Procesamiento citológico y tisular

APLICACIÓN DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CELULARES

2º ANATOMÍA PATOLÓGICA y CITODIAGNÓSTICO

Profesora: Julia Navarrete Daniel
Alumnas: Cristina Chica Esteban
Desirée Lopera Vilchez
Melissa Mejía Gutiérrez
Covadonga Ponce Alonso
Curso 2022/2023 Amanda Sedeño Pareja
ÍNDICE
TEMA 6: APLICACIÓN DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS
1. Procesamiento histológico 3
2. Reestablecimiento de inmunorreactividad tisular 3
TEMA 7: PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CELULARES
1. Fundamentos de los reactivos de la tinción 4
2. Tinción de Panóptico Rápido o Diff-Quick 4
3. Tinción de May-Grünwald-Giemsa o Panóptico de Pappenheim 5
4. Tinción de Papanicolaou (PAP) 6

2
TEMA 6: APLICACIÓN DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUÍMICAS

1. Procesamiento histológico

La muestra será analizada mediante las técnicas inmunohistoquímicas, teniendo en cuenta que los
cortes de estas deben de ser de unas 3-5 micras aproximadamente, para conseguir una visualización
de marcajes óptima.

El fijador que más se usa sería el formol al 10%, manteniendo la estructura tisular con la creación de
puentes de metilo entre los propios residuos de aminoácidos de la muestra. Al estabilizar dicha
muestra, el formo suele estar modificando los epítopos respecto al estado natural, por ello a la hora
de realizar la detección de antígenos, se realiza el desenmascaramiento antigénico.

Igualmente, existe un protocolo enzimático para romper los enlaces de metilo mediante la ayuda de
proteasas o tripsinas, aunque el método más utilizado consiste en la aplicación de calor para provocar
que los puentes de metilo se rompan, tras la fijación con formalina, que son más débiles que los
enlaces propios de la molécula que se ha fijado en cuestión. La preparación para analizar se deposita
en soluciones tamponadas, el nitrato sódico es el que consigue mejores resultados de recuperación
antigénica.

2. Reestablecimiento de inmunorreactividad tisular

Antes de añadir el anticuerpo sobre dicha muestra, se recomienda bloquear la actividad enzimática
endógena, en el caso que se vaya a utilizar un marcador enzimático, las enzimas presentes de manera
natural en el tejido pueden alterar de forma anormal la reacción inmuno-enzimática. El bloqueo de la
actividad se realiza con agua oxigenada diluida.

Para que se evite un exceso de tinción en el fondo, el cual es provocado por el depósito inespecífico
de anticuerpos sobre la muestra, se realizarán disoluciones adecuadas de anticuerpo, teniendo en
cuenta que la concentración sea la mínima posible que produzca detección antigénica máxima sin
teñir el fondo.

En el protocolo inmunológico, hay que tener muy presente que tras la adición de cada anticuerpo es
muy recomendable lavar la muestra que se está procesando para eliminar el exceso de anticuerpo
que estén presentes en ella y que no se hayan unido al antígeno correspondiente.

También habrá que prestar atención a la evaporación de las soluciones con anticuerpos durante los
tiempos de incubación, dado que esto provocaría un aumento en la concentración de anticuerpo
aplicado, pudiendo dar resultados erróneos.

Durante la fase de incubación, además de la concentración, será fundamental la optimización de

diversos parámetros tales como el pH, la temperatura y el tiempo de incubación. Si bien es cierto que
la mayoría de los anticuerpos son capaces de detectar al antígeno de manera adecuada en condiciones
fisiológicas (pH neutro y alrededor de 37ºC), es posible que algunos de ellos requieran unas
condiciones especiales marcadas por el fabricante y algunos protocolos, recomiendan realizar dicha
incubación entre los 10 y los 4ºC. El tiempo de incubación, es posiblemente, el parámetro más
variable de todos, ya que éste dependerá de la afinidad del anticuerpo por el antígeno y por el resto
de condiciones adicionales, pudiendo variar entre minutos y varias horas.

3
Hay que tener presente, durante todo el procesado de la muestra, que incluso teniendo en cuenta
todas las recomendaciones mencionadas anteriormente, (más otras que vengan indicadas en los
protocolos de los fabricantes) para preservar la estructura antigénica, que es posible que se produzcan
alteraciones que dificulten la unión del anticuerpo, enmascarando la presencia del antígeno
correspondiente. Por ello, al igual que en otras técnicas de detección anteriormente explicadas,
siempre que se realice un análisis inmunohistoquímico, es obligatorio el uso de controles, tanto
positivos como negativos, para cada anticuerpo utilizado durante el proceso, con la finalidad de
comprobar la eficacia de la detección antigénica de nuestro protocolo.

TEMA 7: PROCESAMIENTO DE MUESTRAS CELULARES

1. Fundamentos de los reactivos de la tinción

En citología se utilizan diferentes tipos de tinciones. Básicamente se utiliza la tinción doble, también
llamada tipo Romanowsky (Giemsa, Panóptico Rápido) y la tinción triple tipo Papanicolaou. La
mayoría de los facultativos utilizan Panóptico Rápido (tinción de tipo Romanowsky) por su simplicidad
y rapidez, que se describirán posteriormente. No hay una única tinción perfecta e ideal para todos los
casos. Por ejemplo, Panóptico rápido no puede teñir los gránulos de tumores de mastocitos. Además,
suele haber pocos detalles citológicos en los núcleos y nucléolos de los grupos celulares y las células
de los ganglios linfáticos. Sin embargo, su facilidad de uso lo convierte en una de las tinciones más
aceptables. En general, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante para el tiempo de tinción,
pero el grosor de la preparación, el tipo de tejido extraído y el grado de tinción pueden variar. Se debe
tener en cuenta que puede variar dependiendo del tiempo transcurrido.

El objetivo de la fase de tinción citológica es la caracterización morfológica de las estructuras celulares

y nucleares, ya que los diagnósticos anatomopatológicos se basan principalmente en las morfologías
antes mencionadas y la relación de tamaño del núcleo y el citoplasma.

Según un mecanismo de acción idéntico al descrito en las muestras histológicas, existen:

- Colorantes básicos que tienen afinidad por las cargas negativas del ADN nuclear y así dejar en
evidencia el núcleo. Como, por ejemplo, la hematoxilina, el azul de metileno, la fucsina básica,
el verde de metilo o el azul de toluidina.
- Colorantes ácidos que prefieren las cargas positivas de las regiones citoplasmáticas. Como,
por ejemplo, la eosina, el naranja G, la fucsina ácida o el verde luz.
- Colorantes que tienen una afinidad especial como:
o Colorantes neutros: Formado por la conjugación de un colorante básico con un
colorante ácido, por lo que tendrá afinidad por estructuras ácidas y básicas. Tienen la
característica que son insolubles en agua y son solubles en etano. De este grupo
encontramos el eosinato de azul de metileno.

2. Tinción de Panóptico Rápido o Diff-Quick

El panóptico rápido o también conocido como Diff-Quick es un protocolo de tinción, el cual es capaz
de teñir estructuras celulares en menos de 30 segundos como mínimo y 3 minutos como máximo. Si
queremos unos resultados óptimos es recomendable el máximo marcado, 3 minutos.

En este periodo corto de tinción, se pueden obtener detalles citoplasmáticos, un resalte de los núcleos
e incluso puede mostrarnos presencia de microorganismos, tales como bacilos.

4
Este tipo de tinción llegan a los laboratorios en formatos preparados comercialmente, que se
componen de 3 disoluciones

I.- Un fijador inicial, compuesto de metanol.

II.- Un colorante basófilo, eosina, que teñirá el citoplasma.

III.- Un último colorante, acidófilo; azul de metileno, que colorea los núcleos.

Las muestras ya sobre un portaobjetos, se deberá dejar sumergida un minuto por cada disolución. Una
vez sacamos la muestra del último reactivo, se deberá lavar/aclarar la muestra en agua, puede ser
agua corriente o agua destilada, el aclaramiento deberá durar, lo que tarde la muestra en dejar de
soltar colorante, se deberá observar agua limpia.

Estando la muestra ya aclarada, se deberá dejar secar, y se realizará el montaje para su posterior
observación al microscopio.

Se observarán muestras monocromáticas, de tonalidades azules/moradas.

Imagen 1. Citología vaginal, teñida con Panóptico Rápido

3. Tinción de May-Grünwald-Giemsa o Panóptico de Pappenheim

Técnica de tinción histoquímica, la cual prioriza las estructuras citoplasmáticas, esta realiza una mejor
coloración sobre estructuras de tipo glucídico, como la membrana.

El panóptico de pappenheim tiene una duración de aproximadamente de una hora, ya que esta tinción
se realiza sobre extensiones liquidas que se deberán dejar secar al aire libre y posteriormente
realizaremos la técnica como tal.

La tinción consta de 2 reactivos, May grünwald, que se compone de eosina y azul de metileno en
alcohol metílico(fijador) y Giemsa que es una combinación de eosina y derivados de azul de metileno.
La combinación de estos dos reactivos, proporciona la correcta tinción de todas las estructuras
celulares. Los núcleos toman una coloración roja-violeta, los citoplasmas basófilos se tiñen de color
azul y los citoplasmas acidófilos se tiñen de tonalidades rosáceas.

Esta técnica es aplicada en forma de gotas y aclaramiento en agua corriente.

5
 Imagen 2. Forma de proceder con la tinción May- Imagen 3. Muestra de LCR teñido con May-
Grünwald Giemsa Grünwald Giemsa

4. Tinción de Papanicolaou (PAP)

Esta técnica de tinción fue desarrollada por el Doctor George Papanicolaou, trabajó en el estudio del
cambio de las células para diagnosticar y prevenir enfermedades en el cuello uterino.

La tinción consta de 4 pasos generales:

1. Hidratación de la muestra: sucesivos baños en alcoholes de graduación decreciente y lavar

con agua destilada. Este paso es importante ya que el citospray en el que vendrá fijada la
muestra tiene base alcohólica y las células deben estar hidratadas, ya que la hematoxilina es
soluble en agua y no en alcohol.

2. Tinción de núcleos: baños en hematoxilina de Harris, dos baños en agua destilada, un baño
en HCL al 25% y, finalmente un baño en agua corriente (del grifo).
‐ La hematoxilina de Harris es un colorante básico ya que se une a elementos
celulares ácidos como los ácidos nucleicos.
‐ El agua destilada elimina el exceso de colorante.
‐ El ácido clorhídrico se utiliza para la diferenciación de la tinción, elimina la sobre
coloración que genera la hematoxilina de Harris, ya que al ser una hematoxilina no
acidófila se lleva a cabo una tinción regresiva.
‐ El agua corriente (de grifo) se usa para eliminar el exceso de HCL.

3. Tinción de citoplasmas: se realizan baños sucesivos en alcoholes de gradación creciente,

baño en solución Orange-G, alcohol de 96% y, finalmente, solución EA-50.
‐ Los alcoholes de gradación creciente deshidratan la muestra ya que los colorantes
que los colorantes que se usan son más solubles en alcohol que en agua.
‐ La solución Orange-G (OG6) se trata de un colorante monocromático que colorea la
queratina presente en las células de un naranja brillante.
‐ El alcohol 96% se usa para eliminar el exceso de colorante OG6.
‐ La solución EA-50 es un colorante policrómico compuesto de Rosina, verde luz y
pardo Bismark. La Rosina tiñe de rosa el citoplasma de las células escamosas
maduras (células superficiales). El verde luz tiñe de verde-luz las células que son
metabólicas activas como las células parabasales, intermedias y columnares. El
pardo Bismark tiñe la mucina de amarillo de las células naviculares y las cancerosas
de los adenocarcinomas.

6
 4. Deshidratación y aclaramiento: baños en alcohol de 96%, alcohol absoluto, baño en alcohol
absoluto 50% -xileno al 50% y para terminar baños en xileno.
‐ Los alcoholes de 96% y absoluto limpian el colorante OG6 y terminan la
deshidratación del amuestra ya que el medio de montaje (DPX) no es soluble en
agua.
‐ El xileno produce la transparencia del citoplasma, es importante dejar las muestras
en el último baño de xilol hasta que se proceda a su montaje.

A continuación, se presenta como es un protocolo de PAP.

HIDRATACIÓN

- Alcohol 90%. 10 inmersiones

- Alcohol 80%. 10 inmersiones
- Alcohol 70%. 10 inmersiones
- Alcohol 50%. 10 inmersiones
- Agua deshidratada. 10 inmersiones

TINCIÓN DE NÚCLEOS

- Hematoxilina de Harris. 1 – 3 minutos

- Agua destilada. 5 inmersiones
- Ácido clorhídrico. 2 inmersiones
- Agua corriente. 6 minutos

TINCIÓN DE CITOPLASMAS

- Alcohol 50%. 10 inmersiones

- Alcohol 70%. 10 inmersiones
- Alcohol 80%. 10 inmersiones
- Alcohol 96%. 10 inmersiones
- Orange- G (OG6). 1- 1'5 minutos dependiendo de la antigüedad del colorante (tinción de
queratina)
- Alcohol 96%. Dos baños lentos.
- Solución EA-50. 1 – 4 minutos dependiendo la antigüedad del colorante (tiñe los
citoplasmas)

DESHIDRATACIÓN Y ACLARAMIENTO

- Alcohol 96%. Tres inmersiones lentas

- Alcohol absoluto. 20 inmersiones
- Alcohol absoluto 50% + xileno 50%. 10 inmersiones
- Xileno 10 inmersiones y dejar en el último baño.

MONTAJE con DPX.

7
Imagen 5 y 6. Muestras con tinción de Papanicolaou (PAP)