UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

FACULTAD: CIENCIAS FARMACÉUTICAS,

BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS

ESCUELA: FARMACIA Y BIOQUIMICA

CURSO: INMUNOLOGIA

PRACTICA 2: SEPARACION Y VIABILIDAD CELULAR

DOCENTE: KARIN VERA LOPEZ

ALUMNA: CARMEN ROSA CANAZA YANA

AÑO 2022
 Resultados

Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica y sacar sus conclusiones
de los resultados obtenidos.

Extraer 3 ml sangre Diluir la muestra de En un tubo de

sangre centrifuga colocar 3ml

Añadir sangre diluida Tener cuidado que no

dejándolo resbalar centrifugar
se mescle las capas

Aspirar el anillo Lavar las células Aspirar el

blanquecino sobrenadante

Coger con la micropipeta Llevar al microscopio

Preparan la dilución
la dilución poner en la para el conteo de las
con azul de tripan
cámara Neubauer células
Observar cada cuadrado (A, B, C y D), anotando el número total de células y el número
de células teñidas de azul (Debe realizarse en menos de 5 min, pues pasado este tiempo
la mortalidad aumenta por el propio colorante.)16. Calcular número de células
totales/ml y el porcentaje de viabilidad

Se conto 11 células vivas el porcentaje seria 37% el valor seria muy bajo

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la composición del Ficoll-Hypaque y cual la función de cada uno
de sus componentes?

La solución de ficoll-hypaque tiene una densidad de 1,077 Y está compuesta de: 20 ml

de hypaque sódico 50% P/Y, mas 6,34 g de ficoll (PM 400.000),
El Ficoll es un polímerode carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene
yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su
mayor densidad = 1.077), y que floten las células mononucleares (linfocitos y
monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será fácil obtener las células
mononucleares de sangre periférica.

2. ¿Existen otros métodos de separación de linfocitos además del método de

centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll – Hypaque? Mencione cuáles.
Para la separación de linfocitos se utiliza sangre que se ha desfibrinada o tratada con
anticoagulantes (Heparina, EDTA, Citrato), y que se diluye de una a tres veces (según el
nivel de hematocrito de la muestra de sangre) con una solución salina fisiológica.
Luego, para la separación, la solución de Pancoll se cubre con la de sangre diluida en un
tubo de centrífuga, teniendo cuidado de no mezclar las fases.
2.¿Por qué es necesario diluir la sangre antes de realizar el procedimiento de
separación con Ficoll-Hypaque?
Es necesario diluir con el fin de que estos se separaran debido a la sedimentación de los
grumos.
4. ¿Qué factores podrían alterar la separación linfocitos con Ficoll-Hypaque?
Los factores que afectan los procedimientos es la cantidad de sangre a procesar debe
guardar proporción con el volumen y la altura del medio de separación. Al aumentar la
altura del estrato de sangre con respecto a la altura del medio, se aumenta la
contaminación con eritrocitos en la interfase. Por esto, el diámetro del tubo es un factor
importante para establecer el volumen de sangre óptimo para fraccionar. Para aumentar
el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el diámetro del tubo, tratando de no
variar la altura de las capas de medio y de sangre.
5. Explique alguna técnica para la separación de Linfocitos T.
Se emplear la técnica mediana por marcadores de superficie celular por ejemplo la
clasificación de células activas por magnetismo MACS para aislar a un más
subconjuntos específicos de linfocitos T
6. Mencione diferentes técnicas que necesiten del aislamiento de linfocitos como
paso previo a su desarrollo
Método 1. Selección con solución amortiguadora de amonio-cloruro-potasio (ACK) y
adherencia empleando anticuerpos anti-CD3 (anti-CD3).
Método 2. Selección con Ficoll y adherencia empleando anti-CD3: Se agregó el
precipitado celular Re suspendido en 4 mL de RPMI-1640 con 3 mL de Ficoll Paque
PLUS y se centrifugó a 400 g durante 30 minutos. Se separó la capa superior sin
perturbar los linfocitos acumulados en la interfaz.
Método 3. Selección negativa empleando microesferas magnéticas: Para estos ensayos
se utilizó un kit de selección negativa para linfocitos T por microesferas magnéticas. Se
Re suspendió el precipitado celular a una concentración de 1 x 107 células/mL y se
tomaron 500 µL, a los que se agregó 100 µL de SFB inactivado por calor a 56°C
durante 30 minutos y 100 µL de mezcla de anticuerpos del kit. Se incubó durante 20
minutos a 4°C.
7. ¿Por qué se usa el azul de Tripán para la determinación de la viabilidad?
La tinción con azul tripán, azul tripano o tripán blue nos permite distinguir las células
no viables de las viables expresando en función del porcentaje de estas últimas su
viabilidad.
8. ¿Qué otros colorantes pueden ser usados para determinar la viabilidad?
ficoll-diatrizoato. Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los
linfocitos presentes en la muestra, con una viabilidad mayor del 90% (determinada
mediante exclusión del azul tripán, ver abajo).
9. ¿Qué es un cultivo celular primario
Los cultivos celulares, también llamados cultivos primarios, son conjuntos de células
del mismo tipo que son aisladas de un tejido animal o vegetal; para progresar requieren
factores de crecimiento como aminoácidos, sales, vitaminas y algunos otros nutrientes
específicos para cada tipo.