MICROSCOPÍA: MANEJO•DEL MICROSCOPIO ÓPTICO Y

3
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS Y MICROORGANISMOS

1. RESULTADOS DE APRENDIZAJE
a. Identifica las partes del microscopio compuesto y sus respectivas funciones.
b. D escribe los principios ópticos y no ópticos que rigen el poder amplificador del microscopio y
definir sus límites de amplificación.
c. Reconoce la importancia del microscopio en el desarrollo de las ciencias biológicas.
d. Realiza preparados en fresco y seco, estructuras de diferentes grados de complejidad biológica que,
por su tamaño, no son observables con el ojo; como las bacterias, protozoarios y hongos.
e. Enfoca un preparado “en fresco”, con el objetivo panorámico (4x) y los objetivos de pequeño
aumento (10X) y mediano aumento (40X) y un preparado “en seco” con el objetivo de 100X.

2. INTRODUCCIÓN
La palabra microscopio viene del griego mikro, pequeño y skope, visión. Los microscopios son
instrumentos que nos permiten observar objetos pequeñísimos que no se pueden ver a simple vista,
ni con la ayuda de una lupa.
Un microscopio compuesto es un microscopio óptico que tiene más de un lente. Los microscopios
compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en láminas tan
finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imágenes de objetos y
organismos no visibles a simple vista.

Formación de la imagen en un microscopio

Los primeros microscopios aumentaban la imagen 200 veces. Hoy en día el microscopio
compuesto, que puede ser monocular o biocular, permite obtener aumentos de 100 a 1500 X. Se han
desarrollado diferentes sistemas de iluminación para el microscopio, que permiten observar células o
tejidos vivos, o fijados y teñidos. Sistemas en que el trayecto de la luz va desde la lámpara hasta el ojo
del observador pasando por un sistema de lentes que la alinea y la concentra.

2.1 CARACTERÍSTICAS DE LA VISIÓN CON EL MICROSCOPIO

1. Grado de Aumento: Es la magnificación total que sufre la imagen del objeto debido al efecto
de los lentes oculares y objetivos. Se obtiene multiplicando el número de veces que aumenta
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

el lente ocular por el número de veces que aumenta el lente objetivo. Si el objetivo aumenta la
imagen de un objeto 40 veces, ésta al pasar por la lente ocular será nuevamente aumentada. Si el
ocular aumenta 10 veces, la magnificación total en este caso será: 10X x 40X = 400X.
Esto permite saber cuántas veces más grande estamos viendo la imagen de un objeto.
2. Poder de Resolución. Es la posibilidad de distinguir separados dos puntos muy cercanos entre sí.
Cuanto mayor sea el poder de resolución, menor será la distancia entre dos puntos a la cual pueden
distinguirse como tales. La distancia límite en la cual dos puntos pueden ser todavía distinguibles
se denomina límite de resolución. El poder de resolución de un microscopio compuesto depende
de la longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numérica (propiedad óptica de la
lente). Puede ser calculado mediante la siguiente fórmula:
P.R. = Lambda/2 A.N.
Donde: Lambda = Longitud de onda de la fuente luminosa, A.N. = Apertura numérica de la lente.
Existe una correspondencia entre el aumento de un objeto y su apertura numérica, de tal modo
que las lentes con mayores aumentos generalmente tendrán mayores aperturas numéricas. El
poder de resolución es quizá la característica más importante de un buen microscopio ya que
de nada sirve una imagen muy grande del objeto, si ésta se ve borrosa y no puede distinguirse en
sus detalles.
3. Distancia de Trabajo. Es la distancia que existe entre el objeto en observación y el lente
objetivo. Esta distancia variará según el aumento del lente objetivo con el cual se trabaje. Es
inversamente proporcional al grado de aumento; es decir, cuanto mayor sea el aumento del lente
objetivo menor será la distancia de trabajo. Cuando se trabaje con un lente de inmersión la distancia
de trabajo será mínima. En estos casos es necesario usar aceite de inmersión entre el lente objetivo
y la preparación debido a que el índice de refracción para este tipo de lente es la del aceite y no
la del aire. Esto permite obtener una imagen de gran tamaño y al mismo tiempo de gran nitidez.

2.2 PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

El microscopio óptico común está conformado por tres sistemas:
1. Sistema óptico
Comprende, los lentes oculares y los lentes objetivos dispuestos de tal manera que producen el
aumento de las imágenes que se observan a través de ellas. Y a los dispositivos del sistema de
iluminación que reflejan, transmiten y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la
observación a través del microscopio
a. Ocular: Lente situada en la parte superior del tubo cercano al ojo del observador. Amplía la
imagen del objetivo de 6X, 10X y 15X
b. Objetivo: Lente situada en el revólver cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.
Son lentes de diferentes aumentos, el de menor aumento es más corto (3.2X,4X, 8X y 10X) y el
de mayor aumento es más largo (40X y 44X). Puede existir además un objetivo de inmersión
de 100 a 150 aumentos.
2. Sistema de iluminación
a. Condensador: Lente que concentra el haz luminoso hacia la preparación
b. Diafragma: Abertura que regula la cantidad de luz que ingresa en el condensador. hacia la
preparación.
c. Luz incorporada: Corresponde a un foco de luz eléctrica que proporciona la luz que llega
hasta el objeto a estudiar y el sistema óptico del microscopio.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

3. Sistema mecánico
Constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, que permiten el
movimiento para el enfoque
a. Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
• Pie. Base que da soporte y estabilidad al microscopio.
• Columna. Estructura que une el pie con la platina y el tubo. Sostiene además el
condensador y el diafragma.
b. Platina: Superficie plana para sostener el portaobjeto y el cubreobjeto que contienen los prepa-
rados. Presenta las pinzas.
c. Pinzas. Par de láminas, situadas sobre la platina, para mantener al porta- objetos.
d. Cabezal: Proporciona soporte a los lentes oculares y objetivos. Puede ser monocular,
binocular.
e. Revólver: Sistema giratorio relacionado con el tubo, que porta los lentes objetivos para diversos
aumentos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
f. Cremallera. Asociada a dos tornillos, permite el movimiento vertical del tubo o de la platina
para obtener la distancia a la cual el objeto puede ser observado nítidamente; es decir, el
enfoque preciso para el observador.
g. Tornillo macrométrico. Permite movimientos muy cortos en un ajuste fino del enfoque para
lograr una observación precisa.

Células Procariotas y Eucariotas.

El conocimiento de las estructuras del ser vivo está basado casi totalmente en el estudio con el
microscopio. El microscopio óptico es un instrumento que permite la observación de estructuras y
detalles tan pequeños que no podrían ser observadas a simple vista, fundamentales para el desarrollo
de la investigación en ciencias biológicas.
Hook (1665), observó por primera vez las células, en cortes finos de corcho, como compartimientos
simulares a un panal de abejas, de donde proviene su nombre (cella: espacio vacio) y que no se trataba
de células vivas, sino de paredes celulares sin nada de sus componentes citoplasmáticos. La célula es
la porción más pequeña de sustancia viva de que están formados los seres orgánicos. Todos los seres
vivos, bacterias, animales y vegetales, están formados por células.
La forma de la célula es variada. Generalmente es esférica, pero también puede ser estrellada,
ramificada, etc. El tamaño de las células es muy pequeño. Son invisibles a simple vista; es necesario el
microscopio para distinguirlas. Para medir una célula se utilizan el micrómetro (µm). Un micrómetro
o micra es la milésima parte de un milímetro (10-3 mm), es decir, la millonésima parte de un metro
(10-6 m).
Se conocen dos grandes grupos de células, las células procariotas y las células eucariotas.
Las células procariotas: Son células pequeñas que miden entre 0,2 -10 μm de diámetro
aproximadamente. Posee, una estructura simple existiendo tres componentes celulares comunes que
son la membrana plasmática, ribosomas y un nucleoide. Además, se encuentran presentes la pared
celular y la cápsula en la mayoría de ellas. Otras además presentan flagelo.
La característica que permite clasificar a una célula procariota, es la carencia de una envoltura
nuclear, de esta forma su nucleoide está en contacto con el citoplasma de la célula. También tiene su
ADN desnudo y carece de organelos citoplasmáticos. Su ADN está formado por una sola cadena
circular, muy plegada y empaquetada que no se encuentra asociada a proteínas.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

Las células eucariotas: Son células que miden entre 10 - 100 μm con núcleo definido delimitado
por una doble membrana, que contiene en su interior el material genético, el ADN que se encuentra
asociado a proteínas (histonas y no histonas), formando el complejo macromolecular llamado
cromatina, también se encuentra dentro del núcleo el nucléolo que es una masa compacta de gránulos
y fibrillas ribonucleoproteicas. Internamente presenta un sistema de membranas encargadas de los
procesos metabólicos, existiendo algunas diferencias entre las células debido a la función que cumplen
dentro del organismo y por el grado de diferenciación.

3. MATERIALES Y EQUIPOS.

Biológico Laboratorio Reactivos y soluciones

Muestras de agua estancada (*) Microscopio óptico Agua destilada
Recorte de periódico (*) Láminas y laminillas Alcohol -acetona
Palillos mondadientes * Mechero, Gradillas Azul de Metileno, Eosina
Yogurt * Frasco lavador Violeta de Genciana, Safranina
Cubeta de tinción Solución de Lugol y aceite de cedro
Con (*) material a traer por el estudiante el día del TP.

4. PROCEDIMIENTO
a. Conociendo el microscopio
▪ Ubique en el microscopio cada una de las partes (óptica y mecánica). Determinar la
función de cada una de estas partes.
▪ Coloque sobre un portaobjeto, la letra “e” de un recorte de papel y enfoque el microscopio.
▪ Primero debe comprobar si el lente objetivo de menor aumento está a continuación del tubo;
si no es así, debe colocarse en dicha posición haciendo girar el revolver hasta alcanzar un
"tope" que lo indique.
▪ Abra completamente el diafragma y observando a través del ocular, observe un círculo
uniformemente iluminado. Este constituye el "campo óptico". Una vez que se obtiene la
iluminación máxima, No se debe cambiar la posición del microscopio.
▪ Ubique y sujete el portaobjeto en la platina, procurando que la preparación se halle en el
centro de la abertura circular.
▪ Mueva el tornillo macrométrico para acercar el lente objetivo de menor aumento hacia la
preparación, hasta llegar a un tope.
▪ Observe por el lente ocular, mueva nuevamente el tornillo macrométrico en el sentido inverso
hasta que aparezca la imagen.
▪ Una vez enfocada la imagen girar el tornillo hasta que sea nítida. Nunca se debe usar el
tornillo micrométrico para grandes desplazamientos, para ello está el tornillo macrométrico.
Cuando los tornillos macro y micrométrico se encuentren incorporados en un solo dispositivo,
el ajuste fino se hace solo después de haber realizado el avance rápido de acercamiento
a la preparación.
▪ Antes de pasar al siguiente aumento verifique que la imagen a observar se encuentre en el
centro del campo, haga girar el revólver cambiando el lente objetivo hasta llegar al "tope" y
accionar solamente el tornillo micrométrico hasta obtener la nueva imagen.
▪ Terminada la observación, gire el revólver para colocar el objetivo de menor aumento en la
primera posición de trabajo.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

▪ Apague el microscopio, retire la preparación y deje limpio el microscopio.

Observación de preparados en seco

❖ Observación de bacterias
Las bacterias reaccionan de modo distinto frente a la tinción de Gram porque las diferencias
estructurales en sus paredes determinan la retención o el escape del complejo cristal violeta/lugol
(yodo-yoduro de potasio). Las bacterias Gram positivas presentan más peptidoglucano en su pared
celular que las bacterias Gram negativas. Por otro lado, las bacterias Gram positivas presentan un
polímero con un gran número de uniones cruzadas dando como resultado un plano de malla
pequeña, mientras que, las Gram negativas presentan un polímero con pocos entrecruzamientos
que determina una malla o tamiz grande. De tal manera que al agregar el lugol se forma un
complejo cristal violeta/mordiente con un tamaño molecular mayor al del tamiz del
peptidoglucano de las bacterias Gram positivas y menor al tamiz de las Gram negativas. Es por eso
que al decolorar el preparado con alcohol-acetona, las bacterias Gram positivas retienen el
complejo colorante-mordiente y permanecen de color violeta. En cambio, en las Gram negativas el
complejo colorante/mordiente se elimina de la capa delgada de peptidoglucano, quedando
incoloras hasta que se agrega la safranina, después de lo cual aparecen de color rosado.
En la práctica se observarán bacterias del yogurt. El yogurt es un producto lácteo producido
por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a
la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus,
poco productor de ácido, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En el preparado se podrán,
por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación
(estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30μm de
longitud) facilita su observación.
Protocolo para observar bacterias (Tinción Gram)
• Disuelva una mínima porción de yogurt en una pequeña gota de agua.
• Coloque la muestra en un portaobjetos, realice un frotis y fije el preparado con el mechero.
• Coloree la muestra con cristal violeta por 1 minuto
• Lave con abundante agua el exceso de colorante.
• Cubra el preparado con Lugol por 1 minuto.
• Lave con agua el exceso de Lugol.
• Decolore con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que el preparado deje de
perder color (30 segundos)
• Lave con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
• Coloree con safranina por 1 minuto.
• Lave con agua para eliminar el colorante de contraste.
• Debe secar el preparado y examinar al microscopio con objetivos, de 4X, 10X, 40X y 100X,
fijándose en el color de cada tipo de bacteria. Cuando use el objetivo de 100 X debe agregar
aceite de cedro.

❖ Observación de células epiteliales de la mucosa bucal

La cavidad bucal por ser una puerta de comunicación con el exterior, está constituida por una
membrana de superficie húmeda, necesaria para el mantenimiento de la estructura normal de los
tejidos. La mucosa bucal está formada por un epitelio, de origen ectodérmico, de tipo plano
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

estratificado, pudiendo ser queratinizado, paraqueratinizado o no queratinizado. En cuanto a sus

elementos celulares se encuentran células intrínsecas propias del epitelio formada por los
queratinocitos (90%), estos durante su evolución van migrando desde las capas más profundas
hacia la superficie disponiéndose dentro del epitelio en cuatro capas: basal, espinoso, granuloso y
córneo. Dentro de la capa basal se encuentran inmersos los melanocitos, las células de Merkel y
las células de Langerhans.
Protocolo para observar células epiteliales de la mucosa bucal
• Con el extremo romo de un mondadientes (o
puede ser un hisopo), raspe la parte interior
de la mejilla con suavidad, con poca fuerza,
para no hacerse daño. Deposite el material
extraído en una lámina portaobjetos.
• Coloque la muestra en un portaobjetos,
extiéndala en la parte central y fije el prepa-
rado con ayuda del mechero.
• Agregue unas gotas de azul de metileno (o eosina) sobre toda el área de extensión. Deje actuar
el colorante por el tiempo de 10 minutos.
• Luego, lave el portaobjetos, colocándolo inclinado y echando agua suavemente con el frasco
lavador para que sea arrastrado el colorante sobrante.
• Debe secar el preparado al mechero y examínelo al microscopio con objetivos de pocos
aumentos. Escoja para la observación, moviendo el portaobjetos sobre la platina, la zona mejor
coloreada. Después, mueve el revólver, cambiando a aumentos mayores hasta el objetivo de
100X. Al usar el objetivo de 100X debe colocar aceite de cedro.
La preparación muestra una visión parecida a un mosaico formado por células planas,
poligonales (epitelio pluriestratificado), más o menos irregulares, mostrando células aisladas.
El azul de metileno tiñe intensamente el núcleo y con menor intensidad el citoplasma.

Observación de preparaciones con objetivo de inmersión

• Baje al tope la platina y subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que colocarse la gota de aceite
• Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de 4x0.
Dejar caer una gota de aceite de inmersión sobre el portaobjeto, sin Permitir que el gotero toque
el preparado.
• Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de 100X
• Mire directamente al objetivo y lentamente subir la platina hasta que la lente toque la gota de
aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
• Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersión y la preparación es mínima, aún menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
• Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el
objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite.
• Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación. Una vez
finalizada la observación del preparado, no lo retire con el objetivo de inmersión en posición de
observación.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

CUESTIONARIO

1. ¿Qué es el límite de resolución de un microscopio?

2. Establezca las diferencias entre microscopio óptico y electrónico
3. Problemas que se presentan habitualmente durante la observación microscópica y que desencadenan
en una mala imagen
4. ¿Cómo se diferencian las preparaciones en freso de las preparaciones en seco?
5. ¿Porqué las células en general son microscópicas?. Cómo explica la resolución superficie/volumen?
5. ¿Cómo se clasifican los colorantes según su comportamiento químico?
6. ¿Por qué es necesario que las muestras sean teñidas?. Describa algunas aplicaciones para los distintos
tipos de tinciones (coloraciones) mencionados líneas abajo. ¿Son aplicables a microscopía óptica o
electrónica?
- Citoplasma. - Grasas
- Aparato de Golgi - Mitocondrias
- Núcleos - Cromosomas
7. Explica el fundamento de la coloración hematoxilina-eosina
8. Establezca las diferencias entre células procariotas y eucariotas.
9. Suponga que usted trabaja en un laboratorio que analiza muestras de alimentos potencialmente
contaminados. Se le plantea la tarea de examinar e identificar las bacterias de una muestra de
mayonesa posiblemente contaminada con bacterias patógenas.
a. ¿Cómo podría hacer para observar si realmente hay bacterias contaminantes?
b. ¿Cómo haría para identificar si el contaminante se trata de Salmonella typhi (bacilo) o Enterococcus
faecalis (coco)?

Bibliografía
Gonzáles R.C. et al. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Un enfoque gráfico. UNAM,
FES Zaragoza, 2020. https://www.zaragoza.unam.mx/wp-
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/Tinciones.pdf
Isac L. El microscopio óptico.
http://www.bibliotecagbs.com/archivos/027_032_CAP2_GBS.pdf
Karp G. Capítulo 1 Introducción al estudio de la biología celular y molecular
https://www.sciencesfp.com/uploads/2/1/5/9/21597828/karp_biologia_celular_y_molecular_ca
pitulo_muestra_12%C2%BA.pdf
Llanos M. et a. colorantes más usados en el estudio de estructuras tisulares. Segundo Congreso
Virtual de Ciencias Biomédicas. 2021.
https://cibamanz2021.sld.cu/index.php/cibamanz/cibamanz2021/paper/viewFile/465/345
Megías M., Molist P., Pombal M.A. Técnicas histológicas ´ Tinción. Universidad de Vigo. 2018
https://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/tecnicas-tincion.pdf
Chapter 4. Functional Anatomy an prokaryotic and Eukaryotic cells.
https://faculty.uobasrah.edu.iq/uploads/teaching/1631077445.pdf
Técnica histológica y microscopía:
https://www.berri.es/pdf/HISTOLOGIA%E2%80%9A%20Texto%20y%20Atlas%20Color%20con%20Biol
og%C3%ADa%20Celular%20y%20Molecular/9789500603225
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

TRANSPORTE A TRAVÉS
• DE LA MEMBRANA
4
Y FAGOCITOSIS

1. RESULTADOS DE APRENDIZAJE
a. Observar los diferentes tipos de transporte que se utilizan en la incorporación y liberación de
moléculas y el efecto de la concentración del medio sobre las células.
b. Observar el transporte vesicular de macrófagos en preparados histológicos fijos.

2. INTRODUCCIÓN
La célula posee un sistema complejo de membranas, cuya función general es el intercambio de
materiales entre la célula y el medio acuoso externo o fluido extracelular y entre los orgánulos y el
citoplasma de las células. Las membranas poseen la propiedad funcional de permeabilidad selectiva,
Esta propiedad le permite a la célula ser selectiva en el paso de las moléculas de agua y de solutos. La
permeabilidad se ve afectada por cambios de temperatura, solventes orgánicas y la composición
química del medio que rodea la célula, factores que afectan la velocidad de transporte de moléculas.
Los diferentes tipos de transporte que permiten el paso de las diversas sustancias de un espacio o
compartimento a otro y dependiente del tamaño de su molécula; pueden ser transporte a través de la
membrana y transporte en masa o vesicular. El transporte a través de la membrana a su vez se puede
clasificar en transporte pasivo (sin gasto de ATP y con velocidad de pasaje tope o máxima) y el
transporte activo (con gasto de ATP). El transporte en masa o vesicular, es un transporte activo que
requiere de energía y reorganización del citoesqueleto como de la membrana. Es un transporte que
también podemos clasificarlo en dos: endocitosis y exocitosis.
Entre los tipos de transporte pasivos podemos señalar: la difusión, la diálisis y la ósmosis.
La difusión es un proceso físico de gran importancia en el equilibro molecular de la célula con el
compartimento extracelular. La membrana plasmática celular permite la difusión de moléculas
hidrofóbicas, iones, aminoácidos, monosacáridos, etc., gracias a sus proteínas transportadoras, las
mismas que permiten el pasaje de los solutos a velocidades diferentes por la carga y el peso molecular
que presentan. En la célula se realiza difusión simple y la difusión facilitada, sin gasto de ATP y con
velocidad de pasaje siempre proporcional.
La diálisis: es un fenómeno físico en que los cristaloides son separados de las proteínas en virtud
de sus tasas diferenciales de difusión a través de una membrana semipermeable. Algunos autores
denominan diálisis a la difusión pasiva de sustancias a través de una membrana semipermeable
artificial, limitando la denominación de hemodiálisis al proceso físico vital realizado en vertebrados a
nivel de glomérulo renal en donde la sangre es depurada de sus sustancias de desecho conllevando a
la formación de un filtrado de cristaloides que después originarán la orina.
La ósmosis: es la difusión de agua a través de la membrana citoplasmática semipermeable como
respuesta a la diferencia de concentración salina entre la célula y su entorno. Movimiento de agua
(solvente) de una solución de concentración menor a una de concentración mayor. El ingreso de agua
a la célula se denomina endósmosis originando un aumento en el volumen celular (llamándose
hemólisis y turgencia en células animales y vegetales, respectivamente); el pasaje contrario es
exósmosis, induciendo la pérdida de volumen en la célula (crenación y plasmólisis en células animales
y vegetales, respectivamente.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

Si una membrana es permeable al soluto, provocará la lisis celular. La razón de ello es que el soluto
penetra por difusión al interior de la célula, provocando la entrada de agua y ruptura final de la
membrana. El tiempo que tarde en producirse la lisis será inversamente proporcional a la permeabilidad
de la membrana para el soluto en cuestión.
Cuando se suspenden hematíes en una solución hipotónica de cloruro sódico estos absorben agua,
se hinchan, adquieren una forma esférica y se hacen más frágiles produciendo una hemólisis.
La célula dispone de un mecanismo para incorporar grandes cantidades de moléculas extracelulares
de forma masiva: la endocitosis. Mediante endocitosis se incorporan moléculas extracelulares
englobadas por membrana plasmática, que luego quedan en el interior celular en forma de
vesículas. En función del tamaño y la naturaleza de las partículas ingeridas, la endocitosis puede ser
de dos tipos: pinocitosis y fagocitosis.
La fagocitosis es un mecanismo básico de defensa presente en la mayoría de las especies. En los
mamíferos está a cargo de células especializadas, principalmente los neutrófilos polimorfonucleares y
los macrófagos. Es un proceso mediante el cual las células especializadas buscan, localizan, identifican,
encapsulan, destruyen y remueven a los patógenos. Los macrófagos, que residen en tejido conectivo,
hígado, bazo, pulmones, o tracto astrointestinal, que circulan en la sangre, reconocen los patrones
moleculares en los patógenos a través de receptores de superficie celular. Estas células absorben a los
patógenos en membranas que los encierran internamente en vesículas, que son visibles al microscopio
óptico, denominadas fagosomas, y los degradan en el lisosoma

3. MATERIALES Y EQUIPOS.

Biológico Laboratorio Reactivos y soluciones

03 Buches de pollo * previamente Microscopio óptico Agua destilada
preparados Láminas y laminilla Fenolftaleína
01 Huevo * Embudo Solución de glucosa y almidón
20 grs de sal * Vasos de precipitación Solución salina (NaCl 0.6 y 1%)
Corte histológico de hígado Gradilla, Nitrato de plata - AgNO3
Pipetas de 5 mL Sulfato de Cobre - CuSO4
Hidróxido de sodio - NaOH
Reactivo de Fehling
Con (*) material a traer por el estudiante el día del TP.

4. PROCEDIMIENTO.
4.1 Transporte a través de la membrana
a) Difusión
1. Preparar previamente dos buches de pollo, uno de los extremos debe quedar abierto.
2. Luego llenar un buche con 10 ml de agua destilada y agregar 3 a 5 gotas de fenolftaleína,
amarrar la abertura libre con un hilo pabilo. Posteriormente, llenar un vaso de
precipitación con agua de caño, aproximadamente 300 ml y agregar 10 ml de NaOH.
Colocar en este vaso el buche que contiene fenolftaleína.
3. Al otro buche llenar con 10 ml de una suspensión de almidón, amarrar la abertura.
4. Llenar otro vaso de precipitación con aproximadamente 300 ml de agua de caño y agregar
10 gotas de lugol.
5. Observar el cambio de color del contenido de los buches y de las soluciones en las que
fueron colocadas
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

b) Diálisis
1. Dentro de un buche seco de ave, colocar 20 ml de solución de ovoalbúmina (5 ml de clara de
huevo + 15 ml de agua destilada), 5 ml de solución de NaCl y 5 ml de glucosa.
2. Introducir el buche dentro de un vaso de precipitación con 300 ml de agua destilada).
3. Dejar el sistema en reposo por 20 minutos.
4. Cumplido el tiempo retire el buche
5. Tomar del vaso de precipitación una muestra de 20 ml de agua y dividirlo en 3 tubos de ensayo.
6. Al tubo “A” con 10 ml provenientes de la muestra añadir 1ml de NaOH y 5 gotas de CuSO4
7. Al tubo “B” con 10 ml provenientes de la muestra añadir 5 gotas de AgNO3.
8. Al tubo “C” con 10 ml provenientes de la muestra, realice la prueba de fehling.

Diseño de vasos para demostrar difusión y diálisis

c) Ósmosis: Resistividad Osmótica de los Eritrocitos Humanos (ROE).

Se entiende por resistividad osmótica de los eritrocitos (ROE), a la medida de la capacidad de una
población de eritrocitos para resistir el efecto el efecto de soluciones hipotónicas.
La forma y el volumen de los eritrocitos cambian cuando varía la cantidad de agua contenida en su
interior, pudiendo tomar una forma estrellada o irregular al ocurrir pérdida de volumen (crenocito)
o bien aumentar su volumen hasta adquirir la forma de una esfera. Cuando la célula no puede
resistir la carga de agua que recibe, la membrana se rompe (hemólisis) y se libera la hemoglobina.
La prueba de ROE proporciona una indicación de la razón superifice/volumen de los eritrocitos y
refleja su capacidad para incorporar una cierta cantidad de agua antes de lisarse. La habilidad de
los eritrocitos normales para resistir la hipotonicidad proviene de su forma bicóncava, lo cual
permite que la célula aumente su volumen hasta un 70% antes de que la membrana se estire; una
vez superado este límite ocurre la lisis. La prueba de ROE ha sido ampliamente usada en el
diagnóstico de esferocitosis hereditaria.
Protocolo:
1. Se preparan soluciones de cloruro de sodio a distintas concentraciones. Se mezcla una solución
de NaCl al 1% con agua; según la tabla.
2. En cada tubo se agrega 0,2 mL de sangre. Se tapa los tubos con parafilm y se mezcla
correctamente (No agitar porque se puede hemolizar la sangre).
3. Deje reposar por 30 minutos en la gradilla a temperatura ambiente.
4. Vuelva a mezclar y centrifugan durante 10 minutos a2 000 rpm.
5. Proceda a medir la absorbancia en el espectrofotómetro. Retire los tubos con cuidado de la
gradilla y extraiga el sobrenadante con una pipeta pasteur y colóquela en la cubeta del
espectrofotómetro y realice la lectura a 540 nm.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

6. Reconoce los tubos en los cuales la hemólisis acaba de iniciarse, y aquellos donde ésta se
realizó hasta el final. El inicio de hemólisis se detecta por la coloración roja del líquido sobre el
precipitado en presencia de un sedimento de eritrocitos no bemolizados.
7. Utilizando una hoja de papel milimetrado, graficar; en el eje de ordenadas (Y) el porcentaje de
hemólisis y en el eje de las abscisas (X) la concentración de solución salina.
Indicar la concentración de NaCl cuando; se inició la hemólisis, ocurrió el 50% de hemólisis y
fue completa el 100% de hemólisis

El tubo N° 1 se usa como blanco. El tubo N° 12 corresponde al patrón 100%de hemólisis.

Anote en la tabla los valores de absorbancia obtenidas para cada uno de los sobrenadantes y
determine el porcentaje de hemólisis para cada uno de ellos empleando el tubo control (100%).

% hemólisis = absorbancia del problema x 100

absorbancia del 100% de hemólisis

NaCl al 1% Agua destilada Hemólisis

N° de tubo NaCl (%) Absorbancia
(ml) (ml) (%)
1 9.0 1.0 0.90 0%
2 8.0 2.0 0.80
3 7.0 3.0 0.70
4 6.0 4.0 0.60
5 5.5 4.5 0.55
6 5.0 5.0 0.50
7 4.5 5.5 0.45
8 4.0 6.0 0.40
9 3.0 7.0 0.30
10 2.0 8.0 0.20
11 1.0 9.0 0.10
12 0.0 10.0 0.00 100%

c) Filtración
En la filtración, la presión hidrostática proporciona el mecanismo para los movimientos a través
de una membrana en lugar del movimiento molecular. El agua y los solutos que atraviesan la
membrana se mueven simultáneamente en la misma dirección. Los solutos que son demasiado
grandes para atravesar la membrana permanecen en el lado original de la membrana. La
filtración se produce más rápidamente cuando aumentan las presiones hidrostáticas.
La filtración glomerular es el proceso que convierte la sangre sistémica en un filtrado, que
finalmente se convertirá en orina. Los procesos regulatorios complejos aseguran que solo las
sustancias apropiadas presentes en la sangre sistémica se excreten en la orina
Para demostrar la filtración, siga estos pasos
a. Coloque un embudo de vidrio en el anillo de un soporte anular sobre un vaso de
precipitado (beaker) vacío. Doble un trozo de papel de filtro por la mitad y luego otra vez
por la mitad. Abre un grosor del papel de filtro para formar un cono. Humedece el cono y
colócalo en el embudo. El papel de filtro se utiliza para demostrar cómo el movimiento a
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

través de las membranas está limitado por el tamaño de las moléculas, pero no representa
un modelo funcional de las membranas biológicas.
b. Prepara una mezcla de 5 cc de carbón vegetal en polvo (o pimienta negra molida) y
cantidades iguales de solución de glucosa al 1% y solución de almidón al 1% en un vaso de
precipitados. Vierta parte de la mezcla en el embudo hasta que casi alcance la parte
superior del cono de papel de filtro. Hay que tener cuidado para evitar que la mezcla se
derrame por encima del papel de filtro. Recoge el filtrado en el vaso de precipitados
situado debajo del embudo.
c. Comprueba la presencia de glucosa en el filtrado del beaker. Para ello, agregue 1 mL de
filtrado en un tubo de ensayo y añada 1 mL de solución de Fehling. Coloque el tubo en un
baño maría durante 2 minutos y espere que el líquido se enfríe lentamente. Si el color de
la solución cambia a amarillo, verde o rojo, la glucosa está presente.
d. Comprueba la presencia de almidón en el filtrado del beaker. Para ello, coloca unas gotas
de filtrado en un tubo de ensayo y añade una gota de solución yodada.S i el color de la
solución cambia a negro azulado, el almidón está presente.
e. Observe si hay carbón en el filtrado.

4.2 Transporte Vesicular. Endocitosis: Fagocitosis

Los leucocitos sanguíneos y las células fagocitarias de otros tejidos (histiocitos del tejido
conectivo, células de kupffer del hígado, osteoclastos del hueso, células de la microglia del
sistema nervioso), rodean y destruyen bacterias y otras sustancias extrañas, lo que constituye un
mecanismo de defensa vital para protegernos de la enfermedad. Los macrófagos se desarrollan
a partir de un tipo de glóbulo blanco denominado monocito. Los monocitos se convierten en
macrófagos cuando pasan del torrente sanguíneo a los tejidos. Los macrófagos permanecen
en los tejidos e ingieren las bacterias, las células extrañas y las células dañadas y muertas a
través de la fagocitosis.
La capacidad fagocítica de los macrófagos permite su identificación segura. Los macrófagos en
su periodo muy activo adquieren un diámetro de unos 20µm. A microscopía óptica, los
macrófagos con frecuencia muestran un citoplasma granular. La inyección in vivo de un colorante
vital, como el azul tripán, carmin litinado, azul pirrol o tinta china, tiñe selectivamente los
macrófagos porque estas células fagocitan estos colorantes y los almacenan en su citoplasma
bajo la forma de gránulos, visibles al microscopio óptico.
Observación de macrófagos
Corte de bola de edema. Coloración azul tripán
1. Observe al microscopio con objetivo de 40x y 100 x el preparado histológico.
2. Identifique los macrófagos que contienen en su interior el azul tripán. Esquematice.

Observación de células de Kupffer

Corte transversal de hígado. Coloración tinta china
1. Observe al microscopio el preparado histológico con objetivo de 40X y 100X.
2. Identifique las células de Von Kupffer que contienen en su interior la tinta china. Las células
de Kupffer o macrófago sinusoidal estrellado forman el revestimiento del sinusoide.
 BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

CUESTIONARIO

1. Defina los siguientes términos: asimetría, fluidez, semipermeabilidad

2. Describa los tipos de proteínas presentes en las membranas celulares. De tres ejemplos de cada una de
ellas.
3. Usted y un amigo están desayunando; mientras comen su amigo está leyendo el dorso de su caja de
cereales que contiene el siguiente texto: “El colesterol juega un rol benéfico en tu cuerpo, formando
membranas celulares, hormonas y tejidos”. Conociendo que usted está llevando biología celular y
molecular, ella la pregunta si el texto tiene sentido. ¿Qué usted le puede responder?
4. La bacteria E. coli transporta xilosa a través de la membrana celular vía un sistema simporte que usa la
energía libre de un gradiente protónico. El pH intracelular es más alto que el pH extracelular. a. Está la
xilosa moviéndose a favor o en contra de su gradiente de concentración?. Dentro o fuera de la célula?
b. Dibuje un diagrama del sistema de transporte de xilosa.
5. El O2 es una molécula que llega a todas las células de cualquier organismo, y es transportado por una
ferroproteína específica del interior del eritrocito llamada hemoglobina. ¿Qué mecanismo utiliza el O 2
disuelto en la sangre, para atravesar la membrana plasmática del eritrocito y unirse a la hemoglobina?
6. Nombre las cuatro clases de bombas dependientes de ATP que producen transporte activo de iones y
moléculas. Indique cuál de estas clases transporta iones y cuál las moléculas orgánicas pequeñas. El
descubrimiento inicial de una clase de esta bomba dependiente de ATP se usa en el tratamiento de
drogas quimioterapéuticas.
7. Ciertos fármacos ampliamente comercializadas actúan sobre bombas protónicas que inhiben la
secreción del ácido estomacal. ¿Qué tipo de bomba es inhibida por este tipo de droga y donde se
encuentra localizada?
8. Describe el proceso simport por el cual las células del epitelio intestinal importan glucosa. Cuál ion es
responsable del transporte, y que caracteres particulares facilitan el movimiento energéticamente
favorable de este ion a través de la membrana plasmática.
9. Si una persona toma una gran cantidad de agua en un corto tiempo sin consumir alguna sal, este puede
resultar en confusión, convulsiones, coma, o aún muerte, debido a funcionamiento anormal de células
nerviosas en el cerebro. Explique cómo estos problema resulta de tomar mucha agua tan rápidamente.
10. A Ericka, una estudiante de enfermería, se le pide que administre por terapia intravenosa (IV) 10 ml de
una preparación isotónica. Por equivocación ella inyecta a su paciente 10 ml de agua pura. ¿Qué le
pasará a las células sanguíneas en el área cerca de la inyección?.

Bibliografía
Becker W. Hardin J. Kleinsmith L. El Mundo de la Célula. Capítulo 8: Transporte a través de membrana: saltando la
barrera de permeabilidad. 6ª ed. Editorial Pearson Prentice Hall. 2007.
Cooper G. La Célula. 6° ed. Cápitulo 13: Membrana Plasmática. Editorial Marbán. 2014:794p.
Karp G. Biología Celular y Molecular. Conceptos y Experimentos. Cápitulo 8: Sistemas de la membrana
citoplásmica: estructura, función y tráfico de membrana. 6ª ed. México: Editorial Mc Graw-Hill, 2011: 899p
Lodish H., et. al. Biología Celular y Molecular. 5ª. ed. Cápitulo 7: Transporte de iones y pequeñas moléculas a través
de las membranas celulares. Madrid: Editorial Médica Panamericana S.A., 2005.
Megias M. et al. 2017. Membrana celular.
https://atlashistologia.webs7.uvigo.es/pdfs-descargas/atlas-celula-03-membrana-celular.pdf
Romer et al. Membrana Plasmática. http://genomasur.com/lecturas/Guia04.htm