PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

Técnicas de coloración
no histoquímicas.
Tinciones para la
visualización de
microorganismos

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 / 1. Introducción y contextualización práctica 3

/ 2. Técnicas de coloración no histoquímicas para la

identificación de sustancias 4
2.1. Lípidos 4
2.2. Glucógeno 5
2.3. Mucina y fibrina 6
2.4. Tejido conjuntivo: Fibras de colágeno y elásticas 6
2.5. Tejido nervioso 7

/ 3. Caso práctico 1: “Tinción de Van Gieson” 8

/ 4. Caso práctico 2: “Otras técnicas de impregnación con metales” 8

/ 5. Tinciones para la visualización de microorganismos 8

5.1. Tinción de Gram 9
5.2. Tinción de Ziehl-Neelsen 10

/ 6. Caso práctico 3: “La tinción de Wright” 10

/ 7. Resumen y resolución del caso práctico inicial 10

/ 8. Bibliografía 11

© MEDAC ISBN: 978-84-18983-71-9

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 Clasificar las técnicas de coloración no histoquímicas en función de la sustancia
que tiñan.

Dominar las distintas tinciones para la visualización de microorganismos.

/ 1. Introducción y contextualización práctica

Como vimos en el tema anterior, dentro de las técnicas de tinción generales podemos diferenciar entre aquellas
técnicas que, o bien pueden teñir el conjunto del tejido, o bien pueden teñir determinadas estructuras debido a su
composición.

Estas últimas son llamadas técnicas de coloración no histoquímicas para la

identificación de sustancias y serán objeto de estudio a lo largo del presente
tema.

Además, la unidad se completará con un análisis de las principales tinciones

empleadas para la visualización de microorganismos.

Escucha el siguiente audio donde planteamos la contextualización práctica

de este tema, encontrarás su resolución en el apartado resumen y resolución
del caso práctico. Fig.1. Técnica de Ziehl-Neelsen.

Audio Intro. “Inconvenientes de la

tinción de Gram”
https://bit.ly/3Cbdfo9
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Procesamiento citológico y tisular /4

/ 2. Técnicas de coloración no histoquímicas para la

identificación de sustancias
Como ya hemos indicado, las técnicas de coloración no histoquímicas para la identificación de sustancias son
aquellas que tiñen determinadas estructuras de la muestra histológica debido a su composición.

Es importante diferenciar esta de las técnicas de tinción basadas en histoquímica que, para colorear y destacar
determinadas sustancias o moléculas de la muestra a estudio, deben ser modificarlas químicamente (cosa que no
ocurre en las no histoquímicas).

Las técnicas de coloración no histoquímicas para la identificación de sustancias se basan en las propiedades físicas
del colorante, propiedades que no implican cambios en la composición del tejido.

La solubilidad y carga eléctrica de algunos colorantes son factores que determinan la especificidad y selectividad del
método de coloración para algunas estructuras biológicas, por ejemplo:

• Algunos colorantes altamente lipofílicos son empleados en la tinción de ácidos grasos, colesterol, etc.

• El carmín puede emplearse con ayuda de un mordiente (sustancia para fijar los colores) en la tinción de
polisacáridos como el glucógeno o proteínas como la mucina.

A pesar de ser muy selectivos, los colorantes que se aplican en estas técnicas
de coloración no histoquímicas no presentan demasiada especificidad.
Realmente, la visibilidad del método de coloración dependerá de la cantidad
de biomacromoléculas que presente el espécimen de estudio.

En los próximos apartados de la unidad profundizaremos en las técnicas

de coloración no histoquímicas para la identificación de lípidos, glucógeno,
mucina y fibrina, fibras de colágeno y elásticas y estructuras del tejido Fig.2. El colorante Sudán es un ejemplo de
nervioso. colorante altamente lipofílico.

2.1. Lípidos
La coloración de lípidos con técnicas de coloración no histoquímicas implica el uso de colorantes insolubles en agua
y muy lipofílicos, que se disuelven coloreando la molécula lipídica.

Este tipo de coloración se realiza frecuentemente en secciones obtenidas por congelación o tejidos fijados con
formalina o líquido de Bouin (ambas soluciones fijadoras no disuelven las moléculas de naturaleza lipídica).
Los lípidos se clasifican en:

• Homofásicos, es decir, concentrados en una zona concreta de la célula. Cuando están distribuidos así, la
técnica no histoquímica más utilizada es la tinción con Sudán IV.

» El Sudán IV es un colorante soluble en grasas que tiñe la molécula lipídica de color rojizo-naranja brillante.

» Otra opción es la variante Sudán Negro, que tiñe los núcleos y citoplasma de rojo, y los lípidos y mielina
de negro.

» Adicionalmente, está el Azul de Nilo (conocido como método de Lillie), que tiñe grasas neutras de rosa a
rojo y ácidos grasos de azul oscuro.

Cabe destacar que, cuanto mayor sea el tiempo de exposición de la muestra a los colorantes citados
anteriormente, mayor será la intensidad de la tinción.
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• Heterofásicos, es decir, mezclados con otras macromoléculas. Para ellos, suelen utilizarse técnicas
histoquímicas como PAS (ácido peryódico de Schiff) que estudiaremos en la próxima unidad.

Fig.3. Ejemplo de tinción con Azul de Nilo en

un corte de hígado.

Audio 1. “Fundamento de la técnica con

Sudán”
https://bit.ly/3Ea3AQv

Sabías que...
Los colorantes lipofílicos no solo colorean ácidos grasos y fosfolípidos,
también tiñen ceras como la parafina.

2.2. Glucógeno
El glucógeno es el polisacárido de reserva energética de los animales, se almacena especialmente en el hígado,
músculo esquelético y cardiaco.

Existen varios métodos para su detección, tanto a través de técnicas histoquímicas (como la reacción de PAS) como
no histoquímicas. Dentro de las técnicas de coloración no histoquímicas vamos a destacar la tinción Carmín de Best.
El carmín es un colorante natural, de los más empleados en laboratorio. En concreto, el Carmín de Best es utilizado
casi exclusivamente para la identificación de glucógeno en muestras a estudio, tiñendo los núcleos de azul negruzco
y el glucógeno de rojo.

Una característica de esta técnica de tinción es que se trata de una

coloración regresiva, es decir, los tejidos son expuestos primero al carmín
hasta alcanzar una sobrecoloración, para después someterlos a la acción
de un diferenciador que elimina parte del colorante hasta obtener la
tonalidad adecuada. Tanto si se detecta el glucógeno a través de técnicas
no histoquímicas o de histoquímicas, siempre se debe tener en cuenta que
son técnicas inespecíficas, pudiendo colorear componentes como lípidos no Fig.4. El Carmín de Best logra teñir el
saturados, fibras de colágeno, mucina, fibrina, o gránulos de mastocitos. glucógeno de color rojo fresa.

Investigamos...
Busca información sobre otros tipos de carmín utilizados comúnmente
en estudios histológicos.
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Procesamiento citológico y tisular /6

2.3. Mucina y fibrina

Continuando con las técnicas de coloración no histoquímicas para la identificación de sustancias, también debemos
destacar aquellas técnicas utilizadas para la detección de mucinas y fibrinas.

Las mucinas son glucoproteínas producidas por las células de los tejidos epiteliales. En estudios histológicos, su
detección ayuda a determinar el origen de adenocarcinomas y enfermedades de naturaleza pulmonar, ya que
cuando el organismo sufre este tipo de alteraciones suele producirse una sobreproducción de mucinas.

Con respecto a esto, la tinción de Mayer (o mucicarmín), mediante un mecanismo electrostático de tinción, tiñe la
mucina ácida de rosa, los núcleos de negro y el fondo de amarillo.

Por otra parte, la fibrina es una proteína filamentosa derivada del fibrinógeno,
y está relacionada con el proceso de coagulación sanguínea. Además de por
técnicas de coloración histoquímicas (PAS), la fibrina puede ser coloreada de
manera selectiva, pero no especifica, por:

• La eosina (coloración roja).

• El método de hematoxilina férrica de Weigert (azul). Variante de la

tinción de Gram, es combinación de Orceína, Resorcinol y Fucsina.

• La tinción de Van Gieson (coloración amarilla), mezcla de ácido Fig.5. Corte de glándula submaxilar teñida con
pícrico-fucsina ácida y hematoxilina férrica de Weigert. mucicarmín.

Sabías que...
La tinción de Mayer también es utilizada para la detección de infecciones
por hongos encapsulados o Cryptococcus.

2.4. Tejido conjuntivo: Fibras de colágeno y elásticas

El tejido conjuntivo está compuesto, principalmente, por elementos celulares y fibras tisulares colágenas y elásticas.
Su función es dar soporte.

En general, las fibras de colágeno son coloreadas mediante coloraciones tricrómicas. Una de las técnicas de
coloración no histoquímicas más usadas para la tinción de las fibras de colágeno es la tinción tricrómica de Van
Gieson, que tiñe:

• Los núcleos celulares de azul oscuro por acción de la hematoxilina

férrica.
• Los citoplasmas de amarillo por la acción del ácido pícrico.
• Las fibras colágenas de rojo intenso por acción de la fucsina ácida.

Para las fibras elásticas, la técnica de coloración que se usa es el método de

la Orceína, que colorea:

• De castaño oscuro las fibras.

• Tiñe de marrón pálido el resto del espécimen.

Destaca para este tipo de muestras histológicas otro método, el método

de la hematoxilina de Verhoeff, que, a través de fenómenos electrofísicos, Fig.6. Ejemplo de muestras que contienen
diferencia entre fibras colágenas (color rojo) y elásticas (color negro). fibras elásticas teñidas con Orceína.
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2.5. Tejido nervioso

Las técnicas no histoquímicas para la coloración del tejido nervioso son semejantes a las que se utilizan para cualquier
otro tejido, aunque con algunas diferencias:

• En la solución usada.

• En los tiempos de fijación.

• En el material de inclusión.

• En la técnica de corte.

Entre las tinciones más específicas para el sistema nervioso, diferenciamos entre:

1. Las coloraciones no argénticas, no utilizan partículas metálicas en el proceso de tinción.

2. Las técnicas de impregnación con metales.

Concretamente en las coloraciones no argénticas, destacamos:

• Cresil violeta (violeta de cresilo). Este colorante, al igual que el azul de metilo y el azul de toluidina, se usa
para colorear las neuronas y cuerpos de Nissl (gránulos basófilos localizados en el citoplasma de la neurona,
rodeando al núcleo) y evaluar si hay algún tipo de daño neuronal (la pérdida de cuerpos de Nissl puede ser
indicativo de esto). Tiñe los cuerpos de Nissl y los núcleos de color violeta y las células nerviosas de azul tenue.

• Hematoxilina ácida fosfotúngstica (PTAH). Junto con la coloración de Holzer, se usa para la identificación
de los astrocitos de la glía, ayudando en la evaluación de cualquier tipo de daño o patología del sistema
nervioso central (SNC). Tiñe las neurofibrillas y miofibrillas de color azul negruzco, axones de color azul
pálido a negro, el colágeno de rojo y los astrocitos de color rojo pálido.

• Luxol fast blue. Se usa para identificar patologías de la mielina. La positividad del tejido se deberá a si hay
presencia de lipoproteínas. Tiñe la vaina de mielina de color azul o verde-azulado y las neuronas y cuerpos de
Nissl de violeta o rosado.

En relación a las técnicas de impregnación con metales, son métodos

que utilizan como base el carácter ácido y básico del tejido y metal,
respectivamente. Gracias al mecanismo físico de impregnación, las muestras
histológicas tienen la capacidad de atrapar iones argénticos (previo paso
de reducción para precipitar los metales).

La elección de una u otra técnica dependerá del órgano del sistema nervioso
que se vaya a teñir, debiendo ajustarse el tiempo de impregnación a cada
una de las zonas elegidas. La fijación, a excepción de algún método, suele
hacerse en formol tamponado.

Dentro de este tipo de técnicas, destaca el método de Bielschowsky,

método que ayuda en la identificación de placas seniles, tiñendo los axones
y dendritas de negro, las placas de color marrón y el fondo generalmente Fig.7. Corte histológico teñido con Cresil
amarillo. violeta.
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Procesamiento citológico y tisular /8

/ 3. Caso práctico 1: “Tinción de Van Gieson”

Planteamiento: En una laminilla con varias fibras nos gustaría poder diferenciar cromáticamente las fibras colágenas
del tejido conjuntivo.

Nudo: ¿Qué tinción sería la más recomendada y cómo serán sus características tintoriales?

Desenlace: Como hemos visto a lo largo del tema, para

poder distinguir las fibras colágenas de una muestra de
tejido conjuntivo debemos realizar una tinción llamada
Van Gieson, que es una tinción donde se combina la
tinción nuclear mediante Hematoxilina férrica de Weigert
con la mezcla de ácido pícrico-fucsina ácida.

Los resultados con respecto a sus características

tintoriales son:

• Colágeno: rojo rosado – rojo intenso.

• Citoplasma: amarillo anaranjado.

• Núcleos: azul oscuro – negro azulado. Fig.8. Ejemplo de muestras con tinción tricrómica de Van Gieson.

/ 4. Caso práctico 2: “Otras técnicas de impregnación

con metales”
Planteamiento: Además del método de Bielschowsky estudiado
anteriormente, existen otras técnicas de impregnación con metales
destinadas a la identificación de estructuras del sistema nervioso.

Nudo: ¿Qué otras técnicas de impregnación con metales podemos destacar

para la identificación de estructuras del sistema nervioso?

Desenlace: Otras técnicas de impregnación con metales usadas con

frecuencia en laboratorios son:

• La técnica de Golgi, técnica que tiñe de negro las neuronas, astrocitos

y glías gracias a la relación entre el nitrato de plata y el bicromato
potásico.

• La técnica de impregnación metálica de Cajal para astrocitos, técnica

comúnmente usada cuando las secciones han sido cortadas por Fig.9. Neurona teñida a través de la técnica
congelación. de Golgi.

/ 5. Tinciones para la visualización de microorganismos

Los métodos de tinción para visualización de microorganismos proporcionan el contraste necesario para distinguir
entre el microbio y el medio que le rodea o para apreciar las diferentes estructuras internas de la célula microbiana.
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Las tinciones en microbiología se clasifican en tres grupos:

• Tinciones simples. Se usa un único colorante (ácido, básico o indiferente). Dentro de las tinciones simples
destaca la tinción negativa, técnica que se basa en la obtención de un fondo oscuro donde poder resaltar al
microorganismo o partes de este sin teñir.

Un ejemplo de colorante empleado para tinción negativa es la tinta china (ayuda en la detección la especie
Cryptococcus neoformans, microorganismo causante de la meningitis).

• Tinciones específicas o estructurales, ayudan a identificar

una determinada estructura microbiológica. Se emplean en
casos anticuerpos marcados con moléculas fluorescentes
(inmunocitoquímico).

• Tinciones diferenciales. Se usa más de un colorante.

Ejemplos de este tipo son la tinción de Gram y la tinción de Ziehl- Fig.10. Ejemplo de tinción negativa con tinta
Neelsen, tinciones que estudiaremos en los siguientes apartados. china.

5.1. Tinción de Gram

La tinción de Gram es una de las tinciones diferenciales más conocidas gracias a su sencillez y eficacia. Usa dos
colorantes, cristal violeta y safranina, y tiene su base en la composición de la pared celular bacteriana: existen
bacterias que presentan una capa gruesa de peptidoglicano (las conocidas como bacterias Gram positivas) y otras
cuya capa de peptidoglicano es fina (las conocidas como bacterias Gram negativas). El peptidoglicano o mureína
es un polímero que confiere una gran resistencia a las bacterias y es el responsable de retener el tinte durante esta
tinción.

A la hora de proceder con la tinción, se siguen los siguientes pasos:

1. Primero se pone en contacto la muestra a estudio con el cristal violeta, colorante con afinidad por el
peptidoglicano.

2. Posteriormente, se aplica lugol, una disolución que actúa como mordiente, impidiendo la salida del cristal
violeta gracias a la formación de complejos cristal violeta–yodo que saturan los espacios existentes.

3. A continuación, se añade una mezcla de alcohol-acetona, deshidratando la pared bacteriana y cerrando sus
poros.

4. Finalmente, se aplica el colorante safranina,

tiñendo aquellas bacterias que no pudieron
retener los complejos formados por el cristal
violeta y el lugol.

Las bacterias Gram positivas, con mayor peptidoglicano,

se visualizan de color morado, mientras que las bacterias
Gram negativas se visualizan de color rojo, rosa o
grosella.

La tinción de Gram es muy utilizada para el estudio

de infecciones neumocócicas, por estafilococos o por
estreptococos. Fig.11. Bacterias en tinción de Gram.
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Procesamiento citológico y tisular / 10

5.2. Tinción de Ziehl-Neelsen

Otra tinción diferencial en microbiología es la tinción de Ziehl-Neelsen. La tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción
muy rápida y bastante económica, usada principalmente para identificar microorganismos patógenos como, por
ejemplo, la especie Mycobacterium tuberculosis (ayuda en el diagnóstico de la tuberculosis) o el género Apicomplexa.

Esta técnica nos da información sobre la capacidad de algunas bacterias

para resistir la decoloración causada por ácidos y alcoholes, gracias al alto
contenido de lípidos y grasas en la pared celular.

La tinción de Ziehl-Neelsen utiliza dos colorantes, el carbol-fucsina (con

gran afinidad por los ácidos micólicos de la pared celular, se necesita calentar
la muestra a estudio) y el azul de metileno (se utiliza como contratinción).

Aquellos microorganismos que sean ácido resistentes se presentarán en Fig.12. Bacterias Mycobacterium tuberculosis
color rojo fucsia sobre un fondo azul claro. identificadas con la tinción de Ziehl-Neelsen.

Vídeo 1. “Procedimientos de tinción de

Gram y Ziehl-Neelsen”
https://bit.ly/3C3bxoE

/ 6. Caso práctico 3: “La tinción de Wright”

Planteamiento: Además de las vistas anteriormente, dentro del grupo de tinciones diferenciales más usadas para
conseguir la visualización de microorganismos no podemos olvidar la tinción de Wright.

Nudo: ¿En qué consiste la tinción de Wright? ¿Qué aplicaciones tiene en microbiología?

Desenlace: La tinción de Wright es una tinción usada en microbiología

para identificar hematozoarios (como, por ejemplo, especies del género
Plasmodium o Leihsmania) en frotis de sangre periférica o de médula ósea.
Para ello, utiliza como colorantes la eosina y el azul de metileno, pudiendo así
colorear tanto compuestos básicos como ácidos, respectivamente.

Aplicando esta técnica, obtendremos ácidos nucleicos de color azul,

consiguiendo diferenciar a los microorganismos parásitos que se sitúan en
el interior de los eritrocitos. Fig.13. Tinción de Wright.

/ 7. Resumen y resolución del caso práctico inicial

Dentro de las técnicas de tinción generales están las técnicas de coloración no histoquímicas para la identificación
de sustancias, que son aquellas que pueden teñir determinadas estructuras de la muestra histológica debido a su
composición. Estas técnicas se basan en las propiedades físicas del colorante, propiedades que no implican cambios
en la composición del tejido. Ejemplos de estas son la tinción con Sudán IV para identificar moléculas de naturaleza
lipídica, el Carmín de Best para la identificación de glucógeno o la tinción tricrómica de Van Gieson para detectar
fibras de colágeno.

Por otro lado, los métodos de tinción para visualización de microorganismos proporcionan el contraste necesario
para distinguir entre el microbio y el medio que le rodea o para apreciar las diferentes estructuras internas de la
célula microbiana.
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/ 11 MEDAC · Instituto Oficial de Formación Profesional

Podemos diferenciar tres tipos de tinciones: tinciones simples (por ejemplo, la tinción negativa), tinciones específicas
o estructurales (inmunocitoquímico) y tinciones diferenciales (por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-
Neelsen).

Lípidos

Glucógeno
Técnicas de coloración no histoquímicas.

Técnicas de coloración no Mucinas y fibrinas.

histoquímicas
Tinciones para visualización de

Fibras de colágeno y elásticas

microorganismos

Tejido nervioso

Tinciones simples (tinción negativa)

Tinciones para visualización de

microorganismos Tinciones específicas o estructurales

Ttinciones diferenciales (tinción de Gram y

tinción de Ziehl-Neelsen)

Fig.14. Esquema resumen del tema.

Resolución del caso práctico de la unidad

Como comentábamos al principio del tema, la tinción de Gram es una de las técnicas de coloración más usadas en
el área de histología y microbiología, pero puede presentar algún que otro inconveniente a la hora de su aplicación
como, por ejemplo:

• Contaminaciones con otros microorganismos.

• Imposibilidad de visualizar algunas bacterias como las pertenecientes a los géneros Legionella o Bartonella,
etc.

/ 8. Bibliografía
De Pablo, E; Espinosa, P.; Sanz, J. (2016). Procesamiento citológico y tisular. Grupo Arán.

Muñoz Muñoz, F.; Corrales, P.; Martínez, M.A. (2021). Procesamiento citológico y tisular. Editorial Síntesis (1ª edición).

Esaú López Jácome, L.; Hernández Durán, M.; Colín Castro, C.A.; Ortega Peña, S.; Cerón González, G.; Franco Cendejas,
R. (2014). Artículo: Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Laboratorio de Infectología, Centro
Nacional de Investigación y Atención a Quemados (CENIAQ), Instituto Nacional de Rehabilitación. Ciudad de México.
https://mmegias.webs.uvigo.es/