TRABAJO PRÁCTICO N° 2

“RECUENTO DE
BACTERIAS COLIFORMES”

INTEGRANTES: Agostina Deheza,Valentino Testa, Candela

Pizzolitto, Vanina Soria
CURSO Y DIVISIÓN: 7° "A"
PROFESORA: Natalia Tazzioli

1. OBJETIVOS:
General
- Realizar reconteo microbiano mediante métodos de dilución y siembra
bacteriana.
- Observación de extendido natural y extendido coloración de Gram.
Específicos:

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- Realizar repetidas diluciones en peptona.
- Recuento de bacterias coliformes presentes en muestra de leche.
- Calcular el crecimiento microbiano con método de dilución.
- Observación de bacterias en extendidos.

2. FUNDAMENTOS:

Los términos coliforme y coliforme fecal carecen de significado taxonómico.

Solo tienen sentido metodológico y solo cuando se definen las condiciones en
que se hace su detección (propiedades del medio de cultivo, temperatura y
tiempo de incubación)

Agar VRBL
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el
cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el
hidrato de carbono fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. El agar
es el agente solidificante.
Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y
producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se
observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a 2 mm de diámetro,
rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

3. CRITERIO DE CAA:

Artículo 558 - (Resolución Conjunta SCS y SAGyP Nº 13/2022)

“Se entiende por Leche Entera Pasterizada o Leche Entera Pasteurizada, la
que reuniendo las características establecidas en el artículo 555 y proviniendo
de plantas pasteurizadoras con inspección oficial de conformidad con las
disposiciones en la materia (artículo 66) y con la dirección técnica de un
profesional universitario”

Criterios microbiológicos:

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4. DIAGRAMA DE DISOLUCIÓN:

5. MATERIALES:

● Estufa
● tapones
● Pipetas (3 de 1ml)
● Pipeta de 10ml
● Placas
● Agar VRBL
● Tubos de ensayo
● Erlenmeyer
● Vaso precipitado
● Gramilla

6. PREPARACION MATERIALES Y MEDIO DE CULTIVO:

6.1. PREPARACION DE MATERIALES:

• Selección de materiales (placa, tubos de ensayo, etc.).
• Se envuelven las placas y las pipetas en papel.
• Se colocan 9ml de agua en los tubos de ensayo y se le coloca los
tampones.
• Se lleva los tubos de ensayo al autoclave (15min. a 1ATM). Las placas y
pipetas se llevan a la estufa de esterilización (160-180ºC por 3hs).

6.2. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO:

● Se coloca una fuente con agua a calentar.
● Se seleccionan los materiales adecuados para el proceso de preparación
del medio de cultivo (Agar VRBL, probeta, Erlenmeyer).
● Se realiza el cálculo siguiendo las indicaciones de la etiqueta del medio de
cultivo.

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 1.000ml de agua—------------------ 41,5gr
45ml de agua —----------------x= 1,86 gr
● Se prepara el medio de cultivo (siguiendo el procedimiento del envase del
medio que se utilizará), se lleva a baño María y se esteriliza en el
autoclave.

6.3. PROCESO DE DILUCION:

• En tres tubos de ensayo se coloca 9ml de agua estéril.

• Con una pipeta se saca 1ml de la muestra problema (Leche).
• Se coloca en el primer tubo y se forma 1/10 de ese mismo tubo se saca
un 1ml y se coloca en una placa.
• De la dilución 1/10 se saca un 1ml y se coloca en el segundo tubo, se
forma 1/100, se extrae 1ml y se coloca en una placa.
• De la dilución 1/100 se saca 1ml y se coloca en el tercer tubo que es
forma una dilución de 1/1000, se extrae 1ml y se coloca en una placa.

7. SIEMBRA:

● Se agrega 1ml de cada disolución a cada placa.

● Se deja enfriar un poco el medio y se agregan 15ml a cada placa con la
disolución.
● Se llevan las placas a la estufa de cultivo entre 24 a 48hs.

8. RECUENTO y CALCULOS:

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9. INFORME:

Recuento Criterio Resultado Cumple

Enterobacterias m=3 3.920 NO
(Coliformes)

10. OBSERVACION MICROSCOPICA:

10.1. Preparación de extendido en estado natural:

 Se deposita una gota de solución fisiológica sobre el portaobjetos.
 Con un ansa esterilizada, se toma una muestra de la placa que se
desea observar.
 Se coloca esa muestra en la gota de solución fisiológica y se cubre con
un cubreobjetos.

10.2. Preparación de extendido por método coloración de Gram:

 Se coloca una gota de solución fisiológica sobre un portaobjetos y se
coloca una muestra del material problema, luego se extiende por el
portaobjetos
 Se seca sosteniéndolo a 20cm de una llama por unos minutos.
 Se fija pasando el portaobjetos 3 veces por la llama directa.
 Luego se le coloca violeta genciana por 3 minutos y se lava con
solución fisiológica
 Posteriormente se emplea el lugol y se deja actuar por 1 minuto, luego
se lava con solución fisiológica
 Después de retirar el lugol, se coloca un decolorante por 30 segundos y
se lava con solución fisiológica.

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  Por último se coloca Fuccina o Safranina por 2 minutos y se lava con
solución fisiológica.

Se observó en el microscopio lo siguiente:

Cocos
aislados Gram
+

Hifa de un
Estafilococos en
11. CONCLUSIÓN:

● Se observó un desarrollo de coliformes ya que hubo contaminación

cruzada.
● El criterio del CAA no emite el criterio microbiológico de coliformes y los
mismos están incluidos dentro del grupo de enterobacterias, se tomó el nº
m=3.
Opciones:
-Por mala higiene de la heladera porque anteriormente se cultivaron
coliformes.
-Mala higiene de la mesada.

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