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RESOLUCIÓN EJERCICIOS DE INHIBICIÓN-ACTIVACIÓN Y EFECTOS DE
pH
Bioquímica, Grupo 03 Dra. Rosario A. Muñoz Clares
1. Expliquen qué es una constante de inhibición (Ki) y cuales tipos existen.

Respuesta: La constante de inhibición es la constante de disociación del complejo
que la enzima forma con el inhibidor, y por tanto es la concentración del inhibidor
que satura al 50% a la especie de la enzima que lo une. Existen dos tipos: 1)
constante de inhibición competitiva (Kic) que es la constante de disociación del
complejo E-I, y por tanto Kic = [E][I]/[E-I], y 2) constante de inhibición
incompetitiva (Kii) que es la constante de disociación del complejo E-S-I, y por
tanto Kii = [ES][-I]/[E-S-I].
2. Expliquen cuáles son las consecuencias de que un inhibidor sólo pueda unirse al
complejo E-S y no a la enzima libre, y cómo podemos conocer que esto ocurre.
¿Cómo se llama a este tipo de inhibición?
Respuesta: Si el inhibidor solo se une al complejo E-S no puede impedir que se una
el sustrato a la enzima, por el contrario facilita su unión al desplazar el equilibrio
que existe entre las formas libres de la enzima y el sustrato hacia el complejo E-S.
Lo que sí hace es impedir que se forme el producto. A consecuencia de todo esto, el
inhibidor disminuye Vmax, no afecta a Vmax/Km y disminuye la Km. Si cuando
estudiemos los efectos de un inhibidor sobre la velocidad de la reacción catalizada
por una enzima observamos estos efectos sobre los parámetros cinéticos, sabremos
que el inhibidor es de tipo incompetitivo. En la ecuación de velocidad en presencia
de este inhibidor se puede observar que tanto Vmax como Km disminuyen por el
mismo factor (1 + [I]/Kii), es decir, disminuyen en función de la concentración del
inhibidor relativa al valor de su constante de disociación incompetitiva. Un gráfico
de dobles recíprocos (inversa de la velocidad inicial frente a la inversa de la
concentración del sustrato variable) muestra un patrón de inhibición en el que
todas las líneas son paralelas (es decir, las líneas que se obtienen a partir de los
datos en presencia de diferentes concentraciones fijas del inhibidor incompetitivo y
la línea obtenida con los datos en ausencia del inhibidor tienen todas la misma
pendiente ya que no cambia Vmax/Km ).
Considerando una ruta metabólica, el efecto sobre el flujo de esta ruta que un
inhibidor incompetitivo de una de su enzimas tendría es muy grande, porque esta
inhibición se facilita por el aumento de la concentración del sustrato de esta enzima
que al ser inhibida no lo puede convertir a producto y ese sustrato le sigue siendo
provisto por la enzima anterior en la ruta metabólica. De esta forma, el complejo
E-S aumenta y el inhibidor incompetitivo tiene a su disposición una mayor
concentración de la especie de la enzima a la que se une, lo que lógicamente
aumenta el grado de inhibición que produce. Esto es contrario al efecto que tendría
un inhibidor competitivo, cuya inhibición sería contrarrestada por el aumento de la
concentración del complejo E-S y la disminución consiguiente de la [E] libre que es
la especie a la que puede unirse este tipo de inhibidor.
3. Dibujen la gráfica de dobles recíprocos que muestre un patrón de inhibición mixta
indicando cuál o cuáles parámetro(s) cinético(s) se afecta(n), qué significa el que se
afecte(n) en términos del mecanismo de la inhibición, y cómo se observan los
cambios de los parámetros en la gráfica.
Respuesta: El inhibidor mixto se une tanto a la enzima libre (E) como al complejo
que forma con el sustrato (E-S) y por ello disminuye tanto Vmax /Km como Vmax,
mientras que Km aumenta si el inhibidor se une mejor a E que a E-S, o disminuye si
el inhibidor se une mejor a E-S que a E. Esto es porque Km aparente = Km (1 +
[I]/Kic)/(1 + [I]/Kii). Si la unión previa del sustrato a la enzima estorba, pero no
impide, la unión del inhibidor, la constante de disociación Kic será menor que Kii
(el efecto competitivo de este inhibidor será mayor que su efecto incompetitivo).
Por el contrario, si la unión previa del sustrato a la enzima facilita la unión del
inhibidor, la constante de disociación Kic será mayor que Kii (el efecto
incompetitivo de este inhibidor será mayor que su efecto competitivo). Recordar
que un menor valor de Ki significa mayor afinidad de la enzima por el inhibidor.
Usando gráficas de dobles recíprocos, podemos por tanto obtener dos patrones de
inhibición en los que las líneas se cruzan a la izquierda del eje de ordenadas, pero
en el segundo cuadrante si Kic<Kii o en el tercer cuadrante si Kic>Kii.
Kic<Kii Kic>Kii
4. ¿Qué nos dice sobre el mecanismo de la reacción catalizada por una enzima que
Vmax/Km para un determinado sustrato aumente cuando el pH del medio de ensayo
aumenta?
Respuesta: Este resultado indica: (1) que los protones son inhibidores competitivos
de la enzima; (2) que por tanto, los protones se unen a un grupo ionizable de una
cadena lateral de un residuo del sitio activo que participa en la unión del sustrato
con la enzima; y (3) que este grupo debe estar desprotonado para poder unir al
sustrato.
EJERCICIOS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA: PARÁMETROS CINÉTICOS
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE ENZIMAS
Bioquímica, Grupo 03 Dra. Rosario A. Muñoz Clares
1. ¿Cuáles son las condiciones experimentales que debemos usar en la

determinación de los parámetros cinéticos de una enzima para un determinado
sustrato?
Respuesta: Para que la ecuación de Michaelis-Menten pueda aplicarse y podamos
determinar los parámetros cinéticos, debemos: 1) usar una concentración fija de
enzima mucho menor que cualquiera de las concentraciones del sustrato; 2) medir
siempre velocidades iniciales de la reacción; 3) no añadir el(los) producto(s) de la
reacción al medio de ensayo; y 4) variar la concentración de sustrato en un
intervalo de 0.2Km a 10Km.
2. Expliquen el significado de Vmax, kcat, Km, Vmax/Km y kcat/Km

Respuesta:
Vmax: velocidad inicial límite que se alcanza cuando toda la enzima tiene unido al
sustrato (está saturada al 100%) y está realizando la catálisis. El valor de Vmax
depende de kcat y de la [E]total (Vmax = kcat ´ [E]total).
kcat: constante de velocidad de orden 1 que determina la velocidad con la que se
forma el producto a partir del complejo E-S. Si su valor es afectado por alguna
condición experimental, sabremos que esa condición afecta a los pasos de
formación del producto que ocurren después de que se ha formado el complejo E-S.
Km: concentración del sustrato a la que el 50% de la enzima tiene unido el sustrato
y por tanto la enzima está saturada al 50% y se tiene la mitad de la Vmax. Nos indica
la afinidad de la enzima por un sustrato.
Vmax/Km: constante de velocidad de orden 1 llamada constante de especificidad
porque indica cual de dos o más de dos sustratos alternos de una determinada
enzima es su mejor sustrato. Es decir, con cuál de ellos, todos a igual
concentración, es mayor la velocidad de la reacción catalizada.
kcat/Km: constante de velocidad de orden 2 del paso de unión de la enzima y el
sustrato y que por tanto determina la velocidad con la que ocurre este paso y se
forma el complejo E-S a una determinada concentración de sustrato y enzima. Si su
valor es afectado por alguna condición experimental, sabremos que esa condición
afecta a la unión del sustrato y de la enzima. También indica la eficiencia catalítica
de una enzima, es decir qué tan buen catalizador es. El valor máximo que puede
alcanzar kcat/Km es » 108 M-1 s-1. kcat/Km puede también usarse como constante de
especificidad en lugar de Vmax/Km.
3. Dibujen las gráficas de dobles recíprocos con los resultados teóricos de los
siguientes experimentos (razonen breve y claramente la respuesta):
a. saturación por un mismo sustrato a dos diferentes concentraciones de la
enzima.
b. saturación de una enzima con dos sustratos alternativos para conocer
cuál de ellos es el mejor sustrato.
Respuesta:
a) Puesto que el valor de Km no depende de la concentración de enzima, mientras
que el valor de Vmax es directamente proporcional a esta concentración, en un
gráfico de dobles recíprocos en que se muestren los resultados del experimento del
enunciado debemos obtener dos líneas que tengan diferente intersecto en el eje de
ordenadas e igual intersecto en el eje de abscisas, como lo muestra la siguiente
figura. La línea que corresponde a la concentración más alta de la enzima será la
que tenga el menor valor del intersecto en el eje de ordenadas (lo que indica mayor
Vmax). En este ejemplo [E]2 > [E]1. Observen que a cualquier [S] la v0 es mayor
para [E]2 que para [E]1.
b) Si llamamos A y B a dos sustratos alternativos para una determinada enzima,

el mejor sustrato (es decir, aquél que a igual concentracion de todos dará la
mayor velocidad de la reacción) será el que tenga la mayor constante de
especificidad (Vmax /Km o kcat/Km) y por tanto el que tenga una menor pendiente en
la gráfica de dobles recíprocos. Pueden ocurrir tres casos: que ambos sustratos
tengan igual Vmax pero diferente Km (Ejemplo 1), que ambos tengan diferente Vmax
pero igual Km (Ejemplo 2), o que ambos tengan diferente Vmax y diferente Km
(Ejemplo 3). En todos los ejemplos el sustrato B es el mejor de los dos sustratos.
Nótese que aunque un sustrato tenga mayor afinidad que otro (caso del sustrato
A en el Ejemplo 4) no por eso será el que produzca mayor velocidad de la
reacción.

Ejemplo 4
NECESIDAD DE LA BIOCATÁLISIS
• Las velocidades, no los cambios en energía libre, son las que

controlan el curso de las reacciones bioquímicas en el
metabolismo.
• La mayoría de las reacciones bioquímicas no ocurren a velocidad

apreciable si no son catalizadas.
• De aquí la necesidad de la catálisis para incrementar sus

velocidades.
La catálisis en las células la llevan a cabo las enzimas
Rosario A. Muñoz-Clares
ENZIMAS
Las enzimas son catalizadores biológicos que

aumentan las velocidades de las reacciones que
tienen lugar “in vivo”
Como todo catalizador, las enzimas no se modifican

ni se consumen por la reacción, de manera que
terminan un ciclo catalítico en la misma forma y a
igual concentración que lo empiezan
NECESIDAD DE LA BIOCATÁLISIS
¿Por qué la gran mayoría de las reacciones en los seres

vivos son tan lentas que necesitan ser catalizadas
para que ocurran a una velocidad apreciable?
– Porque si fuesen más rápidas llegarían al

equilibrio químico y la vida requiere de reacciones
alejadas del equilibrio químico para obtener la
energía libre que usan los procesos biológicos.
– Porque así la célula puede regular en forma

diferencial la velocidad de sus reacciones,
regulando la actividad de los catalizadores
(enzimas) de cada una de ellas.
VENTAJAS DE LAS ENZIMAS SOBRE LOS
CATALIZADORES INORGÁNICOS
• EFICIENCIA
• CONDICIONES SUAVES DE REACCIÓN
• ESPECIFICIDAD DE LA REACCIÓN
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN
Eficiencia de la catálisis enzimática
¿Qué tanto aceleran las enzimas las velocidades de las

reacciones que catalizan?
La reacción en la que una molecula de orotidina monofosfato

pierde un CO2 ocurre 1017 veces más rápida cuando es
catalizada por la enzima orotidina monofosfato descarboxilasa
que cuando no es catalizada.
1017 = 100.000.000.000.000.000
LA REACCIÓN CATALIZADA ES CIEN MIL BILLONES DE

VECES MÁS RÁPIDA!!!!
•El ejemplo anterior es un caso extremo, pero por lo

general, las enzimas incrementan la velocidad de las
reacciones que catalizan más de un millón de veces.
•Y esto lo hacen bajo condiciones de reacción muy
suaves: temperaturas moderadas, valores de pH
cercanos a la neutralidad, presión atmosférica y
fuerzas iónicas moderadas.
Especificidad de la catálisis enzimática
• La catálisis enzimática requiere:

– Unión específica a la enzima de las moléculas de
sustrato y de moléculas reguladoras.
– Reactividad específica de la enzima con el(los)
sustrato(s).
• De manera que si un sustrato puede sufrir diferentes

reacciones, existe una enzima específica para este
sustrato y para cada una de sus reacciones.
Unión específica
• Las moléculas que van a

reaccionar, es decir los
sustratos, se unen a una
cavidad en la superficie de la
enzima llamada sitio activo.
• La unión entre el sustrato y la

enzima se establece mediante
los mismos enlaces débiles que
participan en la estabilización
de la estructura tridimensional
nativa de las proteínas.
• La unión es por tanto

reversible.
TEORÍAS DE UNIÓN ESPECÍFICA DEL
SUSTRATO
• Existen dos teorías para explicar la unión específica:
– TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA

• El sitio de unión está preformado en la enzima y sólo
aquellos sustratos con complementariedad química y
geométrica pueden unirse.
– TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO

• El sitio de unión no está totalmente preformado en la
enzima y sólo aquellos sustratos que después de una
interacción inicial inducen los cambios
conformacionales apropiados pueden unirse y que
ocurra la reacción.
TEORÍA DE LA LLAVE Y LA CERRADURA
Sustrato
Sitio
activo
Complejo E-S
Enzima
TEORÍA DEL AJUSTE INDUCIDO
Sustrato
Sitio
activo
Complejo E-S
Enzima
ESTADOS CONFORMACIONALES DE LA HEXOCINASA
• La enzima hexocinasa, que cataliza la fosforilación de la glucosa formando
glucosa 6-fosfato, posee dos conformaciones nativas según tenga o no glucosa
unida.
• El cambio conformacional que experimenta esta enzima es inducido por la unión
de la glucosa, y consiste en el movimiento de un dominio con respecto al otro, lo
que cierra el sitio activo donde se lleva a cabo la reacción.
• Este cambio conformacional es fundamental para la función catalítica de esta
enzima, ya que el sitio activo se cierra excluyendo al agua y evitando así la
transferencia del grupo fosforilo del ATP a una molécula de agua, lo que de
ocurrir resultaría en la hidrólisis inútil del ATP.
Glucosa Rosario A. Muñoz-Clares

COFACTORES ENZIMÁTICOS
¿Pueden las enzimas llevar a cabo la catálisis por sí

mismas?
• No siempre, dado que el número del tipo de

reacciones que pueden experimentar las cadenas
laterales de los aminoácidos es limitado.
• Por ello necesitan en muchas ocasiones de la ayuda

de moléculas no proteicas llamadas cofactores.
TIPOS DE COFACTORES ENZIMÁTICOS
• METALES
• COENZIMAS
Ambos pueden ser:
• Solubles
Apoenzima (si no lo tiene;
• Grupos prostéticos no funcional)
Holoenzima (si sí lo tiene;
funcional)
COENZIMAS
• Son moléculas orgánicas no proteicas que ciertas enzimas
necesitan para llevar a cabo la catálisis.
• En el caso de ser una coenzima soluble, se une y desune
de la enzima en cada ciclo catalítico. Por ello, pueden ser
compartidas por muchas enzimas que lleven a cabo un
mismo tipo de reacción.
• En el caso de ser un grupo prostético, la molécula de la
coenzima está siempre unida a la enzima, pero diferentes
enzimas que catalizan el mismo tipo de reacción pueden
usar la misma coenzima como grupo prostético.
TANTO LA COENZIMAS SOLUBLES COMO LOS GRUPOS PROSTÉTICOS SE

MODIFICAN DURANTE LA REACCIÓN.
POR ELLO PUEDEN CONSIDERARSE COMO SUSTRATOS Y PRODUCTOS DE LA
REACCIÓN.
COENZIMAS Y COFACTORES METÁLICOS
• A pesar de que en la
célula existen muchas
enzimas que requieren
coenzimas para llevar
a cabo la catálisis, el
número de diferentes
coenzimas es limitado
porque cada una de
ellas se usa en
muchas reacciones
del mismo tipo.
• Igualmente, sólo
unos pocos metales
son los cofactores
enzimáticos más
frecuentes.
LAS VITAMINAS HIDROSOLUBLES SON PRECURSORES DE
COENZIMAS O SON COENZIMAS
CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS
• Se clasifican de acuerdo a la reacción que catalizan. Y estos son las seis
tipos de reacciones principales que se dan en los seres vivos.
• Recientemente se ha añadido la clase 7. Las enzimas de esta clase

catalizan el movimiento de iones o moléculas a través de membranas o
su separación dentro de las membranas.
CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS
ALCOHOL DESHIDROGENASA
EC 1.1.1.1
• Clase: 1 (oxidorreductasa)
• Subclase: 1 (actúa sobre un sustrato que posee
un grupo CH-OH como donador de electrones)
• Subsubclase: 1 (NAD+ o NADP+ es la coenzima
aceptora de electrones)
• Orden dentro de la subsubclase: 1 (primera
enzima de este grupo)
Estudio de las reacciones catalizadas por enzimas
• Como todas las reacciones, las catalizadas por las enzimas las
podemos estudiar desde un punto de vista termodinámico o
cinético.
• La termodinámica estudia únicamente sistemas que se
encuentran en equilibrio; es decir, sistemas cuyas variables
termodinámicas no varían con el tiempo, y estudia el cambio
sufrido por las variables del sistema entre dos estados
diferentes (inicial y final).
• La cinética química estudia las velocidades de las reacciones y
como éstas cambian bajo diferentes condiciones. Por tanto,
estudia cambios que se dan en el tiempo.
Cinética versus termodinámica
• Las reacciones proceden espontáneamente si hay un descenso en

la energía libre cuando la temperatura y la presión se mantienen
constantes. Se dice que estas reacciones son termodinámicamente
posibles.
• Muchas reacciones bioquímicas que son termodinámicamente

posibles ocurren a velocidades despreciables, es decir son
cinéticamente imposibles.
¿Por qué?
Cinética versus termodinámica
• Lo que determina si una reacción es termodinámicamente

posible es el valor del cambio en energía libre de Gibbs
(G) de la reacción.
• Lo que determina si una reacción es cinéticamente

posible es el valor del cambio en la energía libre del
estado de transición (∆G‡), es decir la energía de
activación de la reacción.
REPASO DE ENERGÍA LIBRE DE GIBBS (G)
• La energía libre es una función de estado característica de cada
molécula y por ello su variación en una reacción es
independiente del camino o del mecanismo seguido para
producirla.
• No podemos determinar la energía libre real de ninguna
molécula, pero podemos determinar el cambio en energía libre
(G) de una reacción.
G = Gproductos - Greactivos
• El G es el cambio de energía libre de un sistema que se

transforma a presión y temperatura constantes.
• El G está relacionado con otras dos funciones de estado, la
entalpía y la entropía.
G = H - TS
• El G depende tanto de la naturaleza de los reactivos (Go)
como de sus concentraciones reales (no al equilibrio)
G = Go + RT ln([productos]/[reactivos])
Rosario A. Muñoz Clares
Go y G’o
• Go es el cambio de energía libre estándar de una

reacción cuando cada uno de los reactantes está a
concentración de 1.0 M, a una temperatura de 25 oC y a
presión de una atmósfera.
• G’o es el cambio de energía libre estándar a pH 7.0, es

decir a una [H+] = 10-7 M. Se le conoce como el cambio de
energía libre estándar bioquímico.
• Ambos, están relacionados con la constante de equilibrio:

Go = - RTlnKeq
G’o = - RTlnK’eq
K’eq es el valor obtenido a pH 7 y a 55.5 M de H2O

CAMBIO DE ENERGÍA LIBRE DE GIBBS (G)
• El G nos permite conocer la dirección en que una reacción
ocurrirá en forma espontánea, así como el rendimiento o costo
energético de una reacción.
– G negativo: reacción exergónica, termodinámicamente

posible.
– G positivo: reacción endergónica, termodinámicamente

imposible.
– G cero: reacción en el equilibrio.
• El G depende sólo del valor de energía libre entre los estados

basales de los reactantes y productos de la reacción y no del
mecanismo molecular o del camino por el que el reactante se
convierte en producto.
• Por tanto, no nos informa sobre la velocidad de la reacción.

CAMBIO DE ENERGÍA LIBRE DE GIBBS (G)
• Una reacción en un ser vivo tiene el mismo cambio en

energía libre que esa reacción “in vitro”.
• Ello se debe a que el G depende sólo del estado final e

inicial del sistema y no del mecanismo o camino por el
que el sistema pasa del estado inicial al estado final.
• Por ejemplo, la combustión de glucosa a CO2 y H2O lleva

consigo el mismo G independientemente de si se realiza
en un calorímetro o en el interior de una célula viva.
• Lo que cambia, aumenta, en la reacción que ocurre en el

ser vivo es la velocidad de la reacción debido a una
disminución de su energía de activación por efecto de la
catálisis enzimática.

Cinética vs termodinámica
Energía libre Estado de transición
Estado
basal Estado
basal
Coordenadas de reacción
• El cambio negativo en energía libre (G’o), o lo que es lo mismo un valor mayor de
uno de la constante de equilibrio (Keq), nos dice que la reacción procede
espontáneamente de S a P. Rosario A. Muñoz-Clares
Energía libre Estado de transición
Estado
basal Estado
basal
Coordenadas de reacción
• La velocidad de una reacción está determinada por su energía de activación
(G‡), no por su G’o (o la constante de equilibrio).
LAS ENZIMAS NO MODIFICAN LAS CONSTANTES
DE EQUILIBRIO
• Las enzimas son catalizadores biológicos que disminuyen la energía

de activación de las reacciones que catalizan, pero no modifican el
cambio de energía libre de la reacción y por tanto no modifican la
constante de equilibrio.
k1
S P
k-1
v+1 = k+1[S] v-1 = k-1[P]
En el equilibrio v+1 = v-1 , por tanto
k-1[P]eq = k+1[S]eq , Keq = [P]eq / [S]eq = k+1/k-1
• Debido a que no pueden alterar la Keq, las enzimas aumentan por el

mismo factor el valor de las dos constantes de velocidad de este
equilibrio. En consecuencia,
Las enzimas aceleran en igual proporción la velocidad de la reacción
reversible en las dos direcciones
Formación de complejos enzima-sustrato y
enzima-producto
• La catálisis enzimática requiere que la(s) molécula(s) que va(n) a
reaccionar se unan a la enzima.
S P
E + S E + P
E + S E-S E-P E + P
• Este es el mecanismo mínimo de una reacción catalizada por enzimas

Reacción catalizada versus no catalizada
no-cat
• Las enzimas, como cualquier catalizador incrementan notablemente la

velocidad de las reacciones químicas porque disminuyen la energía de activación
sin ser modificadas o consumidas en la reacción.
• La velocidad de la reacción será la del paso con mayor energía de activación,
que es el más lento.
Formas de acelerar una reacción
• La velocidad de una reacción puede incrementarse si una mayor

proporción de moléculas tiene la suficiente energía para superar la
barrera energética de la energía de activación. Esto se consigue:
• Usando un catalizador que disminuya la energía de activación.
• Aumentando la temperatura (T) del medio de reacción.
EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA ENERGÍA DE
ACTIVACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE LAS
REACCIONES CATALIZADAS
• De acuerdo a la ecuación de Arrhenius el valor de la constante de
velocidad de la reacción aumenta tanto con un aumento de la
temperatura como con una disminución de la energía de activación.
k = k´ e-G‡ /RT
• Como ocurre con cualquier

reacción química, la
temperatura aumenta la
velocidad de las reacciones
catalizadas, pero en el caso
de las enzimas sólo hasta que
se produce la
desnaturalización de la
enzima.
Mecanismos de catálisis enzimática
¿Cómo logran las enzimas disminuir la

energía de activación y así producir
incrementos tan grandes de la velocidad de
las reacciones que catalizan?
Estrategias de las enzimas para disminuir la
energía de activación de la reacción catalizada
• Disminuir la entropía de activación mediante efectos de

proximidad, orientación e inmovilización de los
reactivos
• Estabilizar el estado de transición
• Desestabilizar el complejo enzima-sustrato
• Incrementar o cambiar el número de pasos de la

reacción, cada uno de ellos con una menor energía de
activación que el(los) paso(s) de la reacción no
catalizada.
LAS ENZIMAS APROXIMAN A SUS SUSTRATOS
Sustratos
Enzima
Producto
LAS ENZIMAS ORIENTAN E INMOBILIZAN A SUS
SUSTRATOS
Sustratos
Enzima
Producto
ESTABILIZACIÓN DEL ESTADO DE TRANSICIÓN
• Las enzimas estabilizan los estados de transición uniéndolos
mejor que a los sustratos.
Tipos de catálisis enzimática
• Las enzimas usan todos los recursos de los catalizadores para
estabilizar los estados de transición y/o crear nuevas rutas de
reacción con pasos que tengan menores energías de activación:
• CATÁLISIS ÁCIDO-BÁSICA
• CATÁLISIS ELECTROSTÁTICA
• CATÁLISIS COVALENTE
• CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS
Catálisis ácido-básica
• La catálisis ácida general consiste en la transferencia de un

protón desde un residuo de la enzima, que se comporta como un
ácido de Brønsted, al sustrato o intermediarios de la reacción,
disminuyéndose así la energía libre del estado de transición.
• La catálisis básica general consiste en la transferencia de un
protón desde el sustrato o intermediarios de la reacción a un
residuo de la enzima, que se comporta como una base de
Brønsted, disminuyéndose así la energía libre del estado de
transición.
• Si se dan ambos tipos de catálisis se tiene una catálisis ácido-
básica concertada. Esto es lo que ocurre en la catálisis
enzimática porque al terminar la reacción la enzima debe estar en
la misma forma con la que empieza.
• Dado el valor de su pKa cercano al pH fisiológico, la His es el
aminoácido que más frecuentemente participa en catálisis ácido-
básica, aunque también pueden participar Glu y Asp.
Catálisis electrostática
• La enzima estabiliza intermediarios o estados de

transición de la reacción por neutralización de cargas
gracias a la disposición espacial en el sitio activo de
residuos con carga opuesta.
• En otros casos la distribución de cargas en el sitio activo

sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus
sitios de unión.
• En este tipo de catálisis participan residuos de

aminoácidos que posean carga (negativa o positiva) a pH
fisiológico, tales como Asp, Glu, Lys, Arg e His.
Catálisis covalente
• La enzima forma transitoriamente un enlace covalente con el

sustrato.
• La catálisis covalente consiste en tres pasos sucesivos:
– Ataque nucleofílico de un residuo de la enzima sobre el sustrato
(formación del enlace covalente).
– Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formación
del producto).
– Liberación del producto y regeneración de la enzima libre
(ruptura del enlace covalente, por ejemplo, por hidrólisis).
• En catálisis covalente participan residuos que pueden actuar
como nucleófilos, principalmente Cys, Ser, Tyr, His, Lys, Glu,
Asp.
• Un ejemplo de este tipo de catálisis lo constituyen las
proteasas de serina o de cisteína.
La quimotripsina como ejemplo de catálisis
covalente
• Pertenece al grupo de enzimas conocido como serín

proteasas o proteasas de serina.
• Se llaman así porque en su sitio activo poseen un residuo
de Ser esencial para la catálisis.
• Otros dos residuos catalíticos importantes son una His y un
Asp. Los tres residuos forman la llamada triada catalítica.
• Rompe enlaces peptídicos cuyo grupo carbonilo pertenezca
a un residuo aromático.
• Es una endoproteasa, es decir rompe enlaces peptídicos
situados en el interior de la cadena polipeptídica.
Mecanismo catalítico de la quimotripsina
Triada catalítica Triada catalítica
• El grupo hidroxilo de la Ser catalítica se “activa” por abstracción de

un H+ por la His catalítica, formándose así un buen nucleófilo.
• La cadena polipeptídica
sustrato se une
específicamente al sitio
activo y se produce el
ataque nucleofílico de la
Ser catalítica sobre el
carbono del carbonilo
del enlace peptídico que
se va a romper.
• Se forma un intermediario
tetraédrico del sustrato
unido covalentemente a la
enzima, apareciendo un
oxianión inestable.
• El rearreglo electrónico de
este intermediario lleva a la
ruptura del enlace peptídico.
• La catálisis ácida por la His

catalítica, que cede un protón
al grupo saliente, facilita la
ruptura del enlace peptídico.
• Una vez que sale del sitio

activo uno de los dos
fragmentos en que se
rompió la cadena
polipeptídica, aún queda el
otro fragmento unido
covalentemente a la enzima.
• Se “activa” una molécula

de H2O por catálisis básica
de la His catalítica que le
abstrae un protón.
• De esta forma, la molécula

de H2O se convierte en un
ion hidróxido que es un buen
nucleófilo y realiza un ataque
nucleofílico sobre el carbono
del carbonilo del
intermediario unido
• Se forma un nuevo
intermediario tetraédrico y
aparece de nuevo un
oxianión inestable.
• El rearreglo electrónico de
este intermediario lleva a la
ruptura del enlace covalente
con la enzima.
• La His catalítica protonada

cede un protón a la Ser
catalítica, lo que permite que se
regenere la enzima y que se
forme y salga del sitio activo el
segundo fragmento de los dos
en que se rompió la cadena
polipeptídica sustrato de la
proteasa.
Estabilización del intermediario oxianión en la reacción
catalizada por la quimotripsina
• El oxianión del
intermediario
tetraédrico
se estabiliza
formando dos
puentes de
hidrógeno con la
proteína.
Funciones de los iones metálicos en la
catálisis enzimática
• Mediar reacciones de óxido-reducción
(transferencia de electrones).
• Apantallar cargas negativas de los sustratos o

coenzimas para facilitar la unión y/o la catálisis.
• Neutralizar cargas negativas de los sustratos,

intermediarios o estados de transición de la
reacción.
• Promover la catálisis nucleofílica mediada por

agua favoreciendo su ionización.
• Apantallar cargas negativas de los sustratos o

coenzimas para facilitar la unión y/o la catálisis
– Algunos compuestos se unen un al sitio activo de la
enzima como complejo con un metal, generalmente Mg2+.
– Ejemplo de ellos son los nucleótidos ATP y ADP que

forman complejos con Mg2+ muy estables. El verdadero
sustrato de las reacciones en las que participan no es el
nucleótido libre sino el complejo nucleótido- Mg2+.
COMPLEJO ATP-Mg2+
• El complejo ATP-Mg2+ es la verdadera coenzima de

las enzimas que usan al ATP como donador de un
grupo fosfato (cinasas).
• Ello se debe a que el Mg2+ apantalla las cargas de los

grupos fosfato y eso permite que puedan
acercársele los nucleófilos que atacan al átomo de
fósforo en la reacción de transferencia del grupo
fosfato; de otra forma sus pares de electrones serían
repelidos.

COMPLEJO ATP-Mg2+ EN EL SITIO ACTIVO DE
UNA ENZIMA

• Neutralizar cargas negativas en intermediarios o

estados de transición
– Aunque los sustratos de la reacción sean neutros,
durante el transcurso de la reacción pueden surgir
intermediarios o estados de transición con cargas
negativas que son estabilizados por un ion metálico,
generalmente Mg2+, facilitando de esta forma el avance
de la reacción hacia el producto.
• Promover la catálisis nucleofílica mediada por agua

favoreciendo su ionización
– El ion hidróxido es un buen agente nucleofílico pero su
concentración en un medio acuoso a pH neutro es muy
baja.
– Ciertos metales, muy frecuentemente Zn2+, que son
grupos prostéticos del sitio activo de algunas enzimas,
están coordinados a una molécula de agua y de esta
forma aumentan notablemente su acidez, permitiendo así
que la molécula de agua esté como ion hidróxido a pH
neutro.
– La función de este metal es por ello incrementar la
concentración de iones hidróxido en el sitio activo de la
enzima que use a este ion como agente nucleofílico en la
catálisis.. Rosario A. Muñoz-Clares
• Promover la catálisis nucleofílica mediada por agua

favoreciendo su ionización
– La coordinación de una molécula de agua a un ion metálico como el Zn2+
disminuye mucho su pKa y permite que esté desprotonada en una gran
proporción a pH fisiológico.
pKA del agua bulto = 14
Reacción catalizada por enzimas
¿Cómo medimos la catálisis enzimática?
• Determinando la velocidad de la reacción catalizada,

lo que se hace midiendo cuanto sustrato desaparece o
cuanto producto aparece por unidad de tiempo y
refiriendo esta velocidad a la cantidad de enzima que la
produce.
• No siempre, dado que el número del tipo de

reacciones que pueden experimentar las cadenas
laterales de los aminoácidos es limitado.
UNIDADES DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Actividad
Unidad Internacional (U) = mol producto formado/min
Katal = mol producto formado/s
μkatal = mol producto formado/s
Actividad específica
U/mg proteína
Katal/mg proteína (μkatal/mg proteína)
• La actividad de una enzima es la cantidad de producto formado o

sustrato consumido por unidad de tiempo en la reacción que cataliza.
•La actividad específica de una enzima es la actividad por unidades de
masa de la enzima expresada como mg de proteína.
•Para reportar las actividad de una enzima es recomendable hacerlo como
actividad específica
Necesidad de medir velocidades iniciales
Para conocer la actividad de la enzima tenemos que
medir la velocidad de la reacción catalizada, pero ¿es
conveniente medir la velocidad en cualquier tiempo de la
reacción?
• No, porque es difícil asignar esta velocidad a una

concentración dada de sustrato (podemos no saber cual es
esta concentración, o existir ya una importante concentración
de producto presente que esté dando lugar a la reacción
inversa).
• Necesitamos por esto medir la velocidad inicial (v0), que es el

valor de la pendiente de la tangente a la curva de progreso de
la reacción en el tiempo cero de la reacción, cuando
conocemos la concentración de sustrato y no hay producto
presente. Rosario A. Muñoz-Clares
CURSO TEMPORAL DE UNA REACCIÓN
• El progreso de una reacción • La velocidad de la
se ajusta a una curva reacción a cualquier
exponencial tiempo es la tangente a
v = k[S] la curva exponencial en
ese tiempo.
• La velocidad de una
reacción disminuye a
medida que ésta
progresa porque va
disminuyendo la
concentración de los
reactantes, y porque si
la reacción es
reversible se da la
reacción inversa hasta
que se alcanza el
equilibrio.
CURSO TEMPORAL DE UNA REACCIÓN
• La velocidad inicial es
la tangente a la curva
v = k[S] exponencial en el
tiempo cero de la
reacción, que es el
tiempo al que
conocemos la
concentración de
sustrato y no hay aún
producto presente.
• Se determina
midiendo el cambio en
la concentración de
producto o sustrato
que es linear con el
tiempo.
Reacción catalizada por enzimas
A) Reversible
k1 k2 k3
E + S E-S E-P E + P
k-1 k-2 k-3
• El estudio de la cinética de la reacción se simplifica si experimentalmente la
hacemos irreversible, midiendo velocidades iniciales en ausencia del producto
B) Irreversible simplificada (cuando [P] es cero)
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
• Los pasos que ocurren después de la unión del sustrato son de primer orden y para
efectos prácticos los reunimos en un solo paso cuya constante de velocidad es kcat .
El ciclo catalítico podemos dividirlo en dos eventos
1) Unión del sustrato y de la enzima para formar el complejo E-S
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
2) Formación y liberación del producto a partir del complejo E-S
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
ECUACIÓN DE VELOCIDAD
• Para relacionar los cambios en velocidad inicial de la reacción con la
concentración de sutrato, [S], necesitamos una ecuación de velocidad.
• No catalizada k
S P
v = k[S]
• Catalizada por una enzima

k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
v = kcat[E-S]
Puesto que la formación del producto depende de cuanto E-S se haya formado, y no
de cuanto S se puso, la velocidad de la reacción catalizada es directamente
proporcional a la [ES] Rosario A. Muñoz-Clares
ECUACIÓN DE VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
CATALIZADA POR ENZIMAS
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
Puesto que el producto se forma a partir de E-S,
v0 = kcat[E-S]
¿[E-S]?
• La ecuación de velocidad hay que expresarla en términos de [E]total y de [S]
que son las concentraciones que conocemos.
• Cuanto [E-S]/[E]total se forme depende de [S] y de la afinidad de E por S,
medida por la Kd del complejo E-S, de acuerdo a la siguiente ecuación:
[E-S] = [E]total[S]/(Kd + [S])
•Despejando [E-S] y sustituyendo su valor en la anterior ecuación de
velocidad, obtenemos la ecuación de velocidad en función de [E]total y de
v = k [E] [S][S]
0 cat total / (K + [S])
d
ECUACIÓN DE VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
CATALIZADA POR ENZIMAS
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
v0 = kcat[Etotal][S]/(Km + [S])
• Esta ecuación da cuenta de los dos eventos del ciclo catalítico:

– la unión reversible del sustrato a la enzima (formación del
complejo E-S):
[E-S] = [Etotal][S]/(Kd + [S])
– la formación del producto una vez que se forma el complejo
enzima-sustrato (E-S), con una constante de velocidad que
es kcat
Variables de la ecuación de velocidad de la
reacción catalizada por enzimas
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
v0 = kcat[Etotal][S]/(Kd + [S])
• Variable dependiente: velocidad inicial

• Variables independientes:
1) Concentración de enzima. La velocidad inicial varía en forma
directamente proporcional con la [Etotal] a cualquier [S]
constante.
2) Concentración de sustrato. La velocidad inicial varía en forma
hiperbólica con la [S] a cualquier [E] constante.
Variables de la ecuación de velocidad de la
reacción catalizada
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
v0 = kcat[E]total[S] / (Kd + [S])
[S] = constante
v0 = a[E]total
Velocidad inicial
Velocidad inicial
[E]total = constante
v0 = a[S] / (b + [S])
[E]total [S]
• Noten que no variamos [S] y [E] al mismo tiempo, porque entonces no sabríamos a cual
de las dos variables se deben los cambios en velocidad inicial que observemos.
ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN
• Si mantenemos [Etotal] constante, definimos [Etotal]kcat = Vmax y

nombramos a Kd como Km tenemos la ecuación de
Michaelis-Menten
Vmax [S]
v0 =
Km + [S]
• A los términos constantes de esta ecuación les llamamos constantes

o parámetros cinéticos
REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA ECUACIÓN
DE MICHAELIS-MENTEN
v0 = Vmax[S]/(Km + [S]) • Noten que las unidades de
Vmax son las de una
velocidad (concentración
 tiempo-1) y por eso su
valor está sobre el eje de
ordenadas, y que las
unidades de Km son de
concentración, y por eso
su valor está sobre el eje
de abscisas.
• Esta curva está definida
por valores de velocidad
inicial que obtenemos
haciendo cursos
temporales a una
concentración fija de E y
diferentes
concentraciones de S.
DETERMINACIÓN DE LAS VELOCIDADES INICIALES
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
• Para obtener la curva de

saturación de la enzima
por el sustrato, primero
se determinan las
velocidades iniciales a
diferentes
concentraciones de
sustrato y luego se
grafican las
velocidades que
corresponden a cada
concentración de
sustrato ensayada.
Velocidad máxima (Vmax)
• Es la velocidad inicial límite a la que tiende la reacción

catalizada por enzimas a concentraciones saturantes del
sustrato, es decir cuando toda la enzima está como E-S y
realizando ciclos catalíticos.
Vmax = kcat[Etotal]
• El valor de Vmax depende de la kcat, que es característica de

cada enzima y sustrato, y de la concentración de enzima a la
que se hagan los ensayos.
• Su valor cambia durante el proceso de purificación de la
enzima porque cambia la [E] respecto a la proteína total.
Constante catalítica (kcat)
• La kcat nos indica la capacidad que tiene la enzima de catalizar la
reacción, que se manifiesta en su totalidad cuando la enzima está
saturada por su sustrato.
• La constante catalítica sólo puede conocerse cuando se tiene a la
enzima pura y por tanto se conoce su concentración.
kcat = Vmax / [Etotal]
• O en el caso de enzimas oligoméricas con más de un sitio activo

kcat = Vmax /[sitios activos]
• A kcat también se le conoce como número de recambio, porque indica el
número de ciclos catalíticos que la enzima puede tener por unidad de
tiempo y por sitio activo cuando está saturada por el sustrato.
• Por ejemplo, una kcat de 1000 s-1 significa que en un segundo se dan
1000 ciclos catalíticos, o lo que es lo mismo un ciclo dura una milésima
de segundo.
Constante de Michaelis Menten
(Km)
• La Km es la concentración de sustrato a la que

v0 = Vmax /2
• o lo que es lo mismo, la concentración de sustrato a la que
[E-S] = [E]total /2
• Es decir, es la concentración de sustrato a la que se tiene un 50% de

saturación de la enzima.
• La Km por tanto nos indica la afinidad de la enzima por el sustrato. A
mayor Km menor afinidad.
• El valor de Km no depende de la concentración de enzima.
Constante de Michaelis Menten
(Km)
• El valor de Km puede determinarse aunque la enzima no esté pura

(incluso en extractos crudos).
• El conocer el valor numérico de Km es importante por varias
razones:
– Es una indicación de la concentración intracelular del sustrato de
una enzima. Esta concentración no debe ser mucho menor ni mucho
mayor que la Km.
– Puesto que la Km es una constante característica de una enzima nos
puede servir para identificarla y diferenciarla de otras enzimas que
catalicen la misma reacción (isoenzimas).
– Podemos diseñar un experimento para determinar con exactitud
Vmax, usando en este experimento concentraciones de sustrato en un
intervalo de 0.5Km a 10Km.
Constante de especificidad
(Vmax/Km o kcat/Km)
Esta es una constante o parámetro cinético que no se observa directamente
en la ecuación de Michaelis-Menten pero que es muy importante
• Se les llama así porque nos permiten conocer cuál de dos
o más posibles sustratos es el preferido por la enzima.
• Si la enzima no está pura, sólo podemos conocer Vmax/Km.
• Una vez que tengamos la enzima pura y conozcamos kcat,
ya podemos determinar kcat/Km, que es el parámetro que
preferiblemente se debe usar.
• Pero incluso si sólo conocemos Vmax/Km, nos sirve para
determinar la especificidad por el sustrato, siempre que
se usen las mismas condiciones de ensayo para los
sustratos que están siendo comparados.
Especificidad versus afinidad
• Especificidad es la capacidad que tiene una enzima de discriminar
entre posibles sustratos (sustratos alternos). Nos indica la velocidad
relativa a la que se llevará a cabo la reacción catalizada con estos
diferentes sustratos.
– Se mide por la constante de especificidad para cada sustrato.
– Los mejores sustratos, es decir aquellos que producen una
reacción más rápida, son los que tienen una mayor constante de
especificidad.
• Afinidad es la capacidad que tiene una enzima de formar el

complejo E-S con un determinado sustrato. Nos indica la
proporción de enzima que estará unida al sustrato a una
determinada concentración de este sustrato.
– Se mide por la Km para cada sustrato.
– Los sustratos con mayor afinidad son los que tienen una menor
Km. Rosario A. Muñoz-Clares
Constante de especificidad
(Vmax/Km o kcat/Km)
• Vmax/Km o kcat/Km indican cuál es el mejor sustrato de una enzima, que

será aquél que tenga el valor mayor de cualquiera de estos parámetros.
• kcat/Km es la constante de velocidad de orden 2 que determina la
velocidad del paso de unión de la enzima y el sustrato. Por tanto, Por
tanto, cualquier factor que afecte kcat/Km está afectando la velocidad del
paso de unión de la enzima con el sustrato.
• kcat/Km indica la eficiencia catalítica de la enzima a concentraciones de
sustrato por debajo de los niveles de saturación, siendo 108- 109 M-1s-1 el
valor máximo que puede alcanzar kcat/Km.
Las enzimas que poseen un valor de kcat/Km cercano al máximo permitido

son las que han alcanzado la perfección catalítica y la velocidad de la
reacción que catalizan está limitada por la velocidad de difusión de los
sustratos y la enzima
Caracterización cinética de las enzimas
Para caracterizar cinéticamente a una enzima hay que:
• Determinar la velocidad inicial de la reacción

catalizada
– Variando la concentración de sustrato(s) y
manteniendo la concentración de enzima
constante.
• Determinar los parámetros o constantes cinéticas:

– Vmax, kcat, Km, Vmax/Km, kcat/Km
Transformaciones de la ecuación de
velocidad de Michaelis Menten
k1 kcat
E + S E-S E + P
k-1
v0 = Vmax[S]/(Km + [S])
• Lineal
– 1/v0 versus 1/[S] (Dobles recíprocos o Lineweaver-Burk)
• Sigmoidal
– v0 versus log[S] (semilogarítmica)
ECUACIÓN DE DOBLES RECÍPROCOS
GRÁFICA DE DOBLES RECÍPROCOS
(DE LINEWEAVER-BURK)
• Graficamos el
inverso o recíproco
de cada una de las
dos variables
• Obtenemos el
inverso o recíproco
de cada una de las
constantes
cinéticas.
• Es muy útil para

visualizar cambios
en los parámetros
cinéticos.
GRÁFICA SIGMOIDAL
(v0 versus log[S])
Velocidad inicial
log[S]
Esta representación gráfica se requiere cuando el intervalo de

concentración de sustrato usada para la caracterización
cinética abarca varios órdenes de magnitud.
Enzimas alostéricas
• Sabemos que la velocidad de una reacción catalizada por

enzimas responde hiperbólicamente a la concentración de
sustrato, o de moléculas o iones activadores o inhibidores.
¿Es esto cierto para todas las enzimas?
• No lo es. La velocidad de la reacción catalizada por ciertas

enzimas responde sigmoidalmente a la concentración de
sustrato y/o de moléculas o iones activadores o
inhibidores.
• Esto se debe a que el ligando (sustrato, inhibidor o

activador) se une a la enzima con cooperatividad positiva.
Tipos de saturación de una enzima por un sustrato
Vmax 120
100
cooperatividad positiva cinética de Michaelis Menten

v0 (U/mg prot)
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
[S] (mM)
Cooperatividad entre los sitios activos de
enzimas alostéricas
Algunas enzimas oligoméricas que poseen varios sitios activos

pueden presentar cooperatividad positiva de unión del
sustrato entre ellos.
Ello resulta en:
• La unión del sustrato se favorece a medida que la

enzima se satura más y más por este sustrato.
• Una dependencia sigmoidal de la velocidad inicial

frente a la [S].
Cooperatividad positiva entre los sitios
alostéricos de enzimas alostéricas
• Algunas enzimas oligoméricas que poseen un sitio alostérico

para el mismo efector (inhibidor o activador) en cada
subunidad pueden presentar cooperatividad positiva de unión
del efector.
• Ello resulta en:

– La unión del efector alostérico se favorece a medida que
la enzima se satura más y más por este ligando.
– Una dependencia sigmoidal de la velocidad inicial frente

a la concentración del efector alostérico.
Curvas de saturación sigmoidal por inhibidores
y activadores
[S] = constante 10
cooperatividad positiva
8
[E] = constante
8
6
v0 (U/mg prot.)
v0 (U/mg prot)
no cooperatividad no cooperatividad
6
4 [S] = constante
cooperatividad positiva
[E] = constante
2
2
0 0
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5
[Inhibidor] (mM) [Activador] (mM)
ENZIMAS ALOSTÉRICAS CON
COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIÓN
Son enzimas oligoméricas que poseen varios sitios

activos y varios sitios alostéricos y exhiben una
cinética de saturación por sus sustratos y/o efectores
alostéricos de tipo sigmoidal, resultado de una
unión cooperativa de estos ligandos.
IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DEL ALOSTERISMO Y LA
COOPERATIVIDAD POSITIVA
¿Para qué sirve que una enzima posea el fenómeno del
alosterismo?
¿Para qué sirve que una enzima posea el fenómeno de

cooperatividad positiva de unión de uno o varios ligandos?
• Aunque generalmente alosterismo y cooperatividad positiva de unión se dan
juntos, porque de esta forma se logra una regulación más eficiente de la
actividad de la enzima que los presenta, conceptualmente no son la misma cosa.
• El alosterismo se refiere a la existencia en la enzima de al menos un sitio
alostérico, es decir diferente al sitio activo, al cual se une especifica y
reversiblemente una molécula que no es un análogo del sustrato, produciendo
un cambio en la velocidad de la reacción catalizada (es decir, activación o
inhibición alostérica).
• La cooperatividad positiva consiste en que varios sitios de una misma molécula
que unen al mismo ligando, es decir varios sitios activos o sitios alostéricos para
inhibidores o activadores, actúan en forma dependiente, de manera que
aumentan su afinidad cuando alguno(s) de ellos ya ha(n) unido a este ligando.
IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DEL ALOSTERISMO
¿Para qué sirve que una enzima posea un sitio

alostérico?
IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DEL ALOSTERISMO
• Una enzima que posea uno o más sitios alostéricos puede ser
regulada por compuestos no análogos del sustrato dando lugar a:
– Retroinhibición (feedback inhibition)
– Retroactivación (feedback activation)
– Activación hacia delante (feedforward activation)
• Estos mecanismos de regulación son muy importantes para regular

la velocidad de una ruta metabólica (muchas de las enzimas
intracelulares no trabajan en forma aislada, sino integradas en una
ruta metabólica en la que el producto de una de ellas es el sustrato
de la siguiente).
TIPOS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA
– Retroinhibición (feedback inhibition): inhibición de una de las

primeras enzimas que participan en una secuencia de reacciones en
las que se sintetiza una molécula por esa misma molécula.
-
E1 E2 E3
A B C D
– Retroactivación (feedback activation): activación de una de las
primeras enzimas que participan en una secuencia de reacciones por
el producto de una reacción posterior en la ruta.
+
E1 E2 E3
A B C D
– Activación hacia delante (feedforward activation): activación de una

enzima por una molécula precursora de su sustrato.
+
E1 E2 E3
A B C D Rosario A. Muñoz-Clares
EJEMPLO DE RETROINHIBICIÓN
• Un exceso de isoleucina
inhibe alostéricamente a la
primera enzima
de su ruta biosintética, de
manera que no se siga
sintetizando.
• Puesto que la inhibición

es reversible, se pierde
cuando bajan los niveles de
isoleucina porque está
siendo usada por la célula.
• De esta forma la síntesis

de isoleucina se ajusta a las
necesidades de la célula.
ESTRATEGIAS DE REGULACIÓN ALOSTÉRICA
¿Qué tipos de regulación alostérica se ven en este esquema?
• En este esquema se muestran ejemplos de retroinhibición, de

activación hacia delante y de inhibición y activación por compuestos
que no pertenecen a la ruta.
Tomado de Vargas A.M. Bioquímica Metabólica, AVICAM, 2000 Rosario A. Muñoz-Clares

IMPORTANCIA FISIOLÓGICA DE LA COOPERATIVIDAD
POSITIVA DE UNIÓN
¿Para qué sirve que una enzima posea cooperatividad

positiva de unión?
• Permite amplificar la respuesta en la velocidad de la reacción

catalizada a cambios pequeños en la concentración de sus
ligandos, tanto del sustrato como de los inhibidores o
activadores. De esta manera, cuando existe cooperatividad
positiva en la unión de un ligando la enzima responde a cambios
pequeños en la concentración del ligando con cambios grandes
en la velocidad de la reacción que cataliza.
Valores del cociente [S]90 / [S]10
[S]90 es la concentración de sustrato que produce el 90% de la Vmax
• Enzimas que siguen cinética michaeliana

[S]90/[S]10 = 81
• Enzimas con cooperatividad positiva de unión

[S]90/[S]10 < 81
[S]10 [S]90
Valores del cociente [S]90 / [S]10
• Enzimas que siguen cinética michaeliana (hiperbólica)

[S]90/[S]10 = 81
• Enzimas con cooperatividad positiva de unión (sigmoidal)

[S]90/[S]10 < < 81
Estos valores son igualmente válidos para la saturación de una

enzima por activadores o inhibidores
ECUACIÓN DE VELOCIDAD DE LAS ENZIMAS
CON COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIÓN
• En estas enzimas se puede usar una modificación a la ecuación que Hill
propuso para la saturación de la hemoglobina por el O2, dado que las
velocidades iniciales son directamente proporcionales a la fraccción de
saturación de la enzima por el sustrato.
Vmax × [S]nH
v0 =
S0.5 nH + [S] H
n
nH = número de Hill = número de sitios activos

(sólo cuando existe cooperatividad muy alta)
Curva de saturación sigmoidal por el sustrato
(cooperatividad positiva)
S0.5
Parámetros cinéticos de la ecuación de Hill
• Vmax = velocidad límite a la que tiende la reacción cuando

toda la enzima está saturada por el sustrato. Si la enzima está
pura hablamos de kcat = Vmax/[sitios activos].
• S0.5 = concentración de sustrato a la que se alcanza la

mitad de la Vmax, es decir, el 50% de saturación de la enzima por
el sustrato (no confundir con Km que es un parámetro que sólo
existe cuando la cinética de saturación es michaeliana).
• nH = número de Hill, que indica el grado de cooperatividad en

la unión del ligando. A mayor valor de nH mayor cooperatividad.
Si el nH = 1 no hay cooperatividad.
Significado del número de Hill (nH)
• El valor del número de Hill (nH) no suele ser un número entero,

por lo que para entender su significado hay que tener en cuenta lo
siguiente:
• El valor máximo que puede alcanzar nH es igual al número de
sitios de unión que posee la enzima para el ligando que une
cooperativamente (sustrato o efectores alostéricos).
• El valor del nH indica el número mínimo de sitios de unión que
posee la proteína para ese ligando (el número entero superior al
valor determinado de nH).
• Si se conoce el número de sitios de unión que posee la proteína
para ese ligando, el valor del nH indica el grado de cooperatividad
que existe entre los sitios para unirlo. La cooperatividad entre los
sitios será mayor cuanto más cercano esté el valor del nH al
número de sitios, y viceversa será menor cuanto más pequeño sea
en comparación al número de sitios.
MODELO CONCERTADO O DE SIMETRÍA PARA EXPLICAR LA
COOPERATIVIDAD POSITIVA Y LOS EFECTOS ALOSTÉRICOS
• Postula que existen dos estados

conformacionales en equilibrio: T de baja
afinidad y R de alta afinidad. En cada uno de ellos
todas sus subunidades tienen la misma
conformación.
• En ausencia del sustrato el estado T es el más
estable termodinámicamente. Cuando el sustrato
está unido el estado R es el más estable.
• A medida que se incrementa la concentración de
sustrato el equilibrio se desplaza hacia la forma
R, de manera que aparecen subunidades vacías
de alta afinidad que se llenan a la concentración
de sustrato a la que se produzca este cambio.
• Y viceversa, si disminuye la concentración de
sustrato y tenemos el estado R con una o pocas
subunidades ocupadas, el equilibrio se desplaza
hacia la forma T, de manera que el sustrato se
Estado T Estado R
baja afinidad alta afinidad libera de donde estaba unido.
Efectos de activadores e inhibidores alostéricos
sobre la velocidad de la reacción
• Los activadores
alostéricos aumentan la
afinidad por el sustrato
y disminuyen el grado
de cooperatividad
positiva (la eliminan
cuando son saturantes)
porque favorecen el
estado R.
• Los inhibidores
alostéricos disminuyen
la afinidad por el
sustrato y aumentan el
grado de cooperatividad
positiva porque
favorecen el estado T.
DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS
CINÉTICOS DE UNA ENZIMA ALOSTÉRICA
• Ajustando los datos por regresión no lineal a la

ecuación de Hill
• Ajustando los datos a una transformación lineal de la

ecuación de Hill
• Esta transformación lineal no se puede hacer por

dobles recíprocos, como hacemos en el caso de la
hipérbola. En el caso de una sigmoide hay que
convertir a los términos que contienen un exponente en
su logaritmo en base 10 correspondiente.
TRANSFORMACIÓN LINEAL DE LA
ECUACIÓN DE HILL
v0
log = nHlog[S]– nHlogS0.5
(Vmax - v0)
y = mx + b
• Variable dependiente (y): log[v0/(Vmax- v0)]
• Variable independiente (x): log[S]
• Pendiente (m): nH
• Ordenada en el origen: nHlogS0.5
GRÁFICA DE LA TRANSFORMACIÓN LINEAL DE
LA ECUACIÓN DE HILL
N*X - N*LOG(S0.5)
Control
2 + Glc6P
+ malato + activador
1
Log(v0 / (Vmax-v0))
Data: alosterica_C
Model: Hill linear
0 Chi^2 = 0.00622
n 1.649440.03437
S0.5 0.732420.04088
Data: alosterica_D
-1 + inhibidor Model: Hill linear
Chi^2 = 0.00101
n 1.000450.01387
S0.5 0.098740.00227
Data: alosterica_E
-2 Model: Hill linear
Chi^2 = 0.0317
n 2.472140.09203
S0.5 3.7495 0.4873
-3
-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0
Log[S]
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA
• Regulación por moléculas o iones
– Sustratos, productos, cofactores
– inhibidores, activadores, pH
– Cooperatividad positiva de unión
• Regulación por modificación química

– Irreversible
• Zimógenos
– Reversible
• Adición de un grupo químico por enlace covalente
• Oxidación-reducción de cisteínas
• Regulación por isoenzimas

Regulación de la actividad de la enzima por
modificación química irreversible
• Consiste en la hidrólisis específica de uno o pocos enlaces

peptídicos en la molécula precursora (proteolisis limitada).
• Requiere la acción de una proteasa específica que reconozca
el enlace que se va a hidrolizar.
• Produce la enzima activa a partir de una proteína
precursora inactiva zimógeno.
• Ejemplos de enzimas así reguladas:

– Proteasas digestivas
– Proteasas en la ruta de coagulación de la sangre
– Proteasas en la ruta de muerte celular programada
(apoptosis)
ZIMÓGENOS
• Son proteínas precursoras de enzimas que son convertidas a

enzimas activas por proteolisis en sitios específicos.
• En general son precursoras de enzimas proteolíticas que de

sintetizarse activas producirían daños a la célula.
• Se activan fuera de la célula que las produce (caso de las

enzimas proteolíticas digestivas, o de las que desencadenan
la cascada para la coagulación de la sangre), o en el interior
de la célula bajo circunstancias muy reguladas que llevan a
la muerte celular (caso de las caspasas en apoptosis).
FORMACIÓN DE QUIMOTRIPSINA Y TRIPSINA
• La proteolisis limitada permite un rearreglo del sitio activo que

convierte a los zimógenos en enzimas activas
Modificación química reversible por adición
covalente de un grupo
• Consiste en la formación de un enlace covalente entre una
cadena lateral de un residuo de aminoácido con otra molécula, lo
que produce un cambio en las características de esa cadena
lateral y por tanto de las interacciones que hace.
• En el caso de las enzimas, la modificación covalente del residuo

produce un cambio conformacional o la introducción de un
grupo con características polares diferentes, lo que resulta en
una mayor o menor actividad de la enzima modificada.
• La modificación covalente ocurre en residuos específicos que no

son catalíticos.
Modificación química reversible por adición
covalente de un grupo
Requiere:
• Molécula donadora que aporta el grupo que modifica
• Enzima modificadora que cataliza en forma específica la

reacción de modificación, es decir la formación del enlace
covalente.
• Enzima desmodificadora que cataliza en forma específica la

reacción de pérdida de la modificación, es decir la ruptura,
generalmente por hidrólisis, del enlace covalente.
Tanto la enzima modificadora como la desmodificadora pueden a

su vez estar reguladas por distintos mecanismos en forma
coordinada pero opuesta.
MODIFICACIÓN COVALENTE DE LAS ENZIMAS
• Algunos de los aminoácidos son buenos agentes nucleofílicos

cuando el grupo reactivo de su cadena lateral pierde un protón.
• Los residuos de aminoácidos que pueden ser agentes nucleofílicos

son:
– Cisteína
– Serina, treonina y tirosina
– Histidina
– Lisina
– Arginina
– Asparagina, glutamina
– Aspártico y glutámico
• Pero otras cadenas laterales también pueden modificarse

covalentemente (por ejemplo, formación de hidroxiprolina).
Ejemplos de modificaciones químicas reversibles de residuos
de aminoácidos en proteínas
Modificación química reversible por fosforilación
• La fosforilación es la modificación química más frecuente que sufren las

Tanto las proteín cinasas como las proteín fosfatasas son a su vez reguladas
en forma opuesta pero coordinada. proteínas intracelulares.
• Esta modificación química introduce dos cargas negativas en el residuo
modificado.
• La molécula donadora del grupo fosforilo es el ATP y las enzimas que
catalizan esta modificación química se llaman protein cinasas.
• Existen dos tipos de proteín cinasas: las que modifican residuos de serina
o treonina y las que modifican residuos de tirosina.
• La reacción de modificación es irreversible, pero la modificación se
revierte por la hidrólisis del enlace covalente formado, una reacción que es
catalizada por enzimas llamadas proteín fosfatasas, liberándose una
molécula de Pi.
Ejemplo de modificación química reversible por fosforilación
(glucógeno fosforilasa)
Modificación química reversible por
oxidación-reducción de cisteínas vecinas
• En ciertas proteínas intracelulares se pueden formar de manera reversible y
transitoria puentes disulfuro con fines de regulación de su actividad.
• Estos puentes disulfuro se forman entre residuos de cisteína vecinos en la
estructura tridimensional de la enzima.
Oxidantes
(O2, H202,
radicales libres, etc) S
SH
SH Reductores S
(DTT, 2-mercaptoetanol,
Cisteínas glutatión, tiorredoxina, etc) Puente
vecinas disulfuro
• La formación de un puente disulfuro es una reacción de oxidación que puede
revertirse por agentes reductores fisiológicos o no fisiológicos.
ISOENZIMAS
• Proteínas que en un organismo catalizan la misma
reacción pero están codificadas por genes diferentes.
• Difieren en sus propiedades cinéticas.
• Se expresan diferencialmente en diferentes células, o

tienen una diferente compartimentalización intracelular,
o se expresan en diferentes estados fisiológicos o
patológicos del mismo organismo.
• No confundirlas con los alelos de una misma enzima, ni

con las enzimas del mismo tipo (ortólogas) que existen en
diferentes organismos.
• No confundirlas con los alelos de una mismaRosario
enzima, ni
A. Muñoz-Clares
Mecanismos de regulación de la cantidad
de las enzimas
– Regulación transcripcional
• Síntesis de mRNA
• Maduración y vida media del mRNA
– Regulación traduccional
• Síntesis de la proteína
– Regulación postraduccional
• Degradación de la proteína
Mecanismos de regulación enzimática
– Regulación de la actividad de la enzima

(regulación a corto plazo).
– Regulación de la cantidad de la enzima

(regulación a largo plazo).
Factores que afectan la velocidad de una reacción
catalizada por enzimas
• Concentración de sustrato o sustratos

(incluidos los cofactores)
• Concentración de enzima
¿Son todos?
Factores que afectan la velocidad de una reacción
catalizada por enzimas
• Además de la concentración de sustratos,

cofactores y enzima, la velocidad de la reacción
catalizada se regula por:
– Inhibidores
– Activadores
– pH
– Temperatura
Regulación de la actividad enzimática por
inhibidores o activadores
• INHIBIDOR : Molécula o ion que al unirse a la

enzima produce una disminución en la velocidad
de la reacción catalizada.
• ACTIVADOR: Molécula o ion que al unirse a la

enzima produce un aumento en la velocidad de la
reacción catalizada.
Usos de la inhibición enzimática
• El estudio de la inhibición enzimática permite:

– conocer uno de los principales mecanismos de control de
los procesos biológicos.
– conocer la estructura del sitio activo en ausencia de
información sobre la estructura tridimensional, o como
complemento de esta información.
– diseñar o seleccionar inhibidores con aplicaciones
biotecnológicas, tales como insecticidas, herbicidas, o
fármacos.
– Conocer el mecanismo por el que ejercen su efecto tóxico
muchos venenos.
Regulación de la actividad enzimática por unión
a la enzima de inhibidores
¿Qué tipos de inhibidores existen?
• Los inhibidores se pueden clasificar de diferentas

formas atendiendo a diferentes criterios.
TIPOS DE INHIBIDORES
• IRREVERSIBLE
• El efecto del inhibidor no se revierte al disminuir su concentración
k
E + I E-I
k = cte de velocidad de inactivación de segundo orden
• REVERSIBLE
• El efecto del inhibidor se revierte al disminuir su concentración
k1
E + I E-I
k-1
Ki = cte de disociación del complejo E-I = k-1/k1
Regulación de la actividad enzimática por unión a
la enzima de inhibidores reversibles
• La velocidad de la reacción catalizada disminuye en forma hiperbólica con respecto a la
concentración de los inhibidores, puesto que la respuesta de la enzima depende de su grado
de saturación con el inhibidor.
• Esto es consecuencia de que se forman complejos enzima-inhibidor reversibles.
k1
E + I E-I
k-1
30
• El inhibidor de este ejemplo es total, es
25
[S] = cte decir cuando todas las moléculas de enzima
[Etotal] = cte
tengan unido al inhibidor la velocidad de la
Velocidad inicial
20
reacción catalizada es cero (la asíntota a esta
( µ mol/ml/min)
15 hipérbola es cero).
10 • La I50 es la concentración del inhibidor que
produce la mitad de la inhibición máxima.
5
Por tanto, es la concentración que produce
0 el 50% de saturación de la enzima por el
0 5 10 15 20
I50 [Inhibidor] (mM)
inhibidor a una determinada [S].
CURVA DE SATURACIÓN POR UN INHIBIDOR TOTAL

– TOTAL
Si todas las moléculas de enzima tengan unido al
inhibidor la velocidad de la reacción catalizada es
cero.
– PARCIAL
Aun cuando todas las moléculas de enzima tengan
unido al inhibidor la velocidad de la reacción
catalizada no es cero.
Inhibición total
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Kii
E-S-I E + I + P
Km = K s= constante de disociación del sustrato

Kii = constante de disociación del inhibidor
Inhibición parcial
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Kii
E-S-I E + I + P
bkcat
b es el factor que indica el número de veces que disminuye la kcat por la

unión del inhibidor. Por tanto b < 1 y bkcat < kcat
• ISOSTÉRICO
El inhibidor se une al mismo sitio que el
sustrato (sitio activo).
• ALOSTÉRICO
El inhibidor se une a un sitio diferente al
que se une el sustrato (sitio alostérico).
INHIBICIÓN ALOSTÉRICA COMPETITIVA
• Un inhibidor alostérico puede impedir que el sustrato se una al

sitio activo induciendo un cambio conformacional en la enzima.
TIPOS DE INHIBIDORES REVERSIBLES
• COMPETITIVO
– El inhibidor se une a la enzima libre interfiriendo con la unión del
sustrato
• INCOMPETITIVO
– El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato interfiriendo con
la formación de producto
• MIXTO
– El inhibidor se une tanto a la enzima libre como al complejo
enzima-sustrato, por tanto interfiriendo la unión del sustrato y la
formación del producto
• NO COMPETITIVO
– Es un tipo especial de inhibidor mixto que se une con igual
afinidad a la enzima libre y al complejo enzima-sustrato
Constantes de inhibición
• Competitiva: Constante de disociación del complejo E-I

E + I « E-I
Kic = [E][I]/[E-I]
Kic es la concentración de inhibidor a la que el 50% de la enzima
está como E y el otro 50% como EI
• Incompetitiva: Constante de disociación del complejo E-S-I

E-S + I « E-S-I
Kii = [E-S][I]/[E-S-I]
Kii es la concentración de inhibidor a la que el 50% de la enzima
está como ES y el otro 50% como ESI
Parámetros cinéticos aparentes
• Son aquellos que se obtienen cuando se realiza una cinética

de saturación por el sustrato en presencia de un ligando de la
enzima diferente al sustrato variable (es decir, en presencia de
un inhibidor, activador o de otro sustrato) que se mantiene a
una concentración fija).
• Por tanto el valor de un parámetro cinético aparente no es

constante, sino que depende de la concentracion de ese otro
ligando (sustrato, inhibidor o activador) en el medio de ensayo.
INHIBICIÓN COMPETITIVA
Producto
Sustrato
Enzima
Inhibidor
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Kic
E-I + S ESI E + I+ P
[E]t = [E] + [E-S] + [E-I]
• El sustrato y el inhibidor compiten por unirse a la misma especie

de la enzima: la enzima libre. Por tanto,
El complejo E-S-I no se forma
• La inhibición se observa mejor a [S] bajas y puede ser

contrarrestada a [S] suficientemente altas. Por tanto,
La Vmax no se afecta
• Alcanzar la Vmax requiere [S] más altas en presencia del inhibidor
competitivo. Por tanto,
La Km aparente aumenta
• El inhibidor competitivo disminuye la velocidad del paso de unión
del sustrato a la enzima libre. Por tanto,
La Vmax / Km aparente disminuye

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA
DE UN INHIBIDOR COMPETITIVO
Vmax [S]
v0 =
Ks (1 + [I]/Kic) + [S]
• [I]/Kic es la concentración de inhibidor competitivo relativa a su constante de
disociación del complejo que forma con la enzima (E-I).
• [I]/Kic indica la proporción de la enzima total que estaría como complejo E-I
no productivo en ausencia de sustrato, es decir, si toda la enzima estuviera
como enzima libre (E).
• [I]/Kic permite calcular el aumento que sufre el valor de la Ks aparente cuando
la reacción ocurre en presencia de diferentes concentraciones relativas del
inhibidor competitivo.
Patrones de inhibición competitiva
c a = 1 + [I]/Kic
INHIBICIÓN INCOMPETITIVA
Producto
Enzima
Sustrato Inhibidor
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Kii
E-S-I E + I+ P
[E]t = [E] + [E-S] + [E-S-I]
• El inhibidor no interfiere con la unión del sustrato, ya que no se

une a E sino al complejo E-S, formando el complejo E-S-I, del cual
no se disocia el sustrato. Por tanto, el inhibidor desplaza el
equilibrio hacia la especie E-S-I y en consecuencia
La Km aparente disminuye
• Cuando aumenta [S] aumenta la [E-S-I], un complejo que no
puede formar producto. Por tanto, la inhibición se favorece a [S]
altas y en consecuencia
La Vmax aparente disminuye

• El inhibidor no afecta el paso de unión del sustrato a la enzima
libre. Por tanto,
La Vmax / Km no cambia
DE UN INHIBIDOR INCOMPETITIVO
Vmax [S]/ (1 + [I]/Kii)

v0 =
Ks /(1 + [I]/Kii ) + [S]
• [I]/Kii es la concentración de inhibidor relativa a su constante de disociación del
complejo que forma con la enzima (E-S-I).
• [I]/Kii indica la proporción de la enzima total que estaría como complejo E-S-I
no productivo si el sustrato fuese saturante, es decir, si toda la enzima estuviera
unida al sustrato (E-S).
• [I]/Kii permite calcular la disminución que sufren los valores de la Vmax y la Ks
aparentes cuando la reacción ocurre en presencia de diferentes concentraciones
relativas del inhibidor incompetitivo.
Patrones de inhibición incompetitiva
a = 1 + [I]/Kii
INHIBICIÓN MIXTA
Enzima
Inhibidor Sustrato Producto
INHIBICIÓN MIXTA
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Kic = Ki +I Kii = aKi
E-I + S E-S-I E + I+ P
aKs
[E]t = [E] + [E-S] + [E-I] + [E-S-I]
• a es el factor que indica el número de veces que disminuye o aumenta la

afinidad de la enzima por el inhibidor cuando el sustrato está unido, así
como de la enzima por el sustrato cuando el inhibidor está unido.
• El valor de a puede ser > 1, de manera que Ks < aKs y Kic <aKi , o a
puede ser < 1, de manera que Ks > aKs y Kic > aKi
DE UN INHIBIDOR MIXTO
Vmax [S]/ (1 + [I]/Kii)

v0 =
Ks (1 + [I]/Kic) /(1 + [I]/Kii) + [S]
Vmax [S]/ (1 + [I]/aKi)

v0 =
Ks (1 + [I]/Ki) /(1 + [I]/aKi) + [S]
• Ambas ecuaciones son la misma

Patrones de inhibición mixta
a= 1 + [I]/Kic
a´ = 1 +• [I]/K
Este
ii
patrón de inhibición
corresponde a un mecanismo en
el que α > 1, es decir Kic < Kii. El
punto de cruce de las líneas
ocurre en el segundo cuadrante
(arriba del eje de abscisas y a la
izquierda del eje de ordenadas)
• Si α < 1, es decir Kic > Kii , las
líneas del patrón de inhibición se
cruzarían en el tercer cuadrante
(debajo del eje de abscisas y a la
izquierda del eje de ordenadas).
• Si α = 1, es decir Kic = Kii , las
líneas del patrón de inhibición se
cruzarían sobre el eje de
abscisas, lo que es el caso de la
inhibición no competitiva.
Patrones de inhibición mixta
Kic < Kii Kii < Kic
INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
Ks kcat
E + S E-S E + P
+I Ki +I Ki
E-I + S E-S-I E + I+ P
Ks
En este caso Kic = Kii = Ki
[E]t = [E] + [E-S] + [E-I] + [E-S-I]

ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN PRESENCIA DE UN
INHIBIDOR NO COMPETITIVO
Vmax [S]/ (1 + [I]/Kii)

v0 = Ks (1 + [I]/Kic) /(1 + [I]/Kii) + [S]
Ki = Kic = Kii
Vmax [S]/v(1=+ [I]/Kii)

v0 = Ks + [S]
Patrones de inhibición no competitiva
(mixta)
Incrementando Incrementando
Incrementando
(a) Inhibición competitiva (b) Inhibición no competitiva (c) Inhibición incompetitiva

(mixta)
Ecuaciones de velocidad inicial en presencia de
inhibidores
v0 = Vmax[S]/(Ks+ [S])
Inhibición competitiva
v0 = Vmax[S]/{Ks( 1 + [I]/Kic) + [S]}
Inhibición incompetitiva
v0 = Vmax[S]/( 1 + [I]/Kii) / (Ks + [S])
Inhibición mixta
v0 = Vmax[S]/( 1 + [I]/Kiu) / {(Ks( 1 + [I]/Kic)/( 1 + [I]/Kii) + [S] }
Inhibición no competitiva
v0 = Vmax[S]/( 1 + [I]/Ki) / (Ks + [S])
Parámetros cinéticos aparentes
importantes en inhibición
app(Vmax/Km ) = (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Kic)
appVmax = Vmax / (1 + [I]/Kii)
Efecto de los inhibidores totales sobre los
parámetros cinéticos
Inhibición Parámetro Parámetro aparente
Vmax Vmax
Competitiva Vmax/Km (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Kic)
Km Km(1 + [I]/Kic)
Vmax Vmax / (1 + [I]/Kii)

Incompetitiva Vmax/Km (Vmax/Km )
Km Km / (1 + [I]/Kii)
Vmax Vmax / (1 + [I]/Kii)

Mixta Vmax/Km (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Kic)
Km Km(1 + [I]/Kic) / (1 + [I]/Kii)
Vmax Vmax / (1 + [I]/Ki)

No competitiva Vmax/Km (Vmax/Km ) / (1 + [I]/Ki)
Km Km
PARÁMETROS CINÉTICOS AFECTADOS POR
LOS DIFERENTES TIPOS DE INHIBIDORES
_______________________________________________
Tipo Parámetro cinético

_______________________________________________________
COMPETITIVA Vmax/Km disminuye; Km aumenta
INCOMPETITIVA Vmax disminuye; Km disminuye
MIXTA Vmax disminuye; Vmax/Km disminuye; Km aumenta o

disminuye
NO COMPETITIVA Vmax disminuye; Vmax/Km disminuye; Km no se afecta
PATRONES DE INHIBICIÓN
(en gráficas de dobles inversos)
______________________________________________________
Tipo Patrón
_______________________________________________________
COMPETITIVA Líneas que se cruzan en el eje de ordenadas (1/v0)
INCOMPETITIVA Líneas paralelas
MIXTA Líneas que se cruzan en el segundo o tercer cuadrante

a la izquierda del eje de ordenadas (1/v0)
NO COMPETITIVA Líneas que se cruzan en el eje de abscisas (1/[S])

a la izquierda del eje de ordenadas (1/v0)
Efecto de los inhibidores sobre la velocidad de flujo de una
ruta metabólica
• Muchas enzimas intracelulares no trabajan solas sino integradas en
una ruta metabólica en la que el producto de una de ellas es el
sustrato de la siguiente.
E1 E2 E3
A B C D
• La inhibición de cualquiera de las enzimas lleva a un aumento en la
concentración de su sustrato. Por tanto,
• Si el inhibidor es COMPETITIVO se contrarresta la inhibición
• Si el inhibidor es es INCOMPETITIVO se favorece la inhibición
• Si el inhibidor es MIXTO, pero el componente incompetitivo es mayor

que el competitivo también se favorece la inhibición
TIPOS DE ACTIVADORES
• ESENCIAL: Se requiere que el activador esté unido

a la enzima para que ocurra la reacción.
• NO ESENCIAL: No se requiere que el activador esté

unido a la enzima para que ocurra la reacción,
aunque en presencia del activador la velocidad de la
reacción es mayor que en su ausencia.
Regulación de la actividad enzimática por unión
a la enzima de activadores reversibles
¿Cómo depende la velocidad de una reacción catalizada

de la concentración de un activador reversible?
Regulación de la actividad enzimática por unión a
la enzima de activadores reversibles
• La velocidad de la reacción catalizada aumenta en forma hiperbólica con respecto
a la concentración de un activador, puesto que la respuesta de la enzima depende de
su grado de saturación con el activador.
• Esto es consecuencia de que se forman complejos enzima-activador reversibles.
k1
E + A E-A
k-1
25
• La cte de disociación del complejo E-A
20 es la Ka
Ka = k-1/k1
Velocidad inicial
(µmol/ml/min)
15
10
• La A0.5 es la concentración de activador
[S] = cte que produce la mitad de la activación
5 [Etotal] = cte máxima (50% de saturación de la enzima
0
por el activador) a una determinada [S].
0 5 10 15 20
A0.5 [Activador] (mM)
CURVA DE SATURACIÓN POR UN ACTIVADOR ESENCIAL

INTERÉS DEL ESTUDIO DE LOS EFECTOS DEL pH
SOBRE LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES
CATALIZADAS
• Determinar el pH óptimo de la reacción.
• Entender como cambios en el pH pueden regular la actividad de

la enzima.
• Identificar residuos de aminoácidos del sitio activo posean un

grupo ionizable y que sean importantes ya sea para la unión del
sustrato, para los pasos químicos de la reacción o para ambos.
• Determinar el mecanismo químico de la reacción.
EFECTOS DEL pH SOBRE LAS REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMAS
Conocemos el efecto que valores de pH extremos tienen

sobre la estabilidad de las proteínas en general y por
tanto sobre las enzimas en particular, pero ¿qué efectos
tiene la concentración de H+, o lo que es lo mismo el pH,
sobre la velocidad de una reacción catalizada por
enzimas?
EFECTOS DEL pH SOBRE LAS REACCIONES
CATALIZADAS POR ENZIMAS
• El pH afecta la ionización de residuos de aminoácidos del sitio

activo que pueden estar involucrados en:
• la unión del sustrato.
• los pasos químicos de formación de producto.
• Cuando los H+ se unen o se disocian de grupos ionizables de los

sitios activos son ligandos de las enzimas que pueden tener
efectos inhibidores o activadores.
• Los H+ pueden producir cualquier tipo de inhibición y de

activación.
SISTEMAS MONOPRÓTICOS
• ¿Qué papel está desempeñando en este mecanismo el H+?
Ks kcat
E + S E-S E + P
+ H+ KaE + H+ Ka2
+H-E + S +HESI +HE + P
bkcat
• El H+ es un inhibidor competitivo total
Ks kcat
E + S E-S E + P
+ H+ Ka1 + H+ KaES
+HE + S +H-E-S +HE + P
bkcat
• El H+ es un inhibidor incompetitivo total
Ks kcat
E + S E-S E + P
+ H+ KaE + H+ KaES
K ´s
+H-E + S +H-E-S +HE + P
bkcat
• El H+ es un inhibidor mixto total
kcat
E + S ES E + P
+ H+ KaE + H+ Ka2
Ks kcat
+H-E + S +H-E-S +H-E + P
• El H+ es un activador esencial para la unión del sustrato
SISTEMAS DIPRÓTICOS
• ¿Qué papel están desempeñando en estekmecanismo

cat los H+?
E2- + S + H+E2-SK E + P
aES
+ H+ KaE1
Ks kcat
H-E- + S H-E--S H-E- + P
kcat
+ H+ KaE2
H-E-H + S H2ES H2E + P

• El H+ que se une a una cadena lateral es un activador esencial para
unión y el que se une a otra cadena lateral es un inhibidor competitivo
total Rosario A. Muñoz-Clares
SISTEMAS DIPRÓTICOS
• ¿Qué papel están desempeñando en estekmecanismo

cat
los H+?
E2- + S + H+ E2-SKaES E + P
+ H+ KaE
Ks kcat
H-E- + S H-E--S H-E- + P
kcat
+ H+ KaES
+ H+ H E + S H-E-H-S H2E + P
KaE 2
• El H+ que se une a una cadena lateral es un activador esencial para la
unión y el que se une a otra cadena lateral es un inhibidor incompetitivo
total Rosario A. Muñoz-Clares
SIGNIFICADO DEL EFECTO DEL pH SOBRE
LOS PARÁMETROS CINÉTICOS
• Se disminuyen o aumentan Vmax y kcat si el grupo ionizable de

la enzima está involucrado en el(los) paso(s) químico(s) de la
reacción catalizada (es decir, en la conversión de E-S en E + P).
• Se disminuyen o aumentan Vmax /Km y kcat/Km si el grupo

ionizable de la enzima está involucrado en la unión del sustrato
a la enzima (es decir, en la formación de E-S).
• Si cambia Km no podemos saber si el grupo está participando en

los pasos químicos o en la unión del sustrato o en ambos.
LOS H+ SON INHIBIDORES Y/O ACTIVADORES
• Para determinar el efecto de los protones como activadores o

inhibidores se hacen los mismos experimentos que para cualquier
otro inhibidor o activador y los resultados se analizan usando las
mismas ecuaciones.
• Es decir, se obtienen patrones de inhibición o activación saturando

a la enzima con el sustrato a diferentes valores de pH, que se
mantiene constante en cada una de las cinéticas de saturación.
• De esta forma podemos determinar el tipo de inhibición o

activación y el parámetro cinético (Vmax o Vmax/Km) que se modifica
por el cambio de pH.
• Podemos también estudiar el efecto del pH sobre la velocidad de la

reacción catalizada a una concentracion de sustrato fija. Al graficar
la velocidad inicial frente a la concentración de H+ expresada en
forma logarítmica (pH) se obtiene una gráfica sigmoidal, porque
esta es la forma en que se observa una hipérbola en una gráfica
semilogarítmica. Rosario A. Muñoz-Clares
DETERMINACIÓN DE pKa
Inhibición competitiva por protones
• La gráfica es sigmoidal
porque la escala de [H+] es
logarítmica.
• pKa es el valor de pH
(concentración de protones) a
v0 la que el 50% del grupo
ionizable está protonado y el
50% desprotonado.
• Por tanto pKa es el valor del

pH al que se observa la mitad
pKa pH del cambio en la velocidad
inicial.
DETERMINACIÓN DE pKa
• Hay dos grupos

ionizables involucrados,
uno en el que los
protones son inhibidores
y otro en el que son
activadores
• Por tanto se
determinan dos valores
de pKa
pKa1 pKa2
P50, Ks, Ki, Ka y pKa
• Estos cinco parámetros son una medida de la afinidad de una
proteína por un ligando, porque son constantes de disociación.
• Indican la concentración del ligando a la que se tiene el 50% de

proteína unido a él (50% de saturación)
• P50 = constante de disociación del O2 del complejo que forma con
Mb y con Hb
• Ks = constante de disociación del sustrato del complejo que forma
con la enzima (igual a Km en los mecanismos que hemos visto).
• Ki = constante de disociación del inhibidor del complejo que forma
con la enzima.
• Ka = constante de disociación del activador del complejo que forma
con la enzima.
• pKa = logaritmo de la inversa de la constante de disociación de un
protón de un grupo ionizable.

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RESOLUCIÓN EJERCICIOS DE INHIBICIÓN-ACTIVACIÓN Y EFECTOS DE

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• Por ello necesitan en muchas ocasiones de la ayuda

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TANTO LA COENZIMAS SOLUBLES COMO LOS GRUPOS PROSTÉTICOS SE

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• Las reacciones proceden espontáneamente si hay un descenso en

• Muchas reacciones bioquímicas que son termodinámicamente

• Lo que determina si una reacción es termodinámicamente

• Lo que determina si una reacción es cinéticamente

• El G es el cambio de energía libre de un sistema que se

• Go es el cambio de energía libre estándar de una

• G’o es el cambio de energía libre estándar a pH 7.0, es

• Ambos, están relacionados con la constante de equilibrio:

K’eq es el valor obtenido a pH 7 y a 55.5 M de H2O

Rosario A. Muñoz Clares

– G negativo: reacción exergónica, termodinámicamente

– G positivo: reacción endergónica, termodinámicamente

– G cero: reacción en el equilibrio.

• El G depende sólo del valor de energía libre entre los estados

• Por tanto, no nos informa sobre la velocidad de la reacción.

• Una reacción en un ser vivo tiene el mismo cambio en

• Ello se debe a que el G depende sólo del estado final e

• Por ejemplo, la combustión de glucosa a CO2 y H2O lleva

• Lo que cambia, aumenta, en la reacción que ocurre en el

Rosario A. Muñoz Clares

• Las enzimas son catalizadores biológicos que disminuyen la energía

• Debido a que no pueden alterar la Keq, las enzimas aumentan por el

• Este es el mecanismo mínimo de una reacción catalizada por enzimas

• Las enzimas, como cualquier catalizador incrementan notablemente la

• La velocidad de una reacción puede incrementarse si una mayor

• Como ocurre con cualquier

¿Cómo logran las enzimas disminuir la