de manera temprana causa lo que se conoce como dengue hemorrágico con
síntomas más graves. Causando daños drásticos, daños a la salud y siendo fatídicos hasta
llevar a la muerte de una persona.

ÁRBOL DE PROBLEMA
ANTECEDENTES
• El dengue es una enfermedad viral aguda transmitida a través de la picadura del mosquito (artrópodo) Aedes aegypti
infectado con cualquiera de los serotipos del virus dengue. Son virus envueltos, de 40 a 50 nm de diámetro, con cápside
icosaédrica y genoma de ácido ribonucleico (ARN) monocatenario

• En base a estudios serológicos, se ha reconocido cuatro tipos o serotipos antigénicos, DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4,
teniendo cada uno de ellos gran heterogenicidad de cepas determinada en su secuencia de ARN, lo cual tiene utilidad
epidemiológica

• Actualmente, la infección por virus dengue constituye una de las

parvovirosis más importantes y de más amplia distribución en las
regiones tropicales y subtropicales del planeta.

• El principal proceso fisiopatológico que distingue el dengue grave

del cuadro moderado de dengue clásico, es la aparición brusca de
extravasación vascular, hipotensión y choque, los que
acompañados de trombocitopenia y diátesis hemorrágica pueden
llevar a casos fatales.

• Los estudios han demostrado que entre 2% y 4% de los niños que

tienen una infección secundaria de dengue tienen enfermedades
graves.
JUSTIFICACIÓN

En la actualidad el diagnóstico del dengue está dirigido principalmente a la vigilancia epidemiológica y es una
necesidad urgente el contar con métodos que permitan un diagnóstico temprano de la enfermedad

En el caso de RT-PCR es un tipo de método directo en cual varía de 80% a

100% de sensibilidad y depende de la región del genoma seleccionado por
los cebadores

Los resultados falsos positivos también pueden ocurrir como consecuencia

de la contaminación por amplicones de amplificaciones previas.

La sensibilidad de ELISA es una prueba de tipo indirecto para detectar sólo

IgM es del 78%, mientras que la sensibilidad de ELISA que detecta sólo
IgG es del 59%; sin embargo, ello varía dependiendo del tipo de infección

En la actualidad se dispone de un gran número de estuches de ELISA

comerciales, por lo que se ha convertido en la técnica de elección en la
mayoría de los laboratorios clínicos.
 La importancia de este proyecto es utilizar un análisis multivariado para explicar las diferentes relaciones
existentes en las diferentes variables estipuladas:

 Sensibilidad, tiempo y la asociación con las mismas, para establecer la mejor prueba en cuanto al diagnóstico y
detección del virus Flavivirus considerando alta sensibilidad y menor costo del mercado para la accesibilidad
del público, una relación de costo-beneficio.

Objetivos:
● Evaluar diferentes consideraciones en las pruebas inmunológicas de diagnóstico del virus Dengue para establecer
relaciones favorables de la población.

Objetivos específicos:
● Recopilar información bibliográfica de las diferentes pruebas disponibles para el diagnóstico del Dengue
● Diseñar de forma adecuada un análisis multivariado entre las 3 variables involucradas.
● Establecer las pruebas de diagnóstico más oportunas para el público.
METODOLOGÍA Y PROPUESTA DE DESARROLLO
Levantamiento de datos

 La obtención de la información se llevará a cabo mediante un diseño experimental, en este caso el

procedimiento se iniciará con la toma de muestras de los pacientes, que previamente han sido
confirmados como positivos para la infección del virus Dengue.
 Los datos correspondientes a los resultados positivos y negativos, se procederá calcular la
sensibilidad y especificidad de la detección respectiva a cada prueba.
 Posteriormente se organizaron los datos en la matriz descrita a continuación para finalmente llevar
a cabo el procesamiento de los datos mediante un análisis multivariado.
 La toma de muestras se realizará mediante pruebas de sangre.
 Inicialmente se suele hacer un análisis de sangre llamado hemograma para ver los glóbulos
blancos, los glóbulos rojos y las plaquetas.
 A cada individuo se le extrajo 10 ml de sangre, donde se tomaron 5ml para realizar las pruebas
serológicas.
 Las técnicas de diagnóstico aplicadas serán RT-PCR, ELISA, prueba rápida de detección de NS1,
cada técnica con los protocolos siguientes
RT-PCR
Retro transcripción: Para la identificación de los virus Dengue
Mezcle suavemente pipeteando.
Incubar las muestras a los 10 min a 25 ° C seguido de 45 ° C
durante 30 min.
Terminar la reacción incubando a 85 ° C durante 5 min, enfriar
en hielo.
Almacenar la reacción a -20 ° C para el almacenamiento a
largo plazo, o proceder a la PCR de inmediato.
Cebadores: Para la identificación de cualquiera de los cuatro
serotipos del virus Dengue por RT- PCR Múltiple

Los cebadores se restituyeron de la siguiente manera: Cantidad de

Restituyente = (Densidad Óptica x mg) Mezcla de la PCR Múltiple:
Para la realización de la PCR Múltiple se utilizaron las
concentraciones de la mezcla establecidos en este trabajo, las
temperaturas y ciclos
 Mezcla de la PCR
multiplex
PROTOCOLO PARA ELISA

PREPARACIÓN DE LOS
REACTIVOS:
El único reactivo que es necesario preparar con
antelación a la realización de la prueba es la
solución de lavado. Para ello completar hasta 1 litro
con agua destilada un vial de 50 ml de solución de
lavado concentrada (20x). Si aparecen cristales
durante la conservación de la solución concentrada,
calentar a 37ºC antes de diluirlo. Una vez preparada
conservar entre 2 y 8ºC.
Pruebas rápidas detección de NS1

Detecta la proteína no estructural NS1 del virus

del dengue

Se usan anticuerpos sintéticos para detectar la

proteína NS1 del dengue.

pueden ser tan sensibles como las pruebas

moleculares durante los primeros 7 días de
síntomas.
 RT-PCR

La RT-PCR consiste en una transcripción

Las técnicas moleculares tienen varias
ventajas con respecto a las celulares y
serológicas; por ejemplo, son más
sensibles y específicas, permiten la
detección directa del virus y el resultado
se obtiene en poco tiempo
reversa inicial, en la que el ARN viral,
mediante la acción de la enzima transcriptasa
reversa, se convierte en ADN copia, y a
partir de éste se realiza una PCR
convencional en la que se amplifica una
región conservada del genoma del virus
dengue

En general, la técnica RT-PCR consta de

tres pasos:
1. Pre-PCR, extracción del ARN a partir
de suero de pacientes.
2. Transcripción reversa (ARN a ADN),
seguido de la PCR, que puede o no ser
anidada.
3. Post-PCR, visualización en un gel.
 ELISA

Permite la detección de anticuerpos tipo IgG o IgM o de antígenos

virales, y se basa en el uso de una enzima que reacciona con un
sustrato específico, lo cual produce un cambio de color del cromógeno

• Permite obtener no solo un resultado cualitativo, sino semi-

cuantitativo

La reacción con los anticuerpos presentes en el suero del paciente

(IgG o IgM) se evidenciaba con una anti-inmunoglobulina conjugada
con fosfatasa alcalina y cuando había una reacción positiva, ocurría el
cambio de color
• Los diferentes tipos de ELISA han permitido la detección de IgM o
IgG, ya sea por separado o combinados. La sensibilidad de ELISA
para detectar sólo IgM es del 78%, mientras que la sensibilidad de
ELISA que detecta sólo IgG es del 59%
 PRUEBAS RÁPIDAS

Consiste en un sistema visual en tira reactiva,

donde se detectan IgM e IgG, y diferencia
presuntivamente una infección primaria de
una secundaria.

A partir de una reacción que es revelada por

cromatografía, en donde el suero en estudio
migra a lo largo de la membrana de
nitrocelulosa incorporada en el casete

Se atrapan los anticuerpos IgG e IgM presentes en el

suero por acción de anticuerpos anti-IgG o anti-IgM
humana, y posteriormente se adhiere un antígeno viral
unido a un anticuerpo monoclonal anti-virus dengue
marcado con oro coloidal