Firmado digitalmente por GUTIERREZ

IPARRAGUIRRE Geovanna Geraldine

FAU 20552196725 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 13.04.2022 14:26:49 -05:00

GUÍA DE PROCEDIMIENTO: INMUNOCITOQUÍMICA

Firmado digitalmente por UGAS
CHARCAPE Carlos Federico FAU
20552196725 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 14.04.2022 12:15:21 -05:00

“GUÍA DE PROCEDIMIENTO: INMUNOCITOQUÍMICA”

Firmado digitalmente por PORTELLA
MENDOZA Julio Eduardo FAU
20552196725 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 18.04.2022 14:29:21 -05:00

UNIDAD DE SOPORTE AL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO

Firmado digitalmente por VELIZ
SUB UNIDAD DE SOPORTE AL DIAGNÓSTICO SILVA Emma Victoria FAU
20552196725 soft
Motivo: Soy el autor del documento
Fecha: 22.04.2022 13:20:26 -05:00

ANATOMÍA PATOLÓGICA

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Dra. Elizabeth Zulema Tomas

Sub Unidad de Soporte al
 Unidad de Soporte al
Diagnóstico – Anatomía
Diagnóstico y Tratamiento
Patológica  Unidad de Gestión de la
Calidad
Gonzales de Palomino
Directora General Instituto
Nacional de Salud del Niño –
San Borja

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 GUÍA DE PROCEDIMIENTO: INMUNOCITOQUÍMICA

GUÍA DE PROCEDIMIENTO: INMUNOCITOQUÍMICA

I. Título........................................................................................................................................................................3
II. Finalidad.................................................................................................................................................................3
III. Objetivos.................................................................................................................................................................3
a. Objetivo General………………………………………………………………………………………………………….3
b. Objetivo Específico……………………………………………………………………………………………………...3
IV. Ámbito de aplicación .........................................................................................................................................3
V. Nombre del Proceso o Procedimiento a Estandarizar y Código CPMS.........................................3
VI. Consideraciones Generales.............................................................................................................................3
a. Definiciones Operativas .............................................................................................................................3
1. Definición del Procedimiento ...................................................................................................................3
2. Aspectos epidemiologicos importantes................................................................................................4
3. Consentimiento informado ........................................................................................................................4
b. Conceptos Básicos ........................................................................................................................................4
c. Requerimientos Básicos ............................................................................................................................6
VII. Consideraciones Específicas ..........................................................................................................................7
a. Descripción detallada del Proceso o Procedimiento: ....................................................................7
b. Indicaciones ................................................................................................................................................. 12
c. Riesgos o Complicaciones Frecuentes: ............................................................................................. 12
d. Riesgos o Complicaciones poco Frecuentes: .................................................................................. 12
e. Contraindicaciones ................................................................................................................................... 12
VIII. Recomendaciones ............................................................................................................................................ 12
IX. Autores, Fecha y Lugar .................................................................................................................................. 13
X. Anexos .................................................................................................................................................................. 14
XI. Bibliografía ......................................................................................................................................................... 19

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I. TÍTULO

GUÍA DE PROCEDIMIENTO: INMUNOCITOQUÍMICA

II. FINALIDAD

Establecer los lineamientos correctos para un adecuado procesamiento de las muestras de

Inmunocitoquímica garantizando un procesamiento de calidad para un diagnóstico
definitivo.

III. OBJETIVOS

a. Objetivo general:

Asegurar la calidad de los procedimientos realizados para la técnica de

Inmunocitoquímica.

b. Objetivos Específicos

Estandarizar los procedimientos de la técnica de Inmunocitoquímica y uniformizar el

proceso.

IV. ÁMBITO DE APLICACIÓN

La presente Guía de Procedimiento de Inmunocitoquímica tiene como ámbito de

aplicación al área de Inmunocitoquímica de Anatomía Patológica del INSNSB.

V. NOMBRE Y CÓDIGO

 INMUNOCITOQUÍMICA (incluyendo Inmunoperoxidasa en tejidos), cada anticuerpo.

Nombre del Procedimiento Código CPMS

Inmunocitoquímica 88342

VI. CONSIDERACIONES GENERALES

a. Definiciones operativas

1. Definición del procedimiento

Técnica mediante la cual se detecta la presencia de un péptido o proteína en una célula,

utilizando un anticuerpo (monoclonal ó policlonal, IgG ó IgM) específico contra él. La
técnica está basada en la reacción antígeno–anticuerpo y por ello el anticuerpo primario

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que se utilice debe haber sido generado en una especie diferente a la que se está
estudiando.

2. Aspectos epidemiológicos importantes

No aplica

3. Consentimiento informado
No aplica

b. Conceptos básicos

1. Inmunocitoquímica:
Las técnicas inmunocitoquímicas permiten el análisis de una población homogénea
obtenidas por métodos de concentración de células, donde es evaluado el antígeno
específico que se desea investigar a fin de determinar el fenotipo madurativo de la célula y
su compromiso clonal. Las leucemias y linfomas son procesos neoplásicos del tejido
hematopoyético cuyas células presentan generalmente una expresión característica de
antígenos tanto citoplasmático como de superficie. La identificación de un antígeno es
importante para establecer un correcto diagnóstico en muchas de estas enfermedades.

2. Permeabilización:
Es importante el buffer a utilizar para la permeabilización de las células para obtener
mejores resultados, el reactivo es el mismo que el utilizado para la recuperación de
epítopes en la técnica de Inmunohistoquímica. Los equipos usados para este proceso en
los laboratorios es el baño maría y la olla a presión, la temperatura alcanzada es de 96°C a
presión completa.

3. Bloqueo de la Peroxidasa endógena:

Las actividades peroxidásicas y pseudoperoxidásicas (catalasa, citocromo-oxidasa,
hemoglobina y mioglobina) están presentes en un número de células normales y
neoplásicas. La fijación inactiva esta actividad en algunas células no obstante persiste en
los eritrocitos, granulocitos e histiocitos o algunos otros. Debido a esto existe el riesgo de
obtener falsos resultados positivos o marcación de “fondo”, es necesario la aplicación de
una mezcla de peróxido de hidrogeno al 3% para el bloqueo de la actividad de la
peroxidasa endógena. Para prevenir la evaporación de los reactivos, las incubaciones se
llevan a cabo en una atmósfera húmeda preferentemente en cámaras de incubación, de
esta forma se ahorra considerable cantidad de reactivos.

4. Lavados:
En cualquier procedimiento inmunocitoquímico es preciso eliminar residuos de peróxido
y todo rastro de anticuerpo no unido al antígeno durante una incubación antes de pasar al

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siguiente paso. Esto se realiza lavando después de cada paso con la solución de lavado que
consiste en un buffer PBS pH 7 o Tris Buffer Salino (TBS) pH 7.6

5. Antígeno (Ag):
Es una sustancia que desencadena la formación de anticuerpos y puede causar
una respuesta inmunitaria. La definición moderna abarca todas las sustancias que pueden
ser reconocidas por el sistema inmune adaptativo, bien sean propias o ajenas. Cada
antígeno está definido por su anticuerpo, los cuales interactúan por complementariedad
espacial. La zona donde el antígeno se une al anticuerpo recibe el nombre de epítopo
o determinante antigénico.

6. Anticuerpo (Ac):
Los anticuerpos (también conocidos como inmunoglobulinas) son glucoproteínas. Aunque
la estructura general de todos los anticuerpos es muy semejante, una pequeña región del
ápice de la proteína es extremadamente variable, lo cual permite la existencia de millones
de anticuerpos, cada uno con un extremo ligeramente distinto. A esta parte de la proteína
se la conoce como región hipervariable. Cada una de estas variantes se puede unir a una
"diana" distinta, que es lo que se conoce como antígeno y la zona donde el anticuerpo se
une al antígeno se le conoce como parátopo.

7. Incubación del anticuerpo:

Reacción antígeno-anticuerpo. El anticuerpo es colocado cubriendo la muestra adherido a
la lámina para que se lleve a cabo la reacción antígeno-anticuerpo.

8. Tinción de fondo:
Es uno de los principales problemas de la técnica Inmunocitoquímica. Es toda tinción que
aparece donde no debería haberla, desde tinciones inespecíficas (debido a reacciones
antígeno-anticuerpo con antígenos no deseados) hasta un marcaje general de todo las
células. Las causas son diversas y deben tener en cuenta para intentar corregir los
problemas de fondo cuando se detectan, por ejemplo, reducir el tiempo de incubación del
anticuerpo primario y secundario.

9. Detección de la reacción antígeno- anticuerpo:

Para la detección de la reacción se utilizará un polímero marcado con HRP (peroxidasa)
conjugado con anticuerpos secundarios que se une al anticuerpo primario.

10. Visualización de la reacción:

Se utiliza la Diaminobencidina (DAB) + Buffer diluyente, preparación que se conoce como
solución cromógena. La DAB es el sustrato de la enzima peroxidasa y al unirse a ésta
genera una reacción, la cual es visualizada con un precipitado marrón oscuro.

11. Contratinción con hematoxilina:

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Procedimiento por el cual los portaobjetos son sumergidos en hematoxilina. La duración

depende de la maduración de la Hematoxilina usada. Se realiza para dar contraste a las
células.

c. Requerimientos básicos

1. Equipos Biomédicos

 Centrífuga
 Baño María
 Microscopio
 Refrigeradora

2. Materiales no fungibles

 Clip de sujeción
 Cámara citológica
 Coplins
 Lápiz punta diamante
 Cámara húmeda para incubación de anticuerpos
 Pizeta
 Micropipetas
 Plumón hidrofóbico
 Pinza

3. Materiales Fungibles
 Tarjeta de filtro
 Buffer de recuperación con EDTA
 Buffer de lavado
 Anticuerpo primario
 Polímero (HRP)
 Solución cromógeno
 Láminas cargadas
 Tips
 Lamillas

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 Guantes de nitrilo

VII. CONSIDERACIONES ESPECÍFICAS

a. Descripción del Procedimiento

1. RECEPCIÓN DE SOLICITUD

1.1 Recepcionar la solicitud de estudio Estudios especiales. (Anexo 2)

1.2 Verificar el código AP de la solicitud (Ej. 21C-150) y los marcadores solicitados.

(Anexo 2)

1.3 Registrar en la bitácora del área de Inmunocitoquímica lo solicitado. (Anexo 3)

2. CENTRIFUGACIÓN DE LA MUESTRA

2.1 Rotular una lámina cargada con el código del caso.

2.2 Colocar en el clip de sujeción la lámina, luego sobre la lámina colocar la tarjeta
filtro y la cámara de citología. Ajustar el clip de sujeción con un correcto sellado.
Figura 1

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Fig 1. Inicio del proceso de centrifugación

Área de Inmunocitoquímica de Anatomía Patológica

2.3 Verificar que la muestra corresponda con los datos del paciente y la orden. Agregar
a la cámara de citología 800 ul de muestra y tapar la cámara.

2.4 Colocar la muestra a centrifugar por 8 minutos a 1 200 RPM.

2.5 Realizar la descripción macroscópica de la muestra, indicando el color, aspecto,

volumen de la muestra y si se procesa todo.

2.6 Trascurrido el tiempo retirar la cámara, descartar la tarjeta filtro y por la parte
posterior de la lámina delimitar con lápiz diamante la muestra. Figura 2

2.7 Colocar la lámina en un coplin con alcohol corriente para su fijación. Esperar
mínimo 2 minutos para su procesamiento.

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Fig 2. Retiro de lámina después del centrifugado.

Área de Inmunocitoquímica de Anatomía Patológica

3 PROCESAMIENTO PARA PRUEBA DE INMUNOCITOQUÍMICA MANUAL

3.1 Prender el Baño María. Calentar a una temperatura de 96°C.

3.2 Retirar de la refrigeradora el buffer de recuperación, este paso se realiza para la

permeabilización de las células. Dejar atemperar por 5 minutos.

3.3 Colocar el buffer de recuperación en coplins e introducirlos por 10 minutos al Baño

María a 96°C.

3.4 Colocar las láminas en los coplins precalentados y dejarlos en temperatura

ambiente por un tiempo de 10 minutos.

3.5 Cumplido el tiempo, retirar la tapa de los coplins y dejar reposar a temperatura
ambiente por 5 a 10 minutos aproximadamente.

3.6 Retirar una a una las láminas y lavar con buffer de lavado para retirar los residuos
del buffer de recuperación.

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3.7 Secar los bordes de cada una de las láminas y marcar con plumón hidrofóbico
alrededor de la muestra y del control.

3.8 Agregar inmediatamente el peróxido de hidrogeno 3% por 10 minutos (especial

cuidado en no dejar secar el tejido).

3.9 Lavar con buffer TBS tween 20 dejando reposar por 3 minutos, repetir 2 veces.

3.10 Agregar el anticuerpo primario prediluido o concentrado (dilución según anticuerpo

a usar) por 40 minutos. Figura 3

Fig 3. Inicio del proceso de centrifugación

Área de Inmunocitoquímica de Anatomía Patológica

3.11 Repetir paso N° 10 (lavados con buffer de lavado).

3.12 Agregar inmediatamente el reactivo post primario (amplificador de anticuerpo)

por 20 minutos.

3.13 Repetir paso N° 10 (lavados con buffer de lavado).

3.14 Agregar el polímero (HRP) por 30 minutos.

3.15 Repetir paso N° 10 (lavados con buffer de lavado).

3.16 Agregar la solución cromógena (DAB 1 gota + Buffer diluyente DAB 1000µl) de 1 a
5 minutos.

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3.17 Lavar con buffer TBS tween 20, humedecer nuevamente.

3.18 Adicionar el reactivo de DAB ENHANCER (amplificador de reacción).

3.19 Observar al microscopio la reacción que se va originando, pues algunos

anticuerpos tienden a hacer tinción de fondo.

3.20 Lavar con agua corriente y proceder a contrastar.

4 CONTRASTE DE MUESTRAS

4.1 Contrastar con Hematoxilina de Harris por 10 a 15 segundos. Modificar tiempo

según la maduración del colorante. Lavar con agua corriente por 1 minuto.

4.2 Pasar por Agua alcalina entre 3 a 5 segundos y después lavar con agua corriente.

4.3 Observar al microscopio e incrementar el tiempo de hematoxilina si fuese

necesario.

Fig 4. Retiro de lámina después del centrifugado.

Área de Inmunocitoquímica de Anatomía Patológica

5 MONTAJE DE LÁMINAS

5.1 Realizar la deshidratación con alcoholes de menor a mayor concentración: Dos

alcoholes corrientes de 96°C y dos alcoholes absolutos 99.6°C por 2 minutos cada
uno.

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5.2 Realizar el aclaramiento de las muestras con xilol o sustituto de xilol.

5.3 Colocar las laminillas cubre objeto en la mesa y agregar una gota de solución de
montaje (Entellan o Neoclear).

5.4 Tomar una lámina con la muestra hacia bajo y presionar levemente sobre la
laminilla.

5.5 Limpiar con una tela el exceso de solución de montaje.

5.6 Digitar en el SIS-GalenPlus la macroscopía de la muestra.

5.7 Etiquetar las láminas según el código correspondiente.

6 ENTREGA DE LÁMINAS

8.1 Entregar láminas al Médico Patólogo correspondiente (Anexo 4).

b. Indicaciones

La Inmunocitoquímica es una técnica utilizada como apoyo al diagnóstico Médico

especializado. Es indicada para la tipificación de diferentes enfermedades y como estudio
complementario de casos que cuentan con cierta complejidad.

c. Riesgos o complicaciones frecuentes

Desprendimiento de las muestras de las láminas. Dejar secar bien las láminas y fijarlas e
hidratarlas con los tiempos correspondientes.

d. Riesgos o complicaciones poco frecuentes

Reacción inadecuada de anticuerpos empleados. Verificar fecha de caducidad, procedencia

de casa comercial y ajustar tiempos.

E. Contraindicaciones

Muestras con exceso de celularidad, éstas deberán de ser ligeramente diluidas para una
mejor visualización de las mismas.

VIII. RECOMENDACIONES

- Durante la fijación, se debe tener ciertas consideraciones para evitar la pérdida de las
moléculas que se desea detectar en Inmunocitoquímica. La fijación debe ser suficiente

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para que la muestra quede bien fijada pero no excesiva para evitar deterioros o
alteraciones del tejido.

- Verificar que se cuente con todos los reactivos necesarios para el proceso esto ayudará a
evitar el gasto innecesario de otros reactivos.

- Temperar los reactivos antes de ser usados por 10 a 15 minutos. Respetar los tiempos
establecidos

- Los resultados de Inmunocitoquímica deben ser correlacionados con los resultados

obtenidos en la coloración de hematoxilina y eosina, así como estudios de
inmunofluorescencia y microscopia electrónica, si fuera necesario, para un adecuado
diagnóstico.

- Cada vez que se cambie de casa comercial y/o clona de determinado anticuerpo pueden
presentarse cambios en los protocolos estandarizados por lo cual este debe ser
estandarizado nuevamente para un óptimo resultado. (Anexo n°4)

IX. AUTORES, FECHA Y LUGAR

- Lista de Autores y correos electrónicos:

Lic. T.M. Susan Ramos Meza

sramosm@insnsb.gob.pe

- Fecha de elaboración y lugar del procedimiento

Abril 2022, Instituto Nacional Del Niño San Borja/Servicio de Anatomía Patológica.

- Vigencia: 3 años, a partir de su aprobación

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XII. ANEXOS
ANEXO N°1: FLUJOGRAMA DE LA TÉCNICA DE INMUNOCITOQUÍMICA

ANATOMIA PATOLÓGICA
MACROSCOPIA ÁREA DE PROCESAMIENTO PATÓLOGO

INICIO

Recuperación Registrar casos en la

Verificar datos de antigénica bitácora de IHQ (Anexo 2)
la muestra con la (Permeabilización)
orden

Realizar la Entregar las

Registrar casos en el registro
Centrifugación de detección de de entrega de láminas a láminas al patólogo
muestra para antígenos según correspondiente.
microscopia (Anexo 3)
procesamiento de lo solicitado.
ICQ
a

Contraste de muestras Revisar las láminas al Deshidratar, montar y

con coloración HyE microscopio etiquetar las láminas FIN

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ANEXO N°2: SOLICITUD DE ESTUDIO DE COLORACIONES ESPECIALES

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ANEXO 3: BITACORA DEL ÁREA DE INMUNOCITOQUÍMICA

FECHA CÓDIGO PROCEDENCIA MARCADORES PATÓLOGO CANTIDAD

IHQ

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ANEXO N° 4: REGISTRO DE ENTREGA DE LÁMINAS A MICROSCOPIA

FECHA CODIGO IHQ HQ IFI MÉDICO FIRMA

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ANEXO N°5: ÁREA DE INMUNOCITOQUÍMICA INFORMACIÓN DE ANTICUERPOS

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XI. BIBLIOGRAFIA

1. Del Brío A, Riera P. Manual de bases teórico practices de Inmunocitoquímica. España.

Universidad de Oviedo. 1995

2. Diaz N, Lardo M, Romero Jorge. Aplicación de técnicas inmunocitoquímicas para el

diagnóstico de neoplasias hematológicas. Buenos Aires. Hospital de Clínicas José de San
Martín. 1999

3. Kalyuzhny A. Immunohistochemistry Essential elements and beyond. 2da ed. United

States of America. Springer. 2016

4. Martín Lacave I, Gracía Caballero T. Atlas de Inmunohistoquimica. Bases conceptuales en

Inmunohistoquímica. 3era ed. España. Diaz de Santos. 2012

5. Buchwalow I, Böcker W. Inmunohistochemistry: Basics and Methods. 2da ed. Germany.

Springer. 2010

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