Prácticas de Soledad Bornás Acosta

Bioquímica
PRÁCTICA 8

OXIDACIONES BIOLOGICAS

1. INTRODUCCION

La mayor parte del oxígeno celular se utiliza para quemar combustibles y generar ATP a
partir de ADP y Pi. Un único tipo de complejo enzimático localizado en la membrana
mitocondrial interna cataliza esta reacción en la que el oxígeno es el último aceptor de
electrones.
La formación de ATP por fosforilación ADP ocurre al mismo tiempo que la combustión de
grasas, carbohidratos e incluso proteínas. Las modificaciones de reacciones que se realizan
en las células permiten la fosforilación de una gran cantidad de moléculas de ATP por
moléculas de combustible consumido; cada uno de estos procesos representa la suma de
muchas reacciones individuales.
Mas del 85% de los fosfatos de alta energía consumidos durante el día por todo el organismo
son producidos por fosforilación oxidativa; esto es, la generación de enlaces de alta energía
acoplados a la reducción del oxígeno.
La oxidación de un sustrato típico por el oxígeno libera suficiente energía libre para producir
dos o tres moléculas de ATP por cada átomo de oxígeno consumido. La transferencia de
electrones desde el sustrato hacia el oxígeno para reducir éste a agua se descompone
entonces en un máximo de tres pasos. Tres complejos enzimáticos de bombeo de protones
capturan la energía proveniente de la reducción del oxígeno, bombeando una cantidad
suficiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna para impulsar la
formación de una molécula de ATP a partir de ADP y Pi por cada par de electrones
transferidos a través de una serie de intermediarios que constituyen la “Cadena
Respiratoria”.
Los intermediarios, están formados por complejos enzimáticos; los cuales catalizan las
transferencias sucesivas de electrones a la vez de bombear protones.
En las células vivas los electrones que son liberados, no permanecen en el medio, ya que
inmediatamente son tomados por otro compuesto, el que al hacerlo se reduce. Estas oxido-
reducciones son catalizadas por deshidrogenasas más o menos específicas; algunas utilizan
NAD como agente oxidante, mientras que otros como el FAD utilizan directamente la
ubiquinona.
Existen diferentes formas de evidenciar las oxidaciones biológicas, una de ellas es mediante
el uso de aceptores artificiales de electrones, los cuales se decoloran cuando se reducen.
También se puede estimar estas reacciones mediante el consumo de oxígeno utilizando un
respirómetro de Warburg o mediante la determinación de la oxihemoglobina (hemoglobina
oxigenada) por espectrofotometría.

2. OBJETIVOS
• Verificar la actividad de la xantino deshidrogenasa de la leche cruda y hervida,
usando como sustrato artificial el aldehído fórmico.
• Estimar la oxidación del succinato y aldehido fórmico por medio de un aceptor
artificial de hidrógenos (azul de metileno) que al reducirse se decolora.
• Verificar la acción inhibidora del cianuro y alopurinol sobre la actividad enzimática
de la xantino deshidrogenasa.
• Estudiar el efecto de los inhibidores (cianuro y malonato) donantes y aceptores
durante la oxidación del succinato por la cadena respiratoria.
• Determinar el funcionamiento de la cadena respiratoria del extracto enzimático a
través de la medida del consumo de oxígeno por la técnica manométrica de
Warburg.

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3. MATERIAL Y METODOS

3.1. MATERIALES
3.1.1. Materiales biológicos
• Extracto enzimático de hígado
• Leche cruda de vaca
• Leche hervida de vaca

3.1.2. Materiales de vidrio

• Tubos de ensayo
• Pipetas
• Vasos de precipitación
• matraces

3.1.3. Reactivos
• Azul de metileno 0,1%
• Aldehido fórmico hidratado 0,1M
• Alopurinol
• Cianuro de Sodio 0,1M
• Ascorbato 0,1M
• Malonato 0,2M
• Succinato 0,1M
• Succinato 0,4M
• Agua destilada
• Aceite o parafina líquida

3.1.4. Equipos y otros

• Piseta
• Cocina
• Guantes

3.2. METODOS
Mediante la observación y exploración se aplicará el método de aceptores artificiales de
electrones y el respirómetro de Warburg para medir el consumo de oxígeno, con la
finalidad de verificar las reacciones de oxido-reducción.

4. PROCEDIMIENTO
4.1. Acción de la Xantino Deshidrogenasa de la leche.
• Rotular 4 tubos de ensayo y medir lo siguiente:
1 2 3 4
Leche cruda 5mL 5mL 5mL
Leche hervida 5mL
Alopurinol 1mL
Cianuro de sodio 1mL
Aldehido fórmico 0,8mL 0,8mL 0,8mL 0,8mL
Azul de metileno 0,4mL 0,4mL 0,4mL 0,4mL
• Mezclar y agregar inmediatamente a cada tubo 1 mL de aceite o parafina líquida.
• Incubar los tubos a 37°C por 5 minutos. Luego observar la decoloración del azul de
metileno a los tubos que corresponda.

4.2. Oxidación del Succinato, usando Respirómetro de Warburg.

• En 8 frascos de Warburg medir lo siguiente:

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1 2 3 4 5 6 7 TB
Succinato 0,1M 1mL 1mL 1mL 1mL
Succinato 0,4M 1mL
Cianuro 1mL 1mL 1mL
Azul de Metileno 1mL
Malonato 2mL 2mL
Ascorbato 1mL 1mL
H2O destilada 2mL 1mL 2mL 1mL 4mL
Extracto Enzimático 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
• Equilibrar los sistemas por 10 a 15 minutos, permitiendo el libre intercambio gaseoso
con el medio ambiente.
• Cerrar la llave de los manómetros y la llave lateral de los frascos de Warburg y
realizar las lecturas cada 10 minutos hasta completar una hora.

5. RESULTADOS
• Esquematizar el procedimiento de los experimentos. Luego interpretar sus
resultados.
• En el experimento 4.1. estructurar la siguiente tabla:
1 2 3 4
Decoloración 0-5 minutos
Decoloración 5-10 minutos
Decoloración10-15 minutos
• Interpretar por qué en algunos tubos se da la decoloración y en otros no.

• En el experimento 4.2. estructurar la siguiente tabla:

T 1 2 3 4 5 6 7
TB
min kO2= kO2= kO2= kO2= kO2= kO2= kO2=
0

10

20

30

40

50

60

TOTAL
uL de O2 / hora
• Haga una interpretación adecuada de los resultados obtenidos en cada frasco de
Warburg.
• Anotar en la misma tabla el porcentaje de inhibición o estímulo en el consumo de
oxígeno en relación al sistema 1.

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• Con los valores parciales para el consumo de oxígeno en el sistema 1, construir la

curva de progreso de la reacción.

6. CONCLUSIONES

7. CUESTIONARIO
7.1. El cianuro es capaz de inhibir la oxidación del succinato por la cadena respiratoria.
¿Cómo podría superar esta inhibición aún en presencia de cianuro?
7.2. ¿Qué son desacopladores, coloque algunos ejemplos?
7.3. ¿Mencione algunos inhibidores de la cadena respiratoria?
7.4. ¿Qué importancia tiene el termobarómetro?
7.5. Haga una justificación desde el punto de vista termodinámico de los lugares en donde
se sintetiza ATP en la cadena respiratoria.

8. BIBLIOGRAFIA