Efecto de la Tensión Superficial Membranal en la Resistencia de Antibióticos

Kevin A. Suarez∗ and Sergio A. Correal†

Departamento de Fı́sica, Universidad de los Andes
(Dated: December 11, 2019)
El efecto de la tensión superficial en la formación de poros inducida por el péptido LL-37 fue
estudiado por espectroscopı́a de fluorescencia. Para esto, se prepararon liposomas con el principal
lı́pido constituyente de membranas bacterianas (POPG) y se efectuaron mediciones de cinética de
rompimiento de estos liposomas, midiendo intensidad de fluorescencia de calceı́na. Las mediciones
fueron realizadas tanto para liposomas tensionados como no tensionados. Como resultados se en-
contró que a mayor concentración de LL-37 mayor es el porcentaje de rompimiento. Adicionalmente,
los resultados sugieren que los poros se forman con más facilidad (∆∆G < 0) cuando los liposomas
están tensionados, pero se requieren más réplicas para alcanzar una conclusión definitiva.

I. INTRODUCCIÓN Y ESTADO DEL ARTE
El palmitoil-oleoil-fosfatidil-glicerol (POPG) es un
lı́pido común en la naturaleza [1]. La Figura 1 mues-
tra la estructura de este compuesto. Por un lado, la
región donde se encuentran las cadenas lipı́dicas es la
región apolar. Estas cadenas están constituidas de car-
bono e hidrógeno y una de estas tiene un doble enlace,
lo cual le confiere al péptido propiedades estructurales
importantes. Del otro lado, se encuentra el grupo fosfa-
tidilglicerol el cual tiene una carga formal negativa en
uno de los oxı́genos del grupo fosfato (el ion Na+ es
solución no está presente) y por lo tanto es una región po-
lar. Ası́ pues, el POPG tiene una naturaleza anfipática,
de manera que cuando se encuentran en un medio acu-
oso se agrupan y forman bicapas lipı́dicas y en últimas,
forman liposomas. El POPG difiere de otros tipos de
lı́pidos naturales porque contiene carga negativa, en cam-
bio los demás, por lo general, son zwiteriónicos (i.e. son
eléctricamente neutros pero tienen cargas formales sep-
aradas a lo largo de la molécula). Se conoce que es-
tas moléculas tienen fuertes interacciones entre sı́ de tipo
puentes de hidrógeno y otros tipos de interacción de Van
de Waals. Por sus propiedades particulares, el POPG
se encuentra abundantemente en membranas de bacte-
rias. Por ejemplo, este lı́pido constituye el 80 % de la
composición de la membrana de Staphylococcus aureus.
Cabe decir que una caracterı́stica fundamental de las
membranas construidas con POPG es que el exterior de
estas está cargado negativamente por los grupos fosfa-
tidilglicerol.
Por otra parte, se conocen numerosas sustancias ca-
paces de afectar las membranas bacterianas compuestas
de POPG y la catelicidina LL-37 ha mostrado ser una
de las más prometedoras [2]. El LL-37 es un péptido
humano que tiene un papel clave para proteger al or-
ganismo contra ataques infecciosos. Estructuralmente, el
LL-37 tiene una configuración secundaria tipo α-hélice y
es anfipático. Este péptido se caracteriza por tener susti-
tuyentes con carga positiva (aminoácidos básicos) como
se muestra en la Figura 2. Gracias a esta caracterı́stica
eléctrica, el péptido se atrae fácilmente a la superficie
negativa de las membranas de POPG. Cuando el péptido
se une a las vesı́culas de POPG, estas resultan ser afec-
tadas. De acuerdo con Henzler et.al. [3], el POPG se
posiciona paralelo a la superficie membranal y mediante
un mecanismo todavı́a desconocido, el péptido abre poros
en la membrana y ocasiona que el equilibrio iónico de la
bacteria se altere y, en consecuencia, que muera.
FIG. 2: Estructura tres dimensional del péptido LL-37
[2]. La imagen muestra un mapa de densidad de carga:
las regiones azules son de carga positiva y las regiones
rojas son de carga negativa. En su mayorı́a, el péptido
es cargado positivamente.

No obstante, recientemente se ha reportado un estu-

dio computacional que muestra que el efecto de una sus-
tancia antimicrobial no se debe únicamente a sus carac-
terı́sticas quı́micas sino también al estado mecánico de
FIG. 1: Estructura del lı́pido POPG. la membrana objetivo [4]. Los resultados de este estudio
de dinámica molecular indican que la tendencia de un
péptido para formar poros está modulada por la tensión
sobre la membrana. En efecto, se plantea como hipótesis
∗ ka.suarez10@uniandes.edu.co que al incrementar la tensión superficial sobre la mem-
† sa.correal10@uniandes.edu.co brana bacteriana, la acción del péptido LL-37 será mejo-

rada.
En este contexto, en este estudio se pretende compro-
bar experimentalmente la hipótesis sobre la relación en-
tre tensión superficial de membrana y la actividad de un
péptido antimicrobial. Para esto, se pretende emplear
membranas sintéticas de POPG y evaluar la actividad
de LL-37 midiendo porcentaje de liberación de calceı́na
con un espectrofotómetro de fluorescencia.
A. Teorı́a
La tensión superficial se puede determinar fácilmente
a través del control de la diferencia de concentración de
iones entre el interior de la membrana y su exterior.
Según Phillips [5], usando el hecho de que el potencial
quı́mico debe ser igual adentro que afuera de la bicapa,
en un estado de equilibrio, se puede demostrar que la
presión osmótica (p) está dada por la expresión
p = kB T ∆c (1)
donde kB es la constante de Boltzmann, T la temper-
atura y ∆c la diferencia de concentración de iones entre
el interior y el exterior de la membrana. Ahora, igua-
lando el trabajo hecho por la presión osmótica a aquel
hecho por la tensión superficial tau se puede encontrar
que la relación entre esta y la presión p es
1 ∆∆G < 0
τ= R∆p (2)
2 De esta forma, se pretende estudiar y comprobar
donde R es el radio de la vesı́cula.
En esta investigación, se quiere estudiar si la tensión
superficial favorece la generación de poros, mediante un
análisis de espectrometrı́a de fluorescencia por liberación
de calceı́na (i.e. la generación de poros en el liposoma).
Ası́, se pretende determinar si el cambio en la intensidad,
causado por la liberación de calceı́na, esta relacionado
con la exposición del lı́pido a tensión superficial. La
cinética de rompimiento de liposomas está dada por:
   
dL dL
( )s = ks P ( )c = kc P (3)
dt dt
donde dL/dt es tasa de cambio de porcentaje de
rompimiento, P es concentración de péptido y k es con-
stante cinética donde los subı́ndices ”c” y ”s” se refieren
estados con y sin tensión superficial, respectivamente. La
curva que describe los cambios de la intensidad (causada
por la liberación de calceı́na) en el tiempo esta dada por
una función de saturación:
L(t) = A(1 − e−t/τ ) (4)
La ecuación de Arrhenius establece que:
dL 1
ks = ( )s = αe−∆Gs /kB T (5)
dt P
2
dL 1
kc = ( )c = αe−∆Gc /kB T (6)
dt P
De este modo, se puede formular, en variables que se
puedan medir, la hipótesis inicial según la cual la tensión
superficial favorece la generación de poros. Ası́, ya que
con el análisis de fluorescencia se mide la liberación de
calceı́na, se mide indirectamente la generación de poros
del liposoma. Esto provoca un cambio en la intensidad
dado por la ecuación dL dt = kP donde k esta a su vez
relacionado con el cambio en la energı́a de Gibbs. En
este orden de ideas, la hipótesis se puede expresar como:
∆GContensión < ∆GSintensión (7)
Entonces, dividiendo kc entre ks y despejando ∆Gc −
∆Gs , se obtiene:
(dL/dt)c
∆∆G = kB T ln( ) (8)
(dL/dt)s
Donde ∆∆G ≡ ∆GC − ∆Gs . El significado de esta
ecuación es que se puede medir el cambio en energı́a libre
de Gibbs en el proceso de generación de poros por el LL-
37 cuando hay tensión superficial menos cuando no la
hay, midiendo las pendientes iniciales de las curvas de
saturación. Finalmente, la hipótesis a comprobar es:
(9)
la hipótesis para corroborar los resultados actuales en
dinámica molecular, en los que se sugiera que la tensión
superficial es fundamental en la generación de poros en
las membranas.
II. OBJETIVOS
A. Objetivo General
Evaluar si el cambio en el gradiente de presión osmótica
sobre liposomas ocasiona una variación en la suscepti-
bilidad de sus membranas a la formación de poros, por
acción de péptidos antimicrobiales.
B. Objetivos especı́ficos
• Preparar las soluciones de POPG, buffer HEPES
con calceı́na y del lı́pido LL-37.
• Formar liposomas con calceı́na adentro empleando
un extrusor y purificando las vesı́culas mediante
cromatografı́a en columna.
• Determinar la osmolaridad máxima crı́tica que re-
sisten los liposomas sin romperse, mediante moni-
toreo con espectroscopı́a de fluorescencia.

• Medir el porcentaje de liberación de calceı́na en
función del tiempo para varias condiciones de
presión osmótica.
• Estimar el efecto que tiene el estrés osmótico en
la barrera energética asociada a la energı́a libre
de Gibbs del proceso de formación de poros en
vesı́culas de POPG por el péptido antimicrobial
(LL37).
III. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
La metodologı́a seleccionada para estudiar el efecto
del péptido antimicrobial en la formación de poros de
membrana es el ensayo de derrame de calceı́na [6]. Las
pelı́culas de lı́pido se preparan disolviendo 4 mmol de
lı́pido POPG en cloroformo. El solvente se evapora en
un liofilizador durante una noche. Las pelı́culas de lı́pido
se rehidratan en buffer HEPES (20 mM HEPES, pH 7.4,
800 mOsm) que contiene calceı́na 50 mM (800 mOsm)
y se agitan en agitador vortex durante 7 min, para for-
mar vesı́culas multilaminares. Este buffer se prepara di-
solviendo la cantidad deseada de calceı́na en 10 mL de
agua MilliQ y se agrega 2.5 mL del buffer HEPES. El
pH se ajusta con NaOH 1M hasta 7.4. La osmolaridad
se ajusta con NaCl. Finalmente, se ajusta el volumen de
modo que la concentración final de calceı́na sea 50 mM.
Las vesı́culas grandes unilaminares se obtienen usando
un extrusor Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)
con un filtro de policarbonato. Las vesı́culas tinturadas
se separan de aquellas sin teñir mediante cromatografı́a
por exclusión de tamaño en columna Sephadex G50 (1
cm x 25 cm) usando como solvente de elución el buffer
HEPES con calceı́na.
En cuanto a los experimentos cinéticos, primero se de-
termina la máxima tensión que resisten los liposomas.
Para esto se mezclan 40 µL de lı́pido con 1460 µL de
una combinación de buffer y agua. La intensidad de flu-
orescencia se mide con el espectrofotómetro PC1 (ISS,
Champain II) con control de temperatura (ajustado a 37
◦
C) usando longitudes de onda de excitación y emisión de
480 y 520 nm, respectivamente. Se mide la fluorescencia
de los lı́pidos por cerca de 50 s. Una completa liberación
de calceı́na se obtiene adicionando TritonX-100 (50 µL)
a una concentración final de 0.05%. La intensidad de
liposomas se mide para varias fracciones de agua en la
mezcla de buffer/agua. Entre más agua se agregue, más
tensionados están los liposomas. El porcentaje aparente
de liberación de calceı́na (derramamiento de membrana
normalizada) se calcula de acuerdo con la ecuación
F − Fo
LT = ∗ 100 (10)
F100 − Fo
donde F es la intensidad de fluorescencia antes de agre-
gar el Tritón y F100 después de agregarlo. Fo es la fluores-
cencia de las vesı́culas intactas. Los experimentos deben
realizarse por triplicado.
3
A continuación, se determinan las curvas de satu-
ración. Para esto, se monitorea la estabilidad de los li-
posomas (40 µL) por 50 s. Luego, se mide la curva de
saturación por 80 s agregando una fracción del péptido
LL-37 y finalmente se adiciona tritón para alcanzar
rompimiento total de los liposomas. La fracción de
péptido se varı́a cinco veces (y se toman 3 réplicas de
cada medición). Este proceso se hace tanto para liposo-
mas no tensionados, como para liposomas en condiciones
de máxima tensión (determinadas anteriormente).
Finalmente, tras obtener los datos del cambio de
rompimiento L en el tiempo se obtienen ciertas cur-
vas que varı́an según si la muestra fue expuesta o no a
tensión superficial. De esta forma, al utilizar el análisis
expuesto en la introducción, se calculan las pendientes
justo después de agregar el LL-37, debiéndose observar
una mayor pendiente para las muestras con tensión su-
perficial, de acuerdo a la hipótesis inicial.
IV. DISCUSIÓN Y RESULTADOS
Inicialmente se determinó el estrés osmótico máximo
que soportan los liposomas sin estallarse considerable-
mente. Para esto, se mezclaron el buffer y los liposo-
mas, adicionando diferentes cantidades de agua. Como
el buffer y los liposomas están preparados con la misma
osmolaridad (800 mOsm de iones), al agregar diferentes
proporciones de agua se ejerce tensión superficial sobre
las membranas lipı́dicas. La razón es que el agua diluye
la concentración de sales del medio y, como se mencionó
en la introducción, una diferencia de concentración de so-
luto entre el interior y el exterior del liposoma ocasiona
una presión osmótica p, lo que conduce a una tensión su-
perficial τ = Rp/2 (ver ecuación 2). La Figura 3 muestra
un ejemplo de los datos medidos en esta etapa. La Tabla
I resume los resultados de numerosas réplicas. Con base
en estos datos y puesto que 5% es el máximo porcentaje
de rompimiento que puede considerarse despreciable, se
seleccionó la tensión superficial que ocasiona una fracción
de agua de 0.300 para experimentos subsecuentes.
TABLE I: Porcentaje de rompimiento de liposomas (L%)
para diferentes fracciones (vol/vol) de agua. Cada me-
dida se hizo por triplicado. Se muestra que cuando 0.3
del volumen final corresponde a agua, los liposomas están
tensionados con un nivel de rompimiento despreciable (5
%).
fagua (vol./vol.) L (%)
0.100 1.3 ± 0.3
0.200 3.41 ± 0.05
0.300 5.2 ± 0.2

FIG. 3: Curva representativa de los datos medidos para
determinar el máximo nivel de tensión superficial con un
L despreciable. Esta curva es para el caso de 5% de
rompimiento.
A continuación, se estudió la cinética de rompimiento
de liposomas al variar la concentración de péptido antimi-
crobial LL-37. En primer lugar, se realizaron mediciones
sin someter a estrés osmótico a los liposomas. La Figura
4 muestra las curvas obtenidas de esta forma. Como se
observa, los datos siguen una tendencia de una curva de
saturación (ecuación 4). A medida que la concentración
de péptido LL-37 aumenta, el rompimiento de liposomas
incrementa (las curvas están más arriba), lo cual corre-
sponde con el efecto destructivo de membrana reportado
para este péptido.
FIG. 4: Cinéticas de rompimiento de liposomas a difer-
entes fracciones de péptido antimicrobial LL-37 respecto
a la concentración de liposomas (0.07 mM). En este caso
los liposomas no se sometı́an a estrés osmótico. Las
curvas muestran que hay mayor rompimiento conforme
mayor es la concentración de LL-37 en la muestra. Las
incertidumbres son 0.01 s para el tiempo.
En segundo lugar, se efectuaron las mismas medidas
que en el paso anterior pero esta vez sometiendo a los
liposomas a tensión superficial (empleando fracción de
agua de 0.3 como se mencionó al comienzo). La Figura
5 muestra los resultados ası́ obtenidos. Como se observa,
de nuevo, existen un mayor porcentaje de rompimiento
4
a medida que la fracción de péptido en solución es más
grande. Sin embargo, la tendencia no es completamente
evidente al comparar las curvas de fLL−37 de 0.06 y
0.04. Lo que se observa es que la curva de 0.04 está
por encima que la de 0.06, lo cual rompe con la tenden-
cia discutida hasta el momento. Este hecho se atribuye a
la mayor probabilidad de errores que existen a fracciones
de péptido bajas puesto que estas involucran medir los
volúmenes más bajos. Es de notar que las incertidum-
bres (de 5%) de las curvas con fracción de péptido menor
a 0.08 se solapan. Por esta razón, se concluye que para
mediciones futuras se trabaje en un rango de fracciones
de péptido por encima de 0.08.
FIG. 5: Cinéticas de rompimiento de liposomas a difer-
entes fracciones de péptido antimicrobial LL-37 respecto
a la concentración de liposomas (0.07 mM). En este
caso los liposomas se sometı́an a estrés osmótico (con
fagua = 0.300). La gráfica inferior no tiene barras de
error y es a una escala diferente por claridad. Las curvas
siguen un patrón similar a las de la Figura 5, pero menos
claro. La incertidumbre es 0.01 s para el tiempo.
Por último, se compararon las cinéticas de
rompimiento con tensión y sin tensión superficial.
Esta comparación se realizó para cada par de datos con
la misma fracción de péptido LL-37. Una muestra de
esto se ilustra en la Figura 6 en la que se usa una fracción
de fLL−37 =0.1. De acuerdo con la hipótesis, la cinética
de rompimiento cuando hay tensión superficial deberı́a
ser más rápida que aquella en ausencia de tensión.
Cuantitativamente, esto se puede determinar calculando
las pendientes iniciales de las curvas medidas. En el
caso mostrado en la imagen, efectivamente, la pendiente
inicial de la curva tomada con estrés osmótico en más
grande que sin estrés.
Las réplicas de todas las mediciones se tomaron en
cuenta y la Tabla II muestra las pendientes determinadas
en cada caso. Estas pendientes se calcularon ajustando
a una función lineal los primeros datos de las curvas.
Para tener en cuenta todas las mediciones, se efectuó un
promedio ponderado de pendientes, donde el peso estaba
determinado por la incertidumbre asociada a las pendi-
entes. A la luz de la ecuación 8 se calcularon las diferen-

cias de barreras energéticas ∆∆G = ∆Gc − ∆Gs . Como
se observa en la tabla, en todos los casos excepto uno el
∆∆G fue negativo, lo cual soporta la hipótesis de que a
mayor tensión superficial el efecto del LL-37 se promueve.
El caso excepcional de la fracción de 0.09 es todavı́a un
motivo de estudio y sugiere efectuar más réplicas de esta
medida. Lo anterior y el hecho de que las incertidum-
bres de las medidas con tensión superficial a fracciones
de LL-37 menores a 0.08 tengan alta incertidumbre aso-
ciada, ocasionaron que la tendencia en cuanto a ∆∆G
no fuera clara. Ası́ pues, para realmente comprobar la
hipótesis se requieren más repeticiones del experimento.
FIG. 6: Comparación entre la cinética de rompimiento
con tensión superficial y sin tensión superficial. En este
caso la fracción de péptido es de 0.1. La curva hallada
con estrés osmótico tiene una pendiente mayor a la de
sin estrés, lo cual soporta la hipótesis evaluada. Las in-
certidumbres son 0.01 s para el tiempo y 5% para el por-
centaje de rompimiento L.
TABLE II: Diferencia de barreras energéticas de for-
mación de poro con tensión superficial y sin tensión:
∆∆G (en unidades de kB Tr con T r = 295 K). Se mues-
tran los resultados calculados para diferentes valores de
fracción de péptido antimicrobial. Se muestran también
las pendientes promedio obtenidas sin (subı́ndice s) o con
(subı́ndice c) tensión. Los valores negativos de ∆∆G
comprueban la hipótesis testeada.
fLL−37 (dL/dt)s (dL/dt)c ∆∆G
(conc./ conc.) % s−1 % s−1 kB Tr
0.10 1.40 1.78 -0.26 ± 0.07
0.09 1.41 0.590 0.91 ± 0.06
0.08 0.152 0.214 -0.36 ± 0.09
0.06 0.451 0.453 -0.01 ± 0.06
0.04 0.152 0.322 -0.8 ± 0.3
Con el fin de verificar que los resultados obtenidos para
las cinéticas, con y sin tensión, tengan un sentido fı́sico y
arrojen resultados que sean confiables, se procede a hacer
el cálculo del valor esperado de la energı́a libre de Gibbs
utilizada en este proceso. Para esto, se parte de:
∆G = τ da (11)
5
Donde da = 8πRdR, siendo R el radio de las vesı́culas,
el cual tiene un valor de 100 nm (conocido debido al
proceso de extrusión previo). De este modo, es posible
re-escribirla como da = ( da da 2
A )A = ( A )4πR , lo cual es
útil puesto que se conoce el valor de la expansión del
área membranal da/A de las vesı́culas en este tipo de
soluciones[7], obteniéndose da = 1, 507 ∗ 10−16 m2 . Por
otra parte, el τ representa la tensión superficial y se cal-
cula a partir de la ecuación 2. Entonces, τ = 21 Rp y
p a su vez se halla a partir de la ecuación 1. Aquı́,
la concentración es (teniendo en cuenta el porcentaje
de rompimiento de liposomas, previamente calculo [ver
Tabla I]) ∆c = 560 ∗ 10−3 mM/m3 → p = kB T ∆c =
1420 Pa. Con este valor de p se obtiene que la tensión
superficial es τ = 7, 1 ∗ 10−5 N/m. Finalmente, reem-
plazando esto en ∆G se obtiene que su valor esperado es
∆G = 2.61 kB Tr .
Como se puede observar, el valor esperado difiere en
un orden de magnitud a los valores obtenidos en el ex-
perimento (ver Tabla II), esto puede ser debido a que
el valor consultado para el da/A puede no ser exacto
para esta mezcla en concreto[7]. Por otra parte, cabe
decir que existe una fuente de error sistemático en el
momento de medir en el fluorómetro. El error consiste
en que para adicionar el péptido LL-37 se requerı́a re-
mover la tapa del equipo. Como consecuencia, en dicho
momento ingresaba luz del ambiente y por ello se ob-
servaba un pico de intensidad. Los puntos de intensidad
en este pico, debieron descartarse, por lo que las pendi-
entes tuvieron que tomarse con los puntos mas próximos
a este. Sin embargo, se considera que estos puntos ini-
ciales son los mas importantes puesto que arrojan mas
información sobre la pendiente. Por ello, se sugiere repe-
tir el experimento haciendo una pequeña abertura en la
tapa del fluorómetro donde se almacenan las muestras,
de tal forma que se elimine el pico de intensidad por luz
parásita y los primeros datos de la curva de saturación
se puedan medir con más exactitud.
A. Conclusiones
La capacidad del péptido LL-37 para formar poros
cuando la membrana lipı́dica está tensionada fue com-
parada a cuando la membrana no se sometı́a a tensión.
Para esto se prepararon liposomas de POPG (como mod-
elo de membrana bacteriana) y se midió el porcentaje de
liberación de calceı́na por espectroscopı́a de fluorescencia
para diferentes condiciones de concentración de LL-37 y
de tensión superficial. Como resultados, se encontró que
entre mayor es la concentración de péptido, más alto es el
porcentaje de rompimiento de los liposomas. En adición,
a pesar de que los resultados sugieren que la hipótesis es
verdadera ya que en la mayorı́a de casos ∆∆G fue neg-
ativo, la tendencia en cuanto a este valor no fue clara.
Para confirmar definitivamente la hipótesis se sugiere re-
alizar más réplicas a este experimento. Finalmente, se
estableció que una mejora experimental a la metodologı́a

consiste en construir una tapa al fluorómetro con un orifi-
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