TP Nº 1: “Introducción a las técnicas de microbiología básica:

Obtención de cultivos”

Índice

Objetivo del práctico..........................................................................................................3

Material y Reactivos necesarios........................................................................................3
Desarrollo teórico del tema...............................................................................................4
Bacterias..................................................................................................................................4
Introducción a la microbiología............................................................................................................4
Morfología y agrupación bacteriana...................................................................................................4
Crecimiento microbiano.......................................................................................................................5
Fases de crecimiento............................................................................................................................5
Cultivo de microorganismos.................................................................................................................5
Recuento en medio sólido....................................................................................................................7
Clasificación de los microorganismos según las temperaturas...........................................................7
Clasificación de los microorganismos según la necesidad de oxigeno................................................8
Bacterias analizadas.............................................................................................................................8
Hongos.....................................................................................................................................8
Técnica operatoria.............................................................................................................9
Preparado de PCA....................................................................................................................9
Preparado de Sabourau.........................................................................................................10
Esterilización de material de vidrio........................................................................................10
Esterilización de peptona y medios de cultivo en autoclave...................................................10
Obtención de medios de cultivo......................................................................................12
Características macroscópicas de las colonias observadas.............................................13
Características microscópicas de las colonias.................................................................16
Actividades......................................................................................................................18
Conclusión........................................................................................................................20
Bibliografía......................................................................................................................20
 Trabajo Práctico nro. 1:

“Introducción a las técnicas de microbiología básicas: Obtención de

cultivos”

Objetivo del práctico

 Comprender que los microorganismos viven en poblaciones

 Comprender la necesidad de la preparación de materiales estériles y de
trabajar en condiciones de asepsia.
 Entender y manejar técnicas básicas que permitan obtener un cultivo
 Diferenciar y manejar las técnicas de tinción para los distintos
microorganismos.

Material y Reactivos necesarios

 A continuación se enumerará los materiales y cultivos que se utilizan en la

totalidad del trabajo práctico, con cantidades suficientes para todas las
comisiones y cursos.

BMA fosas
Total Total
BMA BMAE BMAS nasales y
necesario estimativo
garganta
0,1 de
- - 2ml - 22 ml 50 ml
peptona
Caja de
2 2 2 2 88 ml 100 ml
petri
2 (de 1
Pipeta - - - 22 (de 1 ml) 25
ml)
Hisopo - - 2 2 44 50
Sabouraud 15 - - - 165 ml 200 ml
PCA 15 30 30 30 1115 ml 1300 ml
Tubo de
2 2 4 4 132 150
ensayo
1 por
Erlenmeyer 3 3
curso
*BMA: Bacterias Mesófilas Aerobias
BMAE: Bacterias Mesófilas Aerobias Esporuladas
BMAS: Bacterias Mesófilas Aerobias de Superficie
Desarrollo teórico del tema

Introducción a la microbiología
La microbiología es una rama de la biología que estudia seres vivientes de tamaño
microscópico que existen como células aisladas o asociadas y también incluye el
estudio de virus (microscópicos no celulares). En general, los microorganismos a
diferencia de los macroorganismos, son capaces de llevar a cabo procesos de
crecimiento, generación de energía y reproducción, independientemente de otras
células sean del mismo tipo o diferentes.
Las células estudiadas en microbiología pueden pertenecer a dos grandes grupos,
eucariotas y procariotas. Las eucariotas constituyen la unidad estructural de
protozoarios, hongos y algas cuyo tamaño las incluye en esta especialidad. Son
organismos unicelulares o multicelulares que poseen en su interior estructuras
limitadas por membranas llamadas organelas (núcleo, mitocondrias y cloroplastos
presentes sólo en células capaces de realizar fotosíntesis).
Las células procariotas son las bacterias, cuya estructura interna es sencilla.

 Bacterias

Morfología y agrupación bacteriana

Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión binaria,
conocida también como bipartición. Su tamaño, por lo general es menor que el de una
célula eucariota típica (por ej. Escherichia coli 0,5 × 2 µm). Sin embargo, existe un
amplio rango de tamaños según las especies que puede variar desde 0,2 µm de
diámetro como en el caso de los micoplasmas hasta 40 µm como en la Beggiatoa
gigantea.
La rigidez de la pared celular determina la morfología de una célula bacteriana.
Los principales tipos de formas que presentan las bacterias son: esférica, bastón
alargado o espiral. Las bacterias de forma esférica se denominan cocos (redondeados,
ovoides o elípticos); las de forma de bastón alargado se denominan bacilos
(cilíndricos, fusiformes, etc.) y las de forma de bastón curvado se denominan espirilos.
Aquellas bacterias cuya imagen proyectada sobre el plano tienen forma de coma, se
llaman vibrios. Otras formas que pueden presentar las bacterias son filamentosa
(ramificada o no), anillos y también estructuras con prolongaciones

Cocos Bacilos Espirilos

Las células bacterianas, observadas al microscopio, pueden aparecer como células

aisladas o agrupadas. Las agrupaciones de dos células de formas cocoides se
denominan diplococos. El o los planos en los cuales tiene lugar la división celular,
determina la disposición característica de especie. Así, si existe un solo plano de
división se originan cadenas, por ej. Streptococcus (cocos en cadena). Cuando la
bipartición tiene lugar en dos planos perpendiculares, se originan tétradas, por ej.
Pediococcus. La división en tres o más planos ortogonales origina paquetes de 8
células o más, por ej. Sarcina. Finalmente si ocurre fisión binaria en planos no
perpendiculares se observa disposición de racimos irregulares, por ejemplo
Staphylococcus. Los bacilos pueden presentar otras disposiciones: en empalizada (por
giros de 180º), en forma de letra V o L (dos bacilos en posición angular) y varios
bacilos que forman letras chinas.

Crecimiento microbiano
El crecimiento celular se define como el aumento ordenado de todos los componentes
químicos que llevan a un incremento de los constituyentes y estructuras celulares.
Los nutrientes, a partir de los cuales los microorganismos sintetizan sus principales
biomoléculas y obtienen su energía, están disueltos en agua, razón por la cual el
crecimiento celular depende de la disponibilidad de agua. Las distintas especies
bacterianas tienen diferentes requerimientos nutricionales (a veces específicos) y
condiciones fisicoquímicas que les permiten permanecer viables. Los nutrientes
requeridos en grandes cantidades son denominados macronutrientes mientras que los
micronutrientes son necesarios en cantidades trazas.
La nutrición es el proceso por el cual los seres vivos toman, del medio donde habitan,
los nutrientes que necesitan para crecer.
El crecimiento de una población tiene lugar en forma exponencial. Una célula se divide
en dos células hijas y luego éstas se dividen a su vez en dos nuevas células, o sea
que en cada período de división, la población se duplica por lo que la multiplicación
corresponde a una progresión geométrica.

Fases de crecimiento
Al inicio del crecimiento, los microorganismos requieren un período de adaptación al
nuevo ambiente. Esta es la fase de latencia o fase lag. En ella, las células sintetizan
enzimas involucradas en el metabolismo de los nutrientes disponibles y se incrementa
la síntesis de macromoléculas como RNA y proteínas.
En la fase logarítmica o fase exponencial, las células se dividen regularmente según el
tiempo de generación de cada especie.
En esta fase, y en condiciones apropiadas, la velocidad de crecimiento es constante y
máxima y la población total es casi uniforme en lo que se refiere a composición
química de las células, actividad metabólica y otros caracteres fisiológicos. Las células
son viables y su tamaño constante.
Como consecuencia del agotamiento de nutrientes o la acumulación de productos
tóxicos del metabolismo, disminuye la velocidad de crecimiento hasta que llega a
detenerse. En este punto, se dice que el cultivo está en fase estacionaria. La transición
entre la fase log y estacionaria, implica una etapa de crecimiento
Desequilibrado durante el cual los componentes celulares son sintetizados a diferentes
velocidades. En consecuencia, las células en fase estacionaria tienen una
composición química diferente a la de las células en fase exponencial. El número de
células viables permanece constante, porque mientras algunas de ellas se dividen,
otras mueren
Si la incubación del cultivo se prolonga varias horas después que la población ha
alcanzado la fase estacionaria, las células alcanzarán la fase de muerte, donde el
número de células vivas decrece con el tiempo en progresión geométrica. La velocidad
de muerte y la duración de esta fase varían en las distintas especies bacterianas.

Cultivo de microorganismos
El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos
en el laboratorio. En general, como se ha mencionado, todos los microorganismos
tienen requerimientos de macro y micronutrientes semejantes, aunque la forma en que
cada uno de ellos es captado y su cantidad relativa pueden variar mucho entre los
diferentes géneros. En el laboratorio, el desarrollo de los microorganismos se realiza
en medios de cultivos que son ambientes artificiales diseñados por el hombre para
proporcionar todas las sustancias necesarias para el crecimiento microbiano.
Los medios de cultivo se clasifican en:

1) Sintéticos o definidos: Contienen concentraciones conocidas de sustancias

químicas puras, de naturaleza orgánica y/o inorgánica. La composición de un medio
sintético depende del microorganismo que se quiera cultivar; así un medio definido
para una bacteria con gran capacidad biosintética será más simple que el de otra
bacteria con menor posibilidad de biosíntesis.

2) Complejos o indefinidos: Están constituidos por ingredientes de alta calidad

nutricional, pero de composición química desconocida ya que son el producto
resultante de infusiones y extractos de sustancias naturales complejas. Se usan
digeridos crudos de caseína (proteína de leche), hígado, levadura, carne, soja, sangre,
etc. Sin embargo, con ellos no se tiene un control nutricional preciso.

Según la finalidad para la cual fueron formulados, los medios de cultivo se pueden
clasificar en:

1) Enriquecidos: Son medios complejos o sintéticos con aditivos adicionales para

favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente
heterótrofos exigentes). Se adicionan al medio de cultivo sustancias nutritivas tales
como azúcares, sangre, suero, extractos de tejidos de animales y plantas.
2) Selectivos: Son aquellos que permiten por su diseño el crecimiento específico de un
determinado microorganismo o grupo de microorganismos e impiden mayoritariamente
el desarrollo de los demás. Estos medios son de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de poblaciones microbianas mixtas. Se incorporan ciertas
sustancias que otorgan la selectividad buscada al medio.
3) Diferenciales: Son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos
de bacterias en función de su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del
medio. Ese comportamiento diferencial se traduce normalmente en un viraje de color
de una sustancia indicadora presente en el medio. Poseen en su composición un
reactivo o sustancia química que al combinarse con algún producto del metabolismo
origina una coloración característica.
4) Selectivos-Diferenciales: Representan una combinación de los dos últimos medios.
Permiten el desarrollo de una bacteria o un tipo bacteriano y al mismo tiempo
producen una coloración característica del organismo en estudio.
5) Electivos: Favorecen el desarrollo de una especie bacteriana y las restantes crecen
poco y lentamente.

Cualquiera sea el tipo de medio, se pueden preparar para ser usados en estado
líquido, sólido o semisólido. Los medios de cultivo líquidos se conocen como caldos y
a partir de ellos, por el agregado de un agente solidificante estable (agar), se preparan
medios de consistencia sólida o semisólida, que se denominan medios sólidos o
agarizados. El gelificante más usado es el agar-agar en una concentración de 1,5-2%
y 0,7% para el sólido y semisólido respectivamente. Presenta la gran ventaja que no
funde hasta cerca de los 70º C, lo que permite su uso para la mayoría de las bacterias
y además son muy pocos los microorganismos que lo hidrolizan (agarolíticos) como
ocurre con la gelatina.
Un medio de cultivo líquido generalmente se fracciona en tubos tapa rosca o en
matraces cónicos con tapón de algodón y el desarrollo de los microorganismos se
observa macroscópicamente por enturbiamiento del medio. Los medios sólidos se
disponen en cajas de Petri de vidrio o plástico con tapa, donde cada célula microbiana
por divisiones sucesivas da origen a masas visibles denominadas colonias. Este hecho
es el que permite cuantificar los microorganismos presentes en muestras, a partir de
las cuales se realizan diluciones, siembras e incubaciones, basándose en la premisa
que cada colonia se origina de una célula.
El medio de cultivo requiere una esterilización, inmediatamente después de su
preparación, para eliminar los microorganismos contaminantes; esto se hace
normalmente por calor húmedo a menos que en su composición, el medio contenga
sustancias termolábiles. Su manipulación posterior, para mantener las condiciones de
asepsia, requiere ciertas precauciones, por ejemplo trabajar en flujos laminares o
cerca de llama de mecheros. La transferencia de un cultivo desde un recipiente a otro
se lleva a cabo con pipeta estéril o con ansa o aguja previamente esterilizadas por
incineración a la llama.

Los medios de cultivos agarizados son utilizados para el aislamiento microbiano a

partir de muestras donde coexisten diferentes poblaciones, las que posteriormente se
siembran en medios de cultivos líquidos adecuados para obtener un crecimiento
máximo. Tanto en los medios artificiales de laboratorio como en el ambiente natural, la
nutrición de la célula lleva inicialmente a un aumento de tamaño y peso que precede a
la división celular. En la mayoría de los microorganismos, el crecimiento continúa
hasta que la célula se divide en dos células hijas mediante el proceso de fisión binaria,
el cual conduce al crecimiento de las poblaciones. Es difícil estudiar el crecimiento de
la célula individual, especialmente en los microorganismos, debido a que los métodos
analíticos no son los suficientemente sensibles como para ser aplicados a estructuras
tan pequeñas. Es por esto que habitualmente para evaluar el crecimiento se analiza el
aumento de la población microbiana.

Recuento en medio sólido

El recuento de colonias es la forma más práctica para distinguir células viables y no
viables en una suspensión bacteriana. Cada bacteria viable da lugar a la formación de
una colonia después de la incubación en un medio agarizado apropiado. Se diluye la
muestra, se toma un volumen determinado y se siembra en un medio agarizado
contenido en cajas de Petri. Se incuba y una vez desarrollado el cultivo, se cuenta el
número de colonias expresándose el resultado como UFC mL-1 (unidades formadoras
de colonia por mL).

Clasificación de los microorganismos según las temperaturas

5-15 30-45 35-47

Clasificación de los microorganismos según la necesidad de oxigeno

a) Aerobios estrictos: necesitan oxígeno para crecer, no se multiplican en

ausencia de oxígeno.
b) Microaerófilos: requieren presiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (2 a
10% de O2, en lugar de 20%).
 c) Anaerobios facultativos: pueden realizar metabolismo energético aerobio
(respiración aerobia) o anaerobio (respiración anaerobia y fermentación),
dependiendo del ambiente, la disponibilidad de oxígeno y la concentración de
nutrientes.
d) Anaerobios estrictos: son aquellos para los cuales el oxígeno resulta tóxico.

Bacterias analizadas

Bacterias mesófilas aerobias

Se multiplican en aerobiosis y tienen una temperatura de incubación entre los 20 y los
37°C, además pueden ser patógenas o saprofitas.
Recuentos altos en alimentos estables que a menudo indican materias primas
contaminadas o tratamientos no satisfactorios desde el punto de vista sanitario.

Bacterias esporígenas aerobias mesófilas

Son bacterias que necesitan de oxígeno para desarrollarse y viven a un temperatura
entre 30 a 45ºC. Tienen la capacidad de concentrar su ADN en su interior y
encapsularlo en una membrana, la cual van a expulsar al exterior ante la modificación
de cualquiera de sus condiciones optimas (temperatura, pH, concentración salina,
actividad acuosa, etc.), para que viva en un estado vegetativo (resista) hasta que las
condiciones sean favorable para que germine y se forme como célula nuevamente.

 Hongos

Los hongos son un reino de seres vivos unicelulares o pluricelulares que no forman
tejidos y cuyas células se agrupan formando un cuerpo filamentoso muy ramificado.
El conjunto de filamentos de un hongo se llama micelio, y cada filamento se denomina
hifa.
Los hongos tienen alimentación heterótrofa y digestión externa, vierten al exterior
enzimas digestivas, (sustancias proteicas que actúan sobre los alimentos dividiéndolos
en moléculas sencillas) y micotoxinas.
Según su tipo de vida, los hongos pueden ser saprofitos, parásitos y simbiontes. Los
hongos saprofitos, como el champiñón o la trufa, se alimentan de sustancias en
descomposición. Los hongos parásitos se alimentan de los líquidos internos de otros
seres vivos. Los hongos simbiontes se asocian con otros organismos y se benefician
mutuamente; viven en lugares húmedos, con abundante materia orgánica en
descomposición y ocultos a la luz del sol y también pueden habitar medios acuáticos o
vivir en el interior de ciertos seres vivos parasitándolos.
Su reproducción puede ser asexual, por esporas, y sexual. Las hifas haploides
pueden dar lugar por mitosis, es decir, asexualmente, a unas esporas llamadas
conidios o conidiosporas. Las hifas diploides resultantes de la unión de dos hifas
haploides pueden dar lugar, por reproducción sexual, a esporas en unas estructuras
tipo asca o tipo basidio. Hay dos clases de hifas: hifas cenocíticas, sin tabiques de
separación entre células, e hifas tabicadas, con ellos.
Los hongos se presentan bajo dos formas principales: hongos filamentosos
(antiguamente llamados "mohos") y hongos levaduriformes o levaduras
(microorganismos unicelulares, de forma casi esférica).
Las levaduras crecen más rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a
ellos. Mientras que los mohos son casi siempre aerobios estrictos, las levaduras
generalmente crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, aunque con
mayor rapidez y hasta poblaciones más elevadas en presencia de este gas. La
fermentación causada por levaduras es completamente un proceso anaeróbico.
Hongos Levaduras
Técnica operatoria

Se comienza en primera instancia por la división de tareas para la preparación de

materiales y cultivos. De las cuatro comisiones, cada una tiene una tarea específica.
Dichas tareas consisten en preparar los medios de cultivos, PCA y Sabourau; lavar y
preparar para su esterilización los tubos de ensayo, cajas de petri, pipetas, hisopos y
erlenmeyers. Es importante destacar, que la esterilización del material de vidrio se
efectúa en la estufa de esterilización y la esterilización de la peptona y los medios de
cultivo en el autoclave.

Preparado de PCA
En primer lugar se disuelve el PCA en 1300 ml de agua destilada, en baño María
hirviendo. Esto se deja un determinado tiempo, hasta que el PCA se encuentre
completamente líquido y no se diferencien distintas capas, es decir obtener un PCA
líquido y homogéneo.
Dado a que el PCA solidifica a 60ºC, el fraccionamiento se realiza en caliente,
mediante un embudo de calefacción, controlando con un termómetro que la
temperatura del baño de agua caliente alrededor del embudo sea superior a 70ºC para
no ocasionar taponamientos por la solidificación del PCA.
Para proceder al fraccionamiento en los tubos de ensayo, se debe usar uno o dos
como guía, es decir, mediante el empleo de una pipeta se toman 15 ml de agua, se
vuelcan en un tubo de ensayo y se realiza una marca donde se produce el aforo. De
esta manera nos aseguramos que todos los tubos de ensayo contengan la misma
cantidad de PCA (15ml).
El fraccionamiento se realiza transvasando el PCA al tubo con la marca de los 15 ml, y
de este se pasa rápidamente a otro tubo de ensayo limpio. De esta forma se procede
hasta fraccionar los 1300 ml de PCA. En caso que la temperatura del baño del
embudo comience a descender, se sede arrimar la llama de un mechero para
nuevamente aumentar la temperatura.
Una vez listo todos los tubos de ensayo con PCA, se los coloca en un recipiente con
su respectiva etiqueta que indica de que se trata y se lleva a esterilización en el
autoclave.

Preparado de Sabourau
El procedimiento en este caso es similar al PCA, pero en este caso se preparan solo
200 ml del medio, disolviendo el Sabourau en agua destilada en un baño María. El
fraccionamiento también se realiza en caliente para evitar que solidifique el medio, y
mediante el empleo de un embudo de calefacción. Se utiliza un tubo de ensayo guía
para procurar que todos los tubos de ensayo contengan 15 ml.
Una vez fraccionados los 200 ml de Sabourau en los distintos tubos de ensayo, se los
coloca en un recipiente y se los esteriliza en el autoclave.

Esterilización de material de vidrio

El material de vidrio se esteriliza en la estufa de esterilización a 165 ºC. Se debe
realizar en forma conveniente una cubierta con papel de diario al material de vidrio
previamente lavado y desengrasado. Una vez listos se colocan en la estufa de
esterilización durante 3 hs.

Esterilización de peptona y medios de cultivo en autoclave

El autoclave es un instrumento metálico formado por dos cilindros concéntricos (uno
dentro del otro) que esteriliza con vapor a presión, compuesto de:
Se puede utilizar para trabajos con vapor seco o vapor húmedo y tiene una serie de
pasos a seguir para su utilización:

Lo primero que se hace es colocar agua dentro del autoclave, de manera que el agua
llegue al nivel inferior del trípode donde se pondrán los elementos a esterilizar, luego
se procede a cerrar la tapa, sin trabar, y se prende el calentador para que el agua
comience a calentarse.
Una vez el agua esté caliente, se colocan los elementos sobre el trípode y este se
introduce dentro del autoclave, paso siguiente se cierra la tapa del autoclave y se
traba. Es entonces donde, por medio de la temperatura, se comienza a generar el
vapor, el cual se va a controlar con una manguera que va a salir del caño de la válvula
de descarga (espita), que va a estar abierta. En el caso de que se trabaje con vapor
seco, dicha manguera se va a introducir en un recipiente con agua, y cuando la salida
del vapor haga un burbujeo con sonido metálico, tendremos la certeza de que el vapor
es seco.
Luego se cerrará la espita (válvula) para que dentro del autoclave empiece a subir la
presión, generada por el incremento de vapor seco, la cual se va a controlar por medio
del manómetro ubicado sobre la tapa, teniendo en cuenta que siempre debe estar
rondando en una 1 atm por sobre la presión atmosférica, de lo contrario se tiene que
regular el calentador, aumentando o disminuyendo la llama (aporte de calor). La
esterilización se va a realizar durante 20 minutos contando a partir desde que el
autoclave llegue a 1 atm. de presión relativa, luego se apaga el calentador, se deja
enfriar un tiempo el autoclave y se procede a abrir la tapa y retirar el material
esterilizado.

Una vez esterilizados todos los materiales necesarios, se procede a preparar las cajas
de petri con los cultivos donde posteriormente serán sembrados los microorganismos
ya sean hongos o bacterias. Para esto, primero se debe rotular las cajas de petri,
indicando comisión, curso, y tipo de bacteria que será cultivada en dicho medio.
Para transvasar el medio de cultivo presente en los tubos de ensayo, a las cajas de
petri se debe trabajar en condiciones de esterilidad, en las proximidades de uno o dos
mecheros, para evitar contaminación por contacto con la atmosfera al realizar la
operación.
Procurar termostatizar los medios de cultivo un tiempo antes de efectuar el transvaso,
dado a que se encuentran a una muy elevada temperatura y si se realiza la operación
de pasar el medio de cultivo a muy elevadas temperaturas a la caja de petri con una
temperatura inferior se produciría un choque térmico, con la consiguiente
evaporización y condensación del agua en la tapa de la caja de petri, afectando las
condiciones del medio de cultivo.
Una vez el medio de cultivo solidificado en la caja de petri, se lo debe colocar en la
estufa de cultivo, para corroborar que realmente sea un medio estéril, en caso
contrario, desarrollaría algún tipo de colonia. Luego es posible realizar las distintas
etapas para obtener desarrollos de cultivos con bacterias mesófilas aerobias, hongos
del ambiente, bacterias mesófilas aerobias esporuladas, bacterias mesófilas aerobias
de superficie y bacterias mesófilas aerobias de fosas nasales y garganta.
Es necesario aclarar que en los casos que la siembra sea en profundidad, el medio
termostatizado será transvasado a la caja de petri luego de colocar la muestra.

Obtención de medios de cultivo

I) Obtención de cultivos de bacterias mesófilas aerobias y hongos del ambiente

a) Bacterias mesófilas aerobias
1. Rotular las cajas Petri adecuadamente.
2. En asepsia fraccionar 15 ml de medio Agar Plate Count (APC) estéril
atemperado en cada caja de Petri, homogeinizar.
3. Dejar que solidifique el medio.
4. Abrir las placas en distintos ambientes de la escuela (una comisión en el
laboratorio) un tiempo de 15 minutos. Cerrar.
5. Llevar a estufa de incubación a 37°C durante 24-48 horas.
6. Observar características morfológicas e informar.
b) Hongos
Realizar lo mismo que en el inciso a, pero utilizando el medio Sabouroud y las
condiciones de incubación de 25ºC durante 3 a 5 días.

II) Obtención de cultivos de bacterias esporígenas aerobias mesófilas de tierra

1. En asepsia preparar una suspensión de 10 gramos de tierra en 100 ml de agua
estéril.
2. Calentar a baño María 15 minutos a 80°C, enfriar inmediatamente.
3. Rotular las cajas Petri adecuadamente.
4. Sembrar en condiciones de asepsia por duplicado las placas en profundidad,
para esto colocar 1ml de la muestra con pipeta estéril y luego verter en cada
una de las placas 15 ml del medio Agar Plate Count (PCA) atemperado.
5. Llevar a estufa de incubación a 37°C durante 24-48 horas.
6. Observar características morfológicas e informar.

III) Obtención de cultivos de bacterias aerobias mesófilas de superficies vivas

(manos) sucias y limpias
1. Preparar dos tubos de ensayo conteniendo cada uno 1 ml de solución de
peptona al 0,1 %p/v y colocar en cada uno un hisopo. Cerrar, rotular y
esterilizar.
2. En condiciones de asepsia escurrir el hisopo en las paredes del tubo y
proceder a frotar la mano sin lavar (sucia) recorriendo bien toda la superficie de
la misma y las uñas.
 3. Luego en condiciones de asepsia colocar el hisopo dentro del tubo y
homogenizar.
4. Sembrar en condiciones de asepsia la placa en profundidad, para esto colocar
1ml contenido en el tubo y luego verter 15 ml del medio PCA termostatizado.
5. Llevar a estufa de incubación a 37°C durante 24-48 horas.
6. Observar características morfológicas e informar.
7. Realizar el mismo procedimiento pero con las manos lavadas con jabón
bactericida y secadas con toallas descartables.

IV) Obtención de cultivos de bacterias aerobias mesófilas de fosas nasales y

garganta
1. Rotular las cajas Petri adecuadamente.
2. En asepsia fraccionar 15 ml de medio PCA estéril en cada caja de Petri,
homogenizar.
3. Dejar que solidifique el medio.
4. Abrir la placa en condiciones de asepsia y tomar una muestra con hisopo estéril de
fosas nasales o garganta y realizar un estriado sobre la misma.
5. Llevar a estufa de incubación a 37°C durante 24-48 horas.
6. Observar características morfológicas e informar.

Características macroscópicas de las colonias observadas

Bacterias mesófilas aerobias

Clasificación:
- Color: blanco
- Tamaño: 5 mm
- Estructura interna: circular
- Elevación: convexa
- Borde: entero
- Olor: -

Hongos
Clasificación:
- Color: marrón- verdoso
- Tamaño: entre 1 a 2 cm.
- Estructura interna: Extremadamente granular, pliegues rugosos irregulares.
- Elevación: scopulariopsis

Scopulariopsis

- Borde: Blanco
- Olor: fuerte, a humedad.

Bacterias esporígenas aerobias mesófilas de tierra

Clasificación:
- Color: marrón, anaranjado
- Tamaño: 1 cm
- Estructura interna: circular
- Elevación: aplanada
- Borde: ondulada
- Olor: Si

Bacterias aerobias mesófilas de superficies vivas (manos sucias)

 Clasificación:
- Color: amarillo, traslúcido
- Tamaño: 5 mm
- Estructura interna: puntiforme
-

Elevación: aplanada
- Borde: entero
- Olor: -

Bacterias aerobias mesófilas de garganta

Clasificación:
- Color: blanco, traslúcido
- Tamaño: 5 mm
- Estructura interna: puntiforme
- Elevación: aplanada
- Borde: entero
- Olor: -

Cabe resaltar que el único cultivo que desarrolló en sus condiciones óptimas fue el de
los hongos, los demás estuvieron sometidos a temperaturas que rondaron los 50ºC
por un problema sufrido en el laboratorio, de ahí la deshidratación de los medios y el
poco desarrollo de las colonias, y por ende, su difícil identificación a simple vista.

Características microscópicas de las colônias

Bacterias mesofilas aerobias esporuladas (tierra)

 Streptococos y bacilos gram (-)

Bacterias mesofilas aerobias (ambiente)

Bacilos esporulados gram (-)

Bacterias mesofilas aerobias de superficies vivas

Bacilos gram (-)

Bacterias mesofilas aerobias garganta
Stafilococos (gram+)

Hongos del ambiente

Aspergillus
Actividades

1) Indique las diferencias que se observan desde el punto de vista microscópico y

macroscópico:
- entre los hongos y las bacterias
- entre las levaduras y los mohos.
2) En cuál de los tipos de microorganismos vistos le parece a Ud. que es relevante
para su identificación la observación microscópica. Justifique su respuesta.
3) Explique por qué en el cultivo de la tierra se observan solamente bacterias
esporígenas mesófilas.
4) Informe los cálculos realizados para la preparación de los medios de cultivo
utilizados por comisión.
5) Explique el motivo de utilización de los diferentes medios de cultivo en el TP.
6) a) A través de que técnica puede cuantificar los microorganismos para el medio
ambiente y las superfícies vivas?. Explique.
b) Podría hacer lo mismo del inciso anterior para el cultivo de microorganismos de
fosas nasales o garganta?. Explique.

1- A nivel macroscópico las diferencias son muy notables debido al problema que se
tuvo con la temperatura de la estufa de cultivo, por tal razón los hongos se
desarrollaron de excelente manera, mientras que los cultivos de bacterias sufrieron, en
su mayoría, una deshidratación a tal punto que muchas no pudieron desarrollarse.
Las bacterias forman colonias en formas punteadas o circulares, colonias elevadas,
convexas e incluso planas, con bordes lisos, ondulados o lobulados y de diferentes
colores. En cambio, en el caso de los hongos, las colonias presentan características
muy diferentes, tienen formas filamentosas, rizoides e irregulares, con elevaciones
umbilicadas y algodonosas, de bordes filamentosos o estriados y colores muy
variados, normalmente son opacos.
A nivel microscópico las bacterias tienden a presentarse como cocos, bacilos o
espirilos, pudiendo agruparse como estreptos, estáfilos o diplos. Son las bacterias las
que necesitan de la coloración por ser las más pequeñas, usándose el objetivo de
inmersión.
Los hongos en cambio, no necesitan coloración y se presentan en muchas figuras,
fácil, siendo fácilmente observadas sus hifas con un objetivo de 40x.

2- Es relevante el uso del microscopio para la identificación de bacterias debido a su

pequeño tamaño, por lo que se hace inevitable su coloración. A los hongos no es
necesarios observarlos por este medio ya que pueden ser identificados a simple vista.

3- En el cultivo de tierra se observan solamente bacterias esporígenas debido a que

esto era lo que queríamos identificar. Esto se consiguió calentando la solución de
tierra y haciendo descender rápidamente la temperatura, inhibiendo así a las bacterias
no esporuladas y formando los esporos.

4- Tabla de cálculos realizados.

5- Se utilizaron dos medios de cultivo diferente debido a que se quería observar el

desarrollo de dos cosas diferentes: bacterias y hongos, el Ágar Plate Count (APC) es
favorable para el desarrollo de todo tipo de bacterias y el Sabouroud para el de
hongos.

6- a) A través de la técnica de aislamiento por estrías se puede cuantificar los

microorganismos para el medio ambiente y las superficies vivas, debido a que es un
medio rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un
medio de cultivo. El objetivo de esto es obtener, a partir de un elevado número de
microorganismos, un número reducido de ellos distribuidos individualmente sobre la
superficie de la placa y originando cada uno una colonia.
b) No, para el cultivo de microorganismos de fosas nasales o garganta se utiliza la
técnica de aislamiento previo enriquecimiento, usando un medio de cultivo líquido
(caldo de enriquecimiento) que favorezca el desarrollo del organismo que queremos
aislar. Se inocula el caldo con una muestra del material que contiene el
microorganismo, se proporcionan las condiciones apropiadas de aireación,
temperatura y ph y se incuba durante un determinado tiempo.
Conclusión
En primer lugar, es necesario hacer mención de que dado a circunstancias fuera del
alcance de los alumnos que trabajaron en el práctico, se produjo un aumento excesivo
de temperatura en la estufa de cultivo, en el momento en que estos se encontraban en
pleno desarrollo microbiano. Por este motivo, dos de los cultivos fueron desechados, el
que contenía bacterias mesófilas aerobias de fosas nasales y el que contenía
bacterias mesófilas aerobias de superficie vivas (manos limpias). Los demás cultivos
pudieron ser utilizados para observación dado a que no se encontraban del todo
deteriorados por el aumento de temperatura del medio.
Este hecho impidió que se realizase una comparación, entre el desarrollo microbiano
en las manos sucias y limpias, así como su observación.
Tampoco fue posible observar las colonias de bacterias de fosas nasales.
Las bacterias que no fueron alteradas, se pudieron observar con gran defenicion en el
microscopio, y los resultados obtenidos fueron: las bacterias mesófilas aerobias
esporuladas son Streptococos y bacilos gram (-); para la obtención de bacterias
esporuladas se tomo muestra de tierra, ya que este medio es la principal fuente de
este tipo de bacterias. Las bacterias mesófilas aerobias del ambiente son bacilos
esporulados gram (-); estas bacterias fueron cultivadas del ambiente de la cocina de la
cantina de la EIS, donde el medio de cultivo expuesto al ambiente durante 15 minutos.
Las bacterias mesófilas aerobias de superficies vivas son bacilos gram (-); dichas
bacterias provenientes de manos sucias. Y las bacterias mesófilas aerobias de
garganta son stafilococos gram (+).
En cuanto a los hongos, es posible realizar un reconocimiento a simple vista, y
también microscópicamente.

Bibliografía

- Apuntes “EIS – MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL”. Ing. Marcelo Gallini – Mg.

Ing. Griselda Mazza
- Características de bacterias aerobias mesófilas; disponible online en:
[http://www.buenastareas.com/ensayos/Caracteristicas-Bacterias-Aerobias-
Mesofilas/6624241.html]
- Microorganismos Indicadores; disponible online en:
[http://www.analizacalidad.com/docftp/fi168arf2005-1.pdf]
- Microbiología de agua. Conceptos básicos; por María C. Apella y Paula Z.
Araujo; disponible online en:
[http://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/
02_Capitulo_02.pdf]
- Microbiología de la leche; disponible online en:
[http://www.slideshare.net/jennyyambay/capituloii]