UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE BIOANÁLISIS-VALENCIA
DEPARTAMENTO MORFOFISIOPATOLOGÍA
PROGRAMA PRÁCTICO DE TOXICOLOGÍA
VALENCIA, 2014

PRÁCTICA Nº 6 FENOL
(INDICADOR BIOLÓGICO DE LA EXPOSICIÓN AL BENCENO)

INTRODUCCIÓN.

La absorción del benceno ocurre principalmente por inhalación de los vapores y en

segundo lugar por contacto, en su forma líquida, a través de la piel. El benceno puede
producir anemia aplásica, leucemia y eritroleucemia.
El benceno se metaboliza en el organismo a fenol y por lo tanto la medida de la
excreción urinaria de este compuesto es, en cierto modo, una aplicación práctica para
evaluar la exposición reciente del benceno. Una concentración de fenol superior a 20mg/L
al final del turno de trabajo indica que los trabajadores han estado expuestos a benceno,
siempre y cuando el método analítico utilizado sea lo suficientemente sensible y se
excluyan otras circunstancias que puedan dar lugar a un incremento en la excreción de
fenol.

BENCENO.
Propiedades físico-químicas:
1. El benceno es un líquido incoloro a temperatura ambiente.
2. Punto de Ebullición (760 mmHg): 80,1 ºC.
3. Presión de Vapor (20 ºC): 74,66 mmHg.
4. Densidad de Vapor: 2,7.
5. Fórmula Molecular: C6H6.
6. Fórmula Estructural:

FENOL.
Propiedades físico-químicas:
1. Masa Molar: 94,11 g/mol.
2. Punto de Ebullición: 181,8 ºC.
3. Punto de Fusión: 40,8 ºC.
4. Fórmula Empírica: C6H6O.
5. Solubilidad en Agua: 84 g/L (20 ºC)
6. Solubilidad en Etanol: Muy soluble.
7. Fórmula Estructural:
OH

METABOLISMO.

1
 La absorción del benceno ocurre principalmente por la inhalación de los vapores y
en segundo lugar a través del contacto en su estado líquido con la piel.
Una fracción del benceno absorbido se excreta inalterada en el aire exhalado. Varios
autores encontraron que en el hombre la fracción eliminada en el aire exhalado varía entre
el 10% y el 50%, dependiendo de la actividad metabólica y la cantidad de grasa.
La primera reacción, catalizada por el sistema de oxidasas microsomales de función
mixta de varios tejidos, es la transformación del benceno en epóxido benceno. Este es un
compuesto intermedio muy reactivo que, o bien se une a los constituyentes celulares (p.e.:
ADN, proteínas), o se transforma posteriormente en otros derivados del veneno. El
epóxido benceno se sospecha que sea el responsable de la acción mielotóxica del benceno.
El epóxido benceno puede ser transformado no enzimáticamente en fenol,
conjugándose después con ácido glucurónico o con el anión sulfato. Los glucuronos y
sulfoconjugados del fenol se excretan por la orina. El fenol (libre o conjugado) constituye
el principal metabolito urinario del benceno.

Recolección de la Muestra:
1. Recolección de la orina de 24 horas y expresión de los resultados como la cantidad
excretada en 24 horas. Este procedimiento es el más exacto, pero también es el
menos práctico para el control rutinario de los trabajadores.
2. Toma de muestra de orina durante un período de tiempo bien definido (p.e., de 2 a
4 horas en la segunda parte del turno de trabajo) y expresión de los resultados en
cantidad/unidad de tiempo. Este método es más exacto que el análisis de una
muestra puntual de orina, pero es demasiado laborioso para el control rutinario de
los trabajadores.
3. Toma puntual de una muestra en un tiempo bien definido después del comienzo o
final de la exposición (al final del turno de trabajo o 16 horas después del final de la
exposición, es decir, antes de comenzar el nuevo turno de trabajo). Este
procedimiento es el más usado generalmente. Es aconsejable corregir los resultados
de acuerdo con la dilución de la orina. Se han utilizado dos (2) métodos de
corrección:
a. Expresión de los resultados por gramo de creatinina.
b. Ajuste por un valor constante de la densidad.

Concentración de Fenol Total en Orina:

Contrariamente a los derivados sustituidos del benceno, p.e. tolueno y xileno, que se
metabolizan principalmente en la cadena lateral, el benceno se transforma en fenol “In
vivo” y por lo tanto se ha propuesto como índice de exposición la medida de la excreción
urinaria de fenol. La vida media del fenol está en el rango de 4-8 horas.
Dado que el 30 % del benceno retenido se oxida a fenol, en los trabajadores
expuestos a 10 ppm de benceno durante 8 horas con una ventilación de 254 L/min., se
deberían producir aproximadamente 60 mg de fenol. La variabilidad individual en la
ventilación pulmonar y la proporción de benceno biotransformada en fenol (80% según
Sherwood, 1.976), hacen que esta estimación sea solamente válida para un colectivo.
Se han desarrollado varios métodos para analizar el fenol libre y conjugado en
muestras biológicas. Como se ha indicado anteriormente, para interpretar los resultados
debe considerarse la especificidad de estos métodos. De forma resumida, el orden creciente
de la especificidad de los métodos es la siguiente: El método colorimétrico de Theis-

2
Benedict (reactivo p-nitroanilina) y el que utiliza 4-aminoantipirina, el método
colorimétrico de Gibbs (reactivo 2 6-dicloroquinona clorimida) y los diversos métodos de
cromatografía de gases.
Los métodos de cromatografía de gases son, desde luego, superiores en
especificidad a los colorimétricos, aunque no son superiores al método de Gibbs. Los
métodos de cromatografía de gases no sólo son muy específicos, sino también muy
precisos, cuando se utiliza un estándar interno. Cualquiera que sea el método que se utilice,
es necesario controlar que la hidrólisis del fenol conjugado es completa antes de realizar la
extracción. La hidrólisis enzimática parece ser el método de elección.
Se puede concluir que el método colorimétrico de Theis y Benedict no sirve para
detectar exposiciones a bajas concentraciones de benceno. Ya que los compuestos
fenólicos, aparte del p-cresol, se encuentran sólo en pequeñas cantidades en la orina
obtenidos por cromatografía de gases.

DETERMINACIÓN DE FENOL URINARIO POR EL

MÉTODO DE THEIS Y BENEDICT.

Características:
1. Muestra: Orina de 24 horas.
2. Aparato: Espectrofotómetro UV-VIS.
3. Región: Visible 500 nm.
4. V.R.: 150-200 mg/L

Fundamento:
Se fundamenta en hacer reaccionar el fenol presente en la muestra con la p-
nitoranilina diazotada, en medio alcalino, produciéndose una coloración anaranjada que se
mide a una longitud de onda de 500 nm.

Reactivos:
1. Goma Arábica.
2. Acetato de Sodio al 50 %.
3. Carbonato de Sodio al 20 %.
4. Paranitroanilina.
5. Ácido Clorhídrico.
6. Nitrito de Sodio.
7. Hielo, Agua Destilada.
8. Fenol (para preparar la solución madre).

Materiales:
1. Pipetas graduadas y volumétricas.
2. Pipetas automáticas.
3. Tubos de ensayo con tapa o tubos de baquelita.
4. Beakers.
5. Balones aforados 25, 100 y 1.000 mL.
6. Balanza analítica.
7. Varilla de vidrio.
8. Beaker o envase de plástico grande.

3
Preparación de los reactivos:
1. Goma Arábica: Pesar 1 gramo y enrasar con 100mL de agua desionozada, (guardar
en nevera).
2. Acetato de Sodio 50 %: Pesar 50 gramos de acetato de sodio y enrasar a 100 mL
con agua desionizada, (guardar a T.A.)
3. Carbonato de Sodio 20 %: Pesar 20 gramos de carbonato de sodio y enrasar a 100
mL con agua desionizada, (guardar a T.A.).
4. Paranitroanilina: Pesar 1,5 g de paranitroanilina, medir 40 mL de HCl concentrado,
mezclar en campana y diluir hasta 500 mL con agua desionizada (guardar en frasco
ámbar y en nevera).
5. Paranitroanilina Diazotada: Pesar 1 gramo de nitrito de sodio y diluir en 10 mL de
agua desionizada (guardar en nevera).

Se coloca un beaker limpio y seco dentro de otro beaker más grande o un envase
grande con hielo. Agregar 25 mL de paranitroanilina (ya preparada) y añadir 0,75 mL de
nitrito de sodio recién preparado. 25 mL de PAN+0,75mL de nitrito de sodio (guardar en
nevera en frasco ámbar).

Procedimiento:
Se preparan los patrones a partir de una solución madre de 1.000 ppm. A partir de
esta solución se preparan las soluciones patrones de trabajo de concentraciones: 20, 50,
100, 150, 200 y 300 ppm.

REACTIVOS BLANCO PATRÓN PACIENTE

Agua desionizada 5 mL 4,95 mL 4,95 mL
Muestra - 0,05 mL 0,05 mL
Goma Arábiga 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Acetato se Sodio 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
PNA diazotada 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Agitar después de cada paso y dejar reposar por 1 minuto
Carbonato de Sodio 1 mL 1 mL 1 mL
Volumen Total 7,5 mL 7,5 mL 7,5 mL

Cálculo de la Concentración:

mg/L= Absorbencia de la Muestra

Pendiente de la Recta de la Curva de Calibración

También se puede hacer cálculo de regresión lineal y el cálculo de la concentración

se hace por la ecuación de la recta.

BIBLIOGRAFIA

4
Threshold Limit Values and Biological Exposure Indices for 2000. A.C.G.I.H., Cincinati,
Oh, U.S.A. (2000)

Polo Alvarado B, Nieto Zapata O, Mejía Alfaro J, et al. Guía de Atención Integral De
Salud Ocupacional Basada en la Evidencia Para Trabajadores Expuestos a Benceno y
sus Derivados. Ministerio de Protección Social. Bogotá. 2007.

Fiorenza B. G, González D., Pérez A., Ridalfi A., Srobl A. (2007). Manual de
Procedimientos Analíticos Toxicológicos para Laboratorios de Baja Complejidad.
Argentina.

PRÁCTICA Nº 6 ÁCIDO HIPÚRICO

(INDICADOR BIOLÓGICO DE LA EXPOSICIÓN A TOLUENO)

INTRODUCCIÓN.

El tolueno es el nombre común que se le da al compuesto químico que se forma

cuando un átomo de hidrógeno de la molécula de benceno es sustituido por un grupo metil.
Otros nombres por los cuales es conocido el tolueno son los siguientes: metil-benceno y
fenil-metano.
El tolueno es una sustancia nociva aunque su toxicidad es muy inferior a la del
benceno. La razón indica en que la citocroma P450, responsable de la metabolización del
benceno y el tolueno, oxida preferentemente el grupo metilo. El poder cancerígeno de los
epóxidos generados en la oxidación del anillo aromático del benceno, sólo se forman en
una proporción inferior al 5 %. El cuerpo elimina así el tolueno sobre todo en forma de
ácido benzoico y ácido hipúrico.
El tolueno puede afectar el sistema nervioso. Niveles bajos o moderados pueden
producir cansancio, confusión, debilidad, pérdida de la memoria, náusea, pérdida del
apetito y pérdida de la audición y la vista. Estos síntomas generalmente desaparecen cuando
la exposición termina.
Los vapores de tolueno presentan un ligero efecto narcótico e irritan los ojos.
Inhalar niveles altos de tolueno por un período breve puede hacerlo sentirse mareado o
soñoliento. También puede causar pérdida del conocimiento, y aún la muerte.
La concentración máxima permitida de los vapores del tolueno en los lugares de
trabajo es 50 ppm (190mg/m3).
El tolueno es biodegradable, hecho que se aprovecha por ejemplo en los biofiltros
para la eliminación de sus vapores. Sin embargo, presenta una cierta toxicidad sobre la vida
acuática y por lo tanto es catalogado como sustancia peligrosa para estos sistemas.

TOLUENO.
Propiedades físico-químicas:
1. Fórmula:
2. C6H5CH3/C7H8.
3. Peso Molecular: 92,13g/mol.

5
 4. Aspecto y Color: Líquido incoloro.
5. Olor: Aromático característico (agradable).
6. Presión de Vapor: 2,9 KPa 20 ºC.
7. Densidad Relativa de Vapor: 3,2.
8. Punto de Ebullición: 111 ºC.
9. Punto de Fusión: - 95 ºC.
10. Densidad Óptica nD20: 1,4961.
11. Solubilidad: Es miscible con la mayoría de disolventes orgánicos apolares pero casi
inmiscible con el agua (0,52g/L). CH3
12. Fórmula Estructural:

METABOLISMO.

En los humanos, el metabolismo del tolueno ha sido investigado mediante la

identificación de sus metabolitos en la orina. Inicialmente el tolueno es convertido en los
microsomas hepáticos por hidroxilación del grupo metil y del anillo a través de la acción de
enzimas del citocromo P-450, formándose el alcohol bencílico. Luego el alcohol bencílico
es convertido en ácido benzoico en dos (2) pasos. Primeramente es oxidado a benzaldehído
por el alcohol deshidrogenasa y luego a ácido benzoico por el aldehído deshidrogenasa. El
ácido benzoico es activado por enzimas del hígado para formar un derivado de la coenzima
A, que reacciona con la glicina para formar ácido hipúrico, el metabolito urinario más
abundante. También se han encontrado otros metabolitos pero en menor cantidad: el orto y
para cresoles y sus conjugados, el glucurónido de benzoyl, los ácidos S-bencilmercaptúrico
y S-totuylmercaptúrico.

ELIMINACIÓN.

Una parte del tolueno absorbido es eliminada con el aire aspirado, pero el porcentaje
más importante es oxidado con ácido benzoico conjugado con la glicina y excretado por la
orina bajo la forma de ácido hipúrico, cuya dosificación urinaria puede dar una idea de la
importancia de la exposición 50 ppm de tolueno inhalados durante 8 horas por día producen
la excreción aproximada de 1,2 g de ácido hipúrico. Concentración letal 10 mg/L.

Límites de exposición:
Límite en aire de lugar de trabajo CMP: 375 mg/m3 CMP – CPT: 560 mg/m3.
Límite biológico:
Ácido Hipúrico en Orina:
Valor normal: 0,44±0,2g/L (equivale aprox. A 0,7 g/g creatinina) (adultos no expuestos).
Valor normal: 1,5 g/g creatinina (adultos expuestos).
Máximo valor permisible: 2,5 g/g creatinina.
Luego de cuatro (4) horas del fin de la jornada: 3 mg/min.
Tolueno en Sangre Venosa:
Fin de la jornada: 1 mg/L (Cf).

6
Tolueno en Aire Exhalado (última porción):
Durante la jornada: 20 ppm (Cf).
Límite NIOSHREL: TWA (concentración máxima permisible) = 100 ppm (375mg/m 3),
ST=150 ppm (560mg/m3).
Límite OSHAPEL: TWA 200 ppm, C = 300 ppm, 500 ppm (pico máximo 10 minutos).
Nivel guía para fuentes de agua de bebida humana: 1.000 ug/L.

ÁCIDO HIPÚRICO.

Propiedades Físico-Químicas del ácido hipúrico:

1. Fórmula Empírica: C9H9NO3. O
2. Masa Molecular: 179,18 g/mol.
3. Solubilidad: Soluble en el agua. OH
4. Fórmula Estructural: NH
O

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO HIPÚRICO TOTAL EN ORINA.

Fundamento: (para determinar intoxicaciones con tolueno)

El método se basa en la extracción de los ácidos hipúricos totales de la orina con
una mezcla de éter etílico-etanol. Sacado el extracto en presencia de sílica gel, es tratado
con p-dimetil aminobenzaldehido, que con la ayuda del calor forma un compuesto
coloreado, al que se determina la concentración por la intensidad del color que es leída a
460 nm en el espectrofotómetro.

Reactivos:
1. Mezcle el éter etílico-etanol 9:1.
2. Cloruro de Sodio Ácido Clorhídrico.
3. Solución de frecuencia de ácido hipúrico 2 mg/mL. Se disuelven 0,2 g de ácido
hipúrico hasta 100 mL de agua bidestilada.
4. Sílica gel 60g para cromatografía de capa fina.
5. Reactivos de color. Se pesan 0,4 g de p-dimetiliminobenzaldehído y disolver en 10
mL de anhídrido acético, se añaden algunos cristales de acetato de sodio anhídrido.
Se prepara en el momento de análisis.
6. Timol (solución al 10 %). Se pesan 10 g de timol y se disuelven hasta 100 mL de
alcohol isopropílico.

Material:
Espectrofotómetro UV-visible. Baño de aceite. Agitador mecánico. Centrífuga.
Tubos centrífugos con tapa. Pipetas graduadas. Tubos de ensayo.

Muestreo y Muestra:
El trabajador estará expuesto como mínimo durante tres (3) días para tomar la
muestra. Se toma la orina durante las cuatro (4) últimas horas de la jornada laboral. Se le
añade como preservativo 0,5 mL de solución de timol. Se guarda en refrigeración para su

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ejecución que no excederá 48 horas después de la toma de la muestra. En congelación
puede conservarse durante un mes.

Procedimiento:
1. Tomar 10 mL de orina, verter en un tubo de ensayo y ajustar a pH 2 con Ácido
Clorhídrico.
2. Se toma 1 mL de orina y se pasa a un tubo de 10 mL con tapa y se satura con 0,3 g
de NaCl.
3. Se extrae dos (2) veces con 2 mL de la mezcla éter etílico-etanol para extraer el
ácido hipúrico.
4. Después de cada extracción se separa la capa superior a otro tubo de ensayo.
5. De los extractos unidos se toma 1 mL y se diluye con 9 mL de la mezcla éter etílico-
etanol en un tubo de ensayo.
6. Se toma 1 mL del extracto diluido y se vierte en un tubo de centrífuga con tapa que
contiene 0,5 g de sílica gel y el disolvente es eliminado por evaporación con
corriente de aire.
7. Cuando se ha evaporado todo el disolvente (que no presenta olor éter) se añade 1
mL del reactivo de color, se mezcla y se calientan los tubos en baño de aceite a 135
ºC por minutos.
8. Se deja enfriar y se hacen dos extracciones con 4 y 3 mL de alcohol etílico absoluto,
se centrífuga cada vez y se unen los extractos en otro tubo de centrífuga y se
centrífuga por 10 min. a 2.500 RPM.
9. El sobrenadante completamente transparente de color amarillo se pasa a un tubo de
ensayo y se leen las muestras contra el blanco a 460 nm en el espectrofotómetro.
Ensayo en Blanco: Se sigue todo el proceso pero utilizando agua bidestilada en vez de la
orina.

Gráfico de Calibración:

Sol. Ref. Ácido Hipúrico 2 Cont. de Ácido

Nº Agua Bidestilada
mg/mL Hipúrico (mg)
0 0 1 0
1 0,1 0,9 0,2
2 0,2 0,8 0,4
3 0,3 0,7 0,6
4 0,4 0,6 0,8
5 0,5 0,5 1,0

Nota: Se continúa como se indica en el procedimiento de las muestras. Se utiliza un punto

de la curva cuando se realizan las muestras. El punto es el correspondiente a un contenido
de ácido hipúrico de 0,6 mg.

Cálculos:
La concentración se calcula por la fórmula si se utiliza el gráfico de calibración.
C = DOM x F = g de Ácido Hipúrico Total/L
Si se utiliza el punto del gráfico de calibración:

8
 C = DOM x CP = gr de Ácido Hipúrico Total/L
DOP
Donde:
DOM: Densidad Óptica de la Muestra.
DOP: Densidad Óptica de la Solución de Referencia.
CP: Concentración del Punto de Referencia.
F: Factor del Gráfico de Calibración.

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO HIPÚRICO.

1. Preparar patrón 1 mL (Según Técnica)

1 2. Ajustar a pH 2 con HCl (conc.) 1 gota

3. Pesar 0,3 g NaCl

2 4. Realizar 2 extracciones con 2 mL mezcla éter-etanol (c/vez)

3 5. Colocar los extractos (4 mL aprox.)

4 6. Agregar 1 mL de los extractos

7. Agregar 9 mL de mezcla éter-etanol

8. Pesar 50 mg de Sílica gel

9. Agregar 1 mL de la solución anterior
10. Secar con aire
11. Agregar 1 mL de reactivo de color
5 12. Llevar a Baño glicerina 135 ºC por minuto y enfriar a T. A.
13. Al enfriar, agregar 4 mL de etanol y centrifugar (5 min. a 2.500 rpm)
14. Separar sobrenadante y agregar en otro tubo (Tubo Nº 6)
15. Agregar 3 mL de etanol (en Tubo Nº 5) y centrifugar (5min a
2.500 rpm)
16. Separar sobrenadante y agregar en tubo Nº 6

6 17. Centrifugar los sobrenadantes (7 mL aprox.) por min. a 2.500 rpm

18. Tomar 5 mL del sobrante con pipetas pasteur y agregar en tubo Nº 7

7 19. Leer a 460 nm

9
Nota:
Tubos Nº 1, 3 y 7: tubos de ensayo con tapa de goma.
Tubo Nº 2: tubos con tapa de rosca pequeños.
Tubos Nº 4 y 5: tubos con tapa de rosca grande.
Tubo Nº 6: tubos centrífuga de tapa azul.

BIBLIOGRAFÍA.

Fiorenza B. G, González D., Pérez A., Ridalfi A., Srobl A. (2007). Manual de
Procedimientos Analíticos Toxicológicos para Laboratorios de Baja Complejidad.
Argentina.

Brizuela Julissa, Jiménez Ygmar. Niveles urinarios de fenol y ácido hipúrico en

trabajadores de una empresa de pintura automotriz. Salud de los Trabajadores  . 2010; 
18(2): 107-116.

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