TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

CULTIVO DE RAICES TRANSFORMADAS DE

Bonellia macrocarpa PARA LA PRODUCCION
DE BONEDIOL EN BIORREACTOR AIRLIFT

Protocolo de investigación

PRESENTA:
LOPEZ QUIROZ DELMAR ERNESTO

DIRECTOR: Dr. FEDERICO ANTONIO GUTIÉRREZ MICELI

TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS OCTUBRE 2017

CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 3
2 ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 4
2.1 Familia Theophrastaceae .......................................................................................................... 4
2.1.1 Genero Bonellia ...................................................................................................................... 5
2.1.2 Bonellia macrocarpa .............................................................................................................. 5
2.2 Cultivo de células vegetales ...................................................................................................... 6
2.3 Raíces transformadas ................................................................................................................ 6
2.4 Metabolitos ............................................................................................................................... 7
2.4.3 Metabolitos secundarios ........................................................................................................ 7
2.5 Bonediol .................................................................................................................................... 8
2.6 Cultivo de células vegetales en biorreactor .............................................................................. 8
2.7 Agitación y estrés hidrodinámico .............................................................................................. 9
2.8 Biorreactor Airlift. ..................................................................................................................... 9
2.9 Vectores de oxigeno ................................................................................................................ 10
3 JUSTIFICACIÓN................................................................................................................................ 12
4 OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 12
4.1 Objetivo general ...................................................................................................................... 12
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................................... 13
5 MATERIALES Y METODOS............................................................................................................... 14
5.1 Material vegetal ...................................................................................................................... 14
5.2 Medio de cultivo Murashige y Skoog ..........................................Error! Bookmark not defined.
5.2.1 Sales principales (macronutrientes) .....................................Error! Bookmark not defined.
5.2.2 Sales menores (micronutrientes) .........................................Error! Bookmark not defined.
5.2.3 Vitaminas ..............................................................................Error! Bookmark not defined.
5.3 Establecimiento de crecimiento y cinética en matraz agitado de raíces transformadas ....... 14
5.3.1 Establecimiento de crecimiento y cinetica en matraz agitado de raíces transofrmadas con
vectores de oxigeno ...................................................................................................................... 14
5.4 Caracterización hidrodinámica del airlift ................................................................................ 14
5.4.1 Determinación del tiempo terminal de mezclado ............................................................... 15
5.4.2 Determinación del coeficiente de retención de gas (Eg) ...................................................... 15
5.4.3 Determinación del diámetro de burbuja (db) ....................................................................... 15
5.4.4 Determinación del área interfacial de contacto gas-líquido (a´) ......................................... 15
5.4.5 Determinación teórica del coeficiente volumétrico de transferencia de oxigeno .............. 15
5.5 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas ............................................................................................................................... 16

2
 5.5.1 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas con vectores de oxigeno ....................................................................................... 16
6.0 METODOS ANALITICOS................................................................................................................ 17
6.1 Identificación y cuantificación de bonediol de raíces transformadas..................................... 17
6.3 Cuantificación de sustrato....................................................................................................... 17
Referencias ........................................................................................................................................ 17
Cronograma de activdes ............................................................................................................... 20

1 INTRODUCCIÓN
El potencial que ofrecen las plantas como fuente de productos de interés industrial es
enorme ya que en estas se sintetizan una gran variedad de compuestos químicos. Sin
embargo, solamente se ha estudiado un porcentaje reducido de todas las especies
existentes del planeta (Talou, Alvarez, & Giulietti, 1994)
La transformación genética de especies vegetales es un mecanismo que actualmente es
ampliamente utilizado dentro del campo del Fitomejoramiento. Este mecanismo permite
insertar genes foráneos dentro de una célula de un tejido vegetal receptor para la

3
generación de plantas genéticamente modificadas, conocidas también como plantas
transgénicas (Blanco, Valverde, & Gómez, 2003).
La transformación de las raíces tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la producción de
biomasa con alta velocidad de crecimiento, capaces de sintetizar metabolitos secundarios
de utilidad y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulación de la
rizogénesis en especies recalcitrantes (Torres, 2017).
Las raíces transformados son organismos heterótrofos y que realizan el proceso de
respiración, por lo que necesitan del oxígeno para la generación de energía así como para
procesos metabólicos por lo cual es uno de los grandes retos al realizar el escalamiento de
cultivos de raíces transformadas es el oxígeno que debe estar presente en el medio debido
a que se encuentra muy limitado ya que existe una resistencia a la transferencia de masa
de la fase liquida a la fase solida lo cual afecta al crecimiento de las raíces (Smita & Ashok,
2012)
Al igual que todos los tejidos vegetales, las raíces responden al ambiente, especialmente
O2, CO2 y etileno. El oxígeno es el menos solubles de los tres gases y su solubilidad disminuye
con el aumento de la temperatura y los otros componentes de un medio de cultivo.
Comparado con el caso de células, la estructura compleja de las raíces proporciona muchas
barreras para transporte de gas, resultando en condiciones de agotamiento de oxígeno
disuelto (Yu & Doran, 1994)

2 ANTECEDENTES

2.1 Familia Theophrastaceae

Las Theophrastaceae forman una pequeña familia Neotropical compuesta por alrededor de
100 especies de arbustos y árboles pequeños divididos en siete géneros, Clavija (56 spp.),
Bonellia (20 spp.), Jacquinia (13 spp.), Thophrasta (2 spp.), Deherainia (2 spp.), Neomezia
(1sp.), y Vorschia (1sp.) (Ståhl & Källersjö, 2004)
Todas las Theophrastaceae son plantas leñosas que varían en tamaño desde los arbustos
enanos (Neomezia y algunas especies de Clavija) hasta árboles ramificados o escasamente
ramificados como son las plantas de Bonellia, Jacquinia y Deherainia, mientras que las de
Clavija, Neomezia y Theophrasta son Pachycauls. Todos los géneros reconocidos de

4
Theophrastaceae se encuentran en la parte norte del Neotrópico, y están particularmente
bien representados en Mesoamérica y el área del Caribe (Ståhl & Källersjö, 2004; Tellez &
Dávila, 1997).

2.1.1 Genero Bonellia

El género Bonellia cuanta con 20 especies y se caracteriza de manera morfológica por las
vellosidades cortas uniseriadas o glabras; hojas alternadas; en su mayoría mucronadas;
corola color naranja o blanca y esclerénquima abaxial foliar adyacente a la epidermis
inferior. (Ståhl & Källersjö, 2004)
Commented [Y1]: Características que definana a la
especie
2.1.2 Bonellia macrocarpa
Esta especie se encuentra ampliamente distribuida en la Mesoamérica y en parte de la
república mexicana. La especie es arbuscular y su característica principal el color de sus
corolas (Fig. 1). En la actualidad se están realizando estudios sobre la actividad biológica de
esta especie como planta medicinal (Ståhl & Källersjö, 2004). Commented [Y2]: Usos

5
 Figura 1 Hojas y flores de Bonellia macrocarpa (Ståhl & Källersjö, 2004)

2.2 Cultivo de células vegetales

Dentro de la biotecnología moderna el cultivo de tejidos puede ser definido como el cultivo
de todo tipo de células, órganos, tejidos, embriones y protoplastos bajo condiciones
asépticas (Smith y Drew 1990). El cultivo de tejidos vegetales es un conjunto de técnicas
que permiten el cultivo in vitro de cualquier parte de una planta, de una sola célula hasta
un organismo completo, bajo condiciones controladas y estériles. Los tipos de cultivos más
importantes son cinco: cultivos de planta completa, cultivo de embriones, cultivo de callo,
cultivo de órganos y de células en suspensión (López E. M., 2008)

El cultivo de tejidos tiene diversas aplicaciones como lo son la inducción de variabilidad

genética, mejorar la sanidad o incrementar la cantidad de biomasa. Hoy en día los
protocolos para cultivos de tejidos están disponibles para varios tipos de plantas sin
embargo aún se requieren trabajos de investigación para el desarrollo de cultivos mediante
organogénesis, embriogénesis somática, cultivos en suspensión, protoplastos, rescate de
embriones, con la finalidad de proveer estrategias de multiplicación masiva de plantas,
producción de metabolitos y transformaciones genéticas para establecer condiciones
favorables para el sector agronómico.
2.3 Raíces transformadas
La mayoría de los metabolitos de interés se encuentran acumulados en las raíces, en
condiciones naturales, el proceso de obtención de estos compuestos es un proceso
destructivo para la plantade ahi el interés de desarrollar los cultivos de raíces
transformadas.

Ruíz et al (2017) estableció el protocolo para la transformación de raíces de Bonellia

macrocarpa usando Agrobacterium rhizogenes A15834 y usando diferentes explante tales
como cotiledones, hipocótilo y raíces de plántulas para la transformación donde a través de
microscopía de fluorescencia para el dímero en tándem detectado de la proteína de tomate
(TDT) y de un análisis de PCR para rolC confirmo la presencia de los genes que indican la
transformación obteniendo así una frecuencia de transformación de 7.14% de cotiledones,
24.99% hipo cotiledones y 10.71% de raíces de plántulas y después de un cultivo de 10
semanas le realizó un proceso de extracción y cuantificación donde se confirmo la presencia
del alquil catecol (bonediol) en una concentración de 2.78 mg de Bonediol/ g de peso seco
de raíz transformada.

6
2.4 Metabolitos
Cuando se habla de metabolitos se refiere a aquellas sustancias o extractos que se obtienen
a traces de plantas los cuales sintetiza para su desarrollo, mantenimiento y crecimiento. Los
metabolitos pueden ser clasificados desde la naturaliza química de los componentes como
orgánicos e inorgánicos. (Kuklinski, 2000)
Los metabolitos que se acumulan principalmente en el tejido (intracelular) presentan un
desafío para el proceso de extracción ya que el tejido debe ser homogenizado para que el
metabolito pueda ser extraído y purificado partiendo de una solución compleja. Por otro
lado, los metabolitos que se acumulan en el medio (extracelular) se encuentran en un medio
químicamente menos complejo (Cuadro 1).
Las regulaciones de las rutas metabólicas básicas son aquellas que dan origen al
metabolismo secundario de las plantas, dando lugar a una serie de compuestos que puedes
ser responsables de colores, sabores, aromas, actividad medicinal o venenosa. Estos
metabolitos se pueden acumular dentro de las células o ser expulsado al medio que rodea
a la planta.

Cuadro 1 Principales metabolitos primarios y secundarios producidos en plantas (Kuklinski, 2000)

Metabolismo primario Metabolismo secundario

Glúcidos Isoprenoides: terpenos, saponinas, aceites
Lípidos esenciales
Aminoácidos Fenoles: Simples, Ácidos fenólicos, taninos,
Proteínas quinonas
Ácidos Nucleicos
Compuestos Alcaloides
Nitrogenados

2.4.3 Metabolitos secundarios

Las regulaciones de las rutas metabólicas básicas son aquellas que dan origen al
metabolismo secundario de las plantas, dando lugar a una serie de compuestos que puedes
ser responsables de colores, sabores, aromas, actividad medicinal o venenosa. Estos
metabolitos se pueden acumular dentro de las células o ser expulsado al medio que rodea
a la planta.

7
2.5 Bonediol
Cammal et al (2011), reportaron la estructura de un nuevo alquil catecol asignado como 4-
metoxi-3-undecil-benceno-1,2-diol y nombrado como bonediol (Fig.2). Este fue el primer
reporte realizado para el aislado de este compuesto en Bonellia macrocarpa

Figura 2 Estructura del Bonediol (Cammal Fuentes,

Torres Tapia, Cedillo Rivera, Moo Puc, & Peraza
Sánchez, 2011)

2.6 Cultivo de células vegetales en biorreactor

Un biorreactor es un sistema en el cual ocurren transformaciones y procesos bioquímicos,
los cuales pueden ser caudados por la actividad de enzimas o por la acción de células vivas
(Lee, 2002).
El uso de cultivo de células vegetales es una alternativa para la obtención de una gran
variedad de metabolitos de interés de industrial aun que para ser aplicable se requieren de
cultivos a gran escala con células altamente productivas. El funcionamiento óptimo de un
biorreactor depende de diferentes factores entre los que se encuentran: (Doran, 1995)

 Concentraciones altas de biomasa para que las transformaciones bioquímicas

puedan llevarse a cabo con mayor eficiencia.
 El mantenimiento de condiciones estériles para evitar la contaminación del medio
de cultivo.
 Adecuada transferencia de oxígeno para el crecimiento de cultivos aerobios
 Agitación que permita una efectiva distribución de los nutrientes y células en el
reactor (mezcla homogénea).
 Eficiente eliminación del calor que puede producirse durante el cultivo
 Creación de las condiciones óptimas para el crecimiento de las células, así como para
evitar la heterogeneidad del sistema.
Se han realizado muchos trabajos donde se discute sobre el cual es el reactor adecuado
para llevar a cabo diferentes cultivos vegetales, sin embargo, la elección del tipo de
reactor depende completamente de los requerimientos específicos del tipo de cultivo
(células en suspensión, raíces transformadas o plántulas micropropagadas) (Huang &
McDonald, 2009; Ozlem & Aynur, 2010; Weathers, Towler, & Xu, 2010; Suresh, Bais,
Raghavarao, Ravishankar, & Ghildyal, 2005).

8
 Existe una serie de biorreactores usados generalmente para el cultivo de plantas (Fig.
3), el de tanque agitado es el más utilizado para los cultivos de células vegetales, aunque
también se han realizado cultivos en airlift y reactores de columna de burbujas.

Figura 3 Esquemas de reactores más utilizados para el cultivo de tejidos vegetales a. Tanque agitado b. airlift c.
Columna burbujeante d. Spray e. Reactor burbuja tipo balón f. Reactor de imerion temporal g. Reactor de imersión
tempral de raices h. Tambor (Ozlem & Aynur, 2010)

2.6.1 Agitación y estrés hidrodinámico

Los cultivos celulares en medios de cultivo agitados están sometidos constantemente a fuerzas de
cizalladura generados por el mismo proceso de agitación y aireación requeridos para la adecuada
oxigenación del medio y distribución de los cultivos; estas fuerzas en un cultivo de matraz agitado
son despreciables ya que no provocan cambios ni morfológicos ni fisiológicos en el cultivo, pero al
escalar el proceso aumentan los requerimientos de transferencia de masa del sistema lo que trae
como consecuencia las intensificación de la agitación y la aireación y ya que estos fenómenos se
llevan a cabo en régimen turbulento produciendo deformaciones o cambios en el cultivo vegetal
los cuales podrían llevar a la muerte celular por lisis (Doran, 1995; Arias, 2013).

2..6.2 Biorreactor Airlift.

También son conocidos como biorreactores de elevación con aire o en rizo. Consisten en un tanque
divido en dos zonas interconectadas, principalmente por un bafle. Sólo una región es suministrada

9
con el gas y se le denomina zona ascendente o riser, a la otra zona se denomina descendente o
downcomer. La división de las zonas conduce a una diferencia de densidades entre ambas regiones
con lo cual se origina la recirculación del medio en el reactor, la separación de estas dos zonas son
las que hacen que sean efecticos en la suspensión de células y en la transferencia de oxigeno (Choi,
Chisti, & Moo., 1996)

Los biorreactores tipo airlift presentan ventajas de diseño para el crecimiento de células vegetales,
ya que combina una buena transferencia de masa con alto contenido de partículas sólidas, mezclado
eficiente, esfuerzo de corte relativamente bajo, consumo menor de energía y diseño (Sajc, Grubisic,
& Novakovi, 2000)

La primera aplicación de los biorreactores airlift, data de principios de los años 50. La utilización de
este tipo de biorreactores requiere de un diseño para procesos en particular, a diferencia de los
biorreactores de tanque agitado que pueden ser adaptados para cada proceso y alterar las
condiciones sin mucha dificultad, en cambio los biorreactores tipo airlift no ofrecen muchas
posibilidades de variar las condiciones de trabajo. (Martíez, 2007)

Por lo general el aire suministrado al reactor es suficiente para actuar como la una fuente de
moviente del liquido (Doran, 1995; Lee, 2002)

Figura 4 Principales configuraciones de reactores airlift (a) Airlift de tubos concéntricos (b) Airlift de cilindro
seccionado (c) Airlift de recirculación externa (Chisti & Moo-Young, 2002)

La característica de funcionamiento de este tipo de reactores depende principalmente de la

velocidad de inyección del gas y de la velocidad de recirculación del líquido.

2.9 Vectores de oxigeno

La transferencia del oxígeno representa uno de los más importantes parámetros en la transferencia
de masa por lo cual una de las ventajas de usar vectores de oxigeno es el aumento de la tasa de

10
transferencia de oxigeno de la fase gaseosa a las células vegetales sin la necesidad para el suministro
de energía extra. Por lo que un enfoque prometedor para resolver el problema de la transferencia
de oxigeno son los vectores que pueden actuar como agentes que disminuyen la tensión superficial
del agua e incrementar el área de contacto para la transferencia de la fase gaseosa . (Shiru, Mingxia,
Prihardi, Z Yongzoo, & Mitsuyazu, 1997) a través de algunos estudios se ha observado que la adición
de una solución no acuosa puede inducir un aumento significativo de la tasa de transferencia del
oxígeno del aire a las células sin requerir de un incremento en la agitación de la mezcla. Por lo cual
los vectores de oxigeno son una buena opción para mejorar la disponibilidad del oxígeno al tejido el
efecto de diferentes vectores de oxigeno se encuentra en el rango del 1 al 4% (v/v) (Shiru, Mingxia,
Prihardi, Z Yongzoo, & Mitsuyazu, 1997; Smita & Ashok, 2012)

11
3 JUSTIFICACIÓN
A través de una búsqueda iniciada el mes de agosto del año 2017 en el portal Scopus sobre
el tema de cultivo de raíces transformadas se logra observar una tendencia de incremento
en el interés científico sobre este tema. Sin embargo, pocas especies de plantas han sido
estudiadas, de las cuales la mayoría tiene la capacidad de producir compuestos de interés
de nivel industrial para diversos sectores.
Por el momento no existe ningún reporte sobre trabajos realizados para raíces
transformadas de Bonellia macrocarpa para ninguna condición propuesta en este trabajo,
además de que actualmente se han realizo estudios sobre las propiedades medicinales de
compuestos producidos por Bonellia macrocarpa. Cammal Fuentes y col. en 2011 usaron
bonediol sobre líneas celulares tumorales donde mostró una cierta actividad y selectividad
sobre las células cancerosas.
Las raíces transformadas se han considerado como una matriz biológica para varias
funciones biotecnológicas durante las últimas tres décadas dado que son competentes para
un crecimiento virtualmente infinito bajo condiciones de crecimiento controlado
(Mehrotra, 2015).

Existe poca información sobre la influencia del oxígeno para la producción de biomasa y/o
metabolitos en cultivo de raíces y a la fecha no existe ningún reporte sobre el oxígeno como
sustrato limitante sobre la producción de biomasa y bonediol en Bonellia macrocarpa.

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo general:

12
Estudiar el efecto del oxígeno disuelto sobre el crecimiento celular y la producción de
Bonediol en cultivo de raíces transformadas de Bonellia macrocarpa en biorreactor airlift.

4.2 Objetivos específicos:

 Establecer la cinética de crecimiento y producción de bonediol a nivel matraz en

cultivo por lote y agitación constante con y sin vectores de oxígeno al 2%(v/v)
(Tween 80 y peróxido de hidrogeno)

 Caracterizar la hidrodinámica del biorreactor Airlift con y sin raíces transformadas

de B. macrocarpa

 Establecer la cinética de crecimiento y producción de bonediol a nivel biorreactor

airlift en cultivo por lote con flujos de aire (alto, medio y bajo) con y sin vectores de
oxigneo al 2%(v/v) (Tween 80 y peróxido de hidrogeno)

13
5 MATERIALES Y METODOS
5.1 Material vegetal
Se emplearán raíces transformadas de Bonellia macrocarpa del laboratorio de cultivo de
tejidos vegetales del instituto tecnológico de Tuxtla Gutiérrez resultados del trabajo de
investigación del M.C. Luis Alberto Ramírez Inducción a raíces transformadas de Bonellia
macrocarpa (Cavanilles) Ståhl & Källersjö mediante Agrobacterium rhizogenes.

5.3 Establecimiento de crecimiento y cinética en matraz agitado de raíces transformadas

El crecimiento y la producción de metabolitos será establecido en matraces Erlenmeyer de
250 ml colocados en un agitador a 60 rpm los cuales contendrán 50 ml de medio líquido de
cultivo Murashige & Skoog (MS). Se inoculará cada matraz con 3 g de raíz (peso seco), la
temperatura se mantendrá a 25°C, el experimento se conducirá bajo un fotoperiodo de 16
horas de luz y 8 de oscuridad.
Serán evaluadas para la generación de las cinéticas de biomasa sacando las raíces del matraz
para colocarlos en papel filtro para eliminar el exceso de agua y serán pesados para obtener
el peso fresco y secados a tempratura ambiente hasta peso constante para con eso obtener
el peso seco de las raíces.

5.3.1 Establecimiento de crecimiento y cinética en matraz agitado de raíces

transformadas con vectores de oxigeno
El crecimiento y la producción de metabolitos será establecido en matraces Erlenmeyer de
250 ml colocados en un agitador a 60 rpm los cuales contendrán 50 ml de medio de cultivo
Murashige & Skoog (MS) con 2% (v/v) de Tween 80; de peróxido de hidrogeno; Se inoculará
cada matraz con 3 gr de raíz (Peso seco), la temperatura se mantendrá a 25°C, el
experimento se conducirá bajo un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 de oscuridad.
Serán evaluadas para la generación de las cinéticas de biomasa sacando las raíces del matraz
para colocarlos en papel filtro para eliminar el exceso de agua y serán pesados para obtener
el peso fresco y secados a 35°C hasta peso constante para con eso obtener el peso seco de
las raíces.

5.4 Caracterización hidrodinámica del airlift

La caracterización hidrómica del bioreactor comprenderá de la determinación del tiempo terminal
de mezclado (tm), coeficiente de tensión de gas (Eg), diámetro de burbuja (db), área interfacial de
contacto gas-liquido (a´), medición del coeficiente global de transferencia de oxígeno (KLa) y la
velocidad de circulación del líquido en el reactor. Los métodos por utilizar se detallarán a
continuación (Doran, 1995; Chun-Chong, Wen-Teng, & Shih-Yuan, 2003):

14
5.4.1 Determinación del tiempo terminal de mezclado
Contenido el reactor el volumen de operación (Vop) y operando con un flujo constante de aire (Fa) el
tiempo terminal de mezclado es el tiempo que transcurre desde la adición instantánea (pulso) de
una alícuota de ácido (o de azul de metileno) hasta la estabilización del pH del medio (o la
homogenización del color del medio), medido con ayuda de un electrodo de pH (Chun-Chong, Wen-
Teng, & Shih-Yuan, 2003)

5.4.2 Determinación del coeficiente de retención de gas (Eg)

Esta fracción se determina como la relación del incremento entre los volúmenes del líquido cuando
se airea, y la mezcla gas-liquido. La altura del líquido (HL) corresponde al volumen de referencia en
el volumen de la columna (Vt) cuando no existe aireación alguna. La altura de la mezcla gas-liquido
se conoce como Hlg. El valor del coeficiente de retención se calcula usando la relación siguiente
(Nielsen & Villadsen, 1994).
𝐻𝑙𝑔 − 𝐻𝑡
𝐸𝑔 =
𝐻𝑙𝑔

5.4.3 Determinación del diámetro de burbuja (db)

Existe una variación en el diámetro de burbuja como respuesta a diferentes caudales de aire por lo
que se determinara el valor del diámetro estadístico o medio de Sauter de las burbujas en diversas
condiciones de operación. Para lo cual se usará la siguiente relación (Nielsen & Villadsen, 1994;
Mayer & Ruiz, 1994):
(𝛴𝑛𝑖 𝑑𝑏𝑖)^3
𝑑𝑏 =
(𝛴𝑛𝑖 𝑑𝑏𝑖)^2

Donde:
ni= número de veces que se presenta un diámetro determinado.
dbi= valor del diámetro de las burbujas (cm).

Para determinar los diámetros, el reactor se pondrá en operación con agua coloreada con azul de
metileno a gastos de aire de 1 a 8 LPM y se tomaran fotografías digitales del reactor operando a
dichas velocidades del gas. A estas fotografías se les realizara un análisis con un software
especializado (Freehand 10). (López E. G., 2004).

5.4.4 Determinación del área interfacial de contacto gas-líquido (a´)

Con los valores de Eg y db se puede calcular, para las condiciones de trabajo ensayadas, el área de
contacto interfacial a’ usando la expresión de Calderbank:
6 𝐸𝑔
𝑎´ =
𝑑𝑏(1 − 𝐸𝑔)
5.4.5 Determinación teórica del coeficiente volumétrico de transferencia de
oxigeno
Se determinará usando las ecuaciones propuesta por Bello y col. (Mayer & Ruiz, 1994).

𝐴𝑑 −2
𝑘𝐿𝑎 = 0.76 (1 + ) 𝑈𝐺𝑅 0.8
𝐴𝑟

15
 𝐴𝑑 −12 𝑃𝑔 0.8
𝑘𝐿𝑎 = 0.00055(1 + )
𝐴𝑟 𝑉
Donde:
𝑈𝐺𝑅 2
𝑃𝑔 = 𝑄𝑔 𝜌𝑔 (𝑅𝑇𝑙𝑛(1 − 𝛼) + )
2

𝛼 = (𝜌𝑙 𝑔𝐻𝐿 (1 − 𝐸𝑔 ))/𝑃𝑡𝑜𝑝

𝑃𝑡𝑜𝑝 = 𝑃𝑎𝑡𝑚 + 𝑃 𝑖𝑛

Pg= Consumo de potencia (watts)

Qg= Gasto volumétrico de aire (m3/s)
ρg= Densidad del gas (kg/m3)
R = Constante general de los gases (J/kmol K)
T = Temperatura absoluta (K)
UGR= Velocidad superficial del gas (m/s)
Ad= Área seccional del downcomer (m2)
Ar= Área seccional del riser (m2)
α= Relación entre la cabeza hidrostática máxima y la presión en la parte superior
del reactor (adim)
ρl= Densidad del líquido (Kg/m3)
g= Constante gravitacional (m/s2)
Hl= Altura del líquido (m)
Ptop= Presión en la superficie del líquido (atm)
Patm= Presión atmosférica (atm)
Pin= Presión interna (atm)
5.5 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas
Se usara como inóculo al biorreactor un cultivo de Bonellia macrocarpa crecidas en matraz
agitado. Se empleará medio de cultivo MS, se probaron dos flujos de aire 0.1 y 0.5 vvm. En
todos los casos se usará un biorreactor tipo airlift del cual se tomarán muestras cada cinco
días por 40 días para la determinación de las cinéticas
5.5.1 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas con vectores de oxigeno
Se usaron como inóculo al biorreactor, raíces estériles de Bonellia macrocarpa crecidas en
matraz agitado. Se empleará medio de cultivo MS con 2% de Tween 80; peróxido de
hidrogeno; Tween 80 y peróxido de hidrogeno, se probarán dos flujos de aire 0.1 y 0.5 vvm.
En todos los casos se usará un biorreactor tipo airlift del cual se tomarán muestras para las
determinaciones cinéticas.

16
6.0 METODOS ANALITICOS
6.1 Identificación y cuantificación de benediol de raíces transformadas
Se realizará la extracción utilizando el método propuesto por Caamal Fuentes et al (2011) usando 3
g de raíces transformadas secas con maceración a temperatura ambiente con MeOH (3 x 150 ml)
durante 24 h. El sobrenadante será filtrado al vacío por medio de un evaporador rotatorio para
obtener un extracto seco. El extracto seco será suspendido en 10 ml de MeOH para análisis
posteriores. Se utilizará un equipo HPLC modelo Flexar (Perkin Elmer, Shelton CT, EE. UU.). Las
muestras se inyectarán en una columna ZORBAX ODS (5 μm x 250 mm x 4,6 mm) (Agilent
Technologies). Las fases móviles serán agua desionizada con 0.05% de ácido fórmico (A) y
acetonitrilo con 0.05% de ácido fórmico a 60/40 (v / v) (B) y el gradiente programado será el
siguiente: inicia con 30% A, cambio de 30% a 5% A en 5 min y constante 5% A durante 15 min más.
Una post-ejecución de 1 min de 100% B para limpiar la columna entre análisis. El flujo constante
suministrado será de 0,8 ml/min y se inyectaran 20 μL de las muestras del auto muestreador.
La curva de calibración para la cuantificación se comparó con el patrón de Bonediol, que se aisló,
purificó y caracterizó previamente por análisis espectral (UV, IR, 1D y 2D NMR, y MS)

6.3 Cuantificación de sustrato

Los azucares residual se determinará usando un equipo de cromatografía liquida de alta de precisión
(HPLC, PerkinElmer, series 200) conectado a un detector de IR (PerkinElmer, series 200a). Se
utilizarán los caldos obtenidos al final del periodo de incubación. Las muestras se centrifugarán
(Centrifuga eppendorf, 5810 R) a 10000 rpm por 10 minutos a 4 °C, el sobrenadante se diluirá cinco
veces y se filtra a través de una membrana (0.22 µm, Millipore). Para la cuantificación se utilizó una
columna Hi-Plex Ca (300 x 7.7 mm) (Agilent Technologies, Alemania) mantenida a 85ºC. Se trabajó
en condiciones isocráticas a un flujo de 0.3 mL/min, utilizando como fase móvil agua tridestilada y
con un volumen de inyección de 10 μL. Las soluciones estándar serán preparadas en agua
tridestilada para conocer los tiempos de elusión y las curvas de calibración.

REFERENCIAS
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19
Cronograma de actividades
2018 2019

Noviembr
eDiciembr
Octubre
Febrero

Febrero
Agosto

Agosto
Marzo

Marzo
Enero

eEnero
Mayo

Mayo
Junio

Junio
Abril

Abril
Julio

Julio
Sept
Actividades

Revisión
bibliográfica

Estandarizaci
ón de
técnicas
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz sin
vectores
Preparación
de
estándares

Definición de
diseño
experimental
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
vector
(Tween 80)
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
vector
(Peróxido)
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
ambos
vectores

20
 Análisis de
resultados y
caculo de
parámetros
cinéticos
Caracterizaci
ón del
biorreactor
obtención de
parámetros
cinéticos en
biorreactor
Análisis de
resultados y
caculo de
parámetros
cinéticos
Redacción de
artículo y
tesis

21