PRÁCTICA 8

OBTENCIÓN DEL ADN

L I C . Q U Í M I C A B I O L O G Í A C E L U L A R | A L A N G U S TAV O L U N A M A R T Í N E Z
Y ÁNGEL DEMIAN GRANADOS HERNÁNDEZ

BIOLOGÍA CELULAR
El primero en extraer el ADN

Durante el año de 1869 el biólogo

suizo Johann Friedrich Miescher,
utilizó alcohol caliente y luego una
pepsina enzimática, la cual separa la
INTRODUCCIÓN
membrana celular y el citoplasma de
la célula, lo que se quería lograr era
aislar el núcleo de la célula.Este
proceso se levo a cabo con los núcleos ¿QUÉ ES EL ADN?
de las células obtenidas del pus de El ADN es el ácido desoxirribonucleico es un ácido nucleico conformado por 4
vendajes quirúrgicos desechados y nucleótidos, contiene las instruciones genéticas usadas para el desarrollo y
del esperma de salmón, funcionamiento de todos los organismos vivos, este es el responsable de la
sometiéndolos a estos materiales y a transmisión hereditaria. La estructura doble hélice del ADN fue descubierta por
una fuerza centrifuga para aislar a los
dos científicos Watson y Crick quienes más tarde ganaron el premio nobel de
núcleos y luego realizó un análisis
medicina. Gracias a esto se conoce que la secuencia y no el número de
químico a los núcleos.
nucleótidos son los responsables de la instrucción genética en cada organismo.
El nombre de (ácido nucleico) proviene del hecho de cómo fueron descritos por
primera vez, ya que en realidad tienen propiedades ácidas, muy similar a los
ácidos que usted conoce. Y el término nucleico viene del hecho de dónde se
aislaron por primera vez, que se encontraron en el núcleo. (Ilustración 1)

Ilustración 1 Friedrich Miescher. ¿CUÁL ES LA ESTRUCTURA DEL

ADN?
¿El ADN es perfecto en su secuencia?
El ADN se compone de cuatro moléculas pequeñas llamadas nucleótidos que,
a su vez se conforman de tres partes, una base fosfato unida por un enlace al
El ADN de nuestras células puede carbono numero 5 de la desoxirribosa (ribosa en ARN) y la desoxirribosa unida
codificar nucleótidos en una
a una purina o pirimidina (base nitrogenada). Las cadenas de ADN están
secuencia errónea, que da como
resultado genes defectuosos que se
enrolladas una alrededor de la otra formando una doble hélice, cada hélice se
laman mutaciones. une a la otra orientada en sentido opuesto (antipolarmente) con puentes de
hidrógeno que unen una purina con su pirimidina correspondiente.

Cada organismo tiene número y

secuencia distinta de nucleótidos.

Científicos franceses han secuenciado

el genoma del plátano. En total han
identificado 36.500 genes, es decir,
14.000 más que los seres humanos.

Plásmidos…

Los plásmidos fueron usados para

crear la vacuna Pfizer, estos
plásmidos tenían la instrucción
genética para que una célula humana
construyera proteínas del Su estructura se podría comparar a las unidades de aminoácidos que
coronavirus y desencadene una
constituyen la cadena peptídica.
respuesta inmune al virus, los
plásmidos fueron usados para
modificar bacterias E.Coli para que
tomen los plásmidos dentro de sus ¿CUÁL ES SU
células y se pudieran replicar y así
crear millones de dosis de vacuna.
FUNCIONAMIENTO?
El ADN codifica la información que la célula necesita para sintetizar la proteína.
El ARN también tiene una amplia participación en esta sintesis
Plásmido Gen de la
proteína de BIOLOGÍA CELULAR
espiga del

Ilustración 3 Modificación de E.coli.
¿Plátano oxidado?
Cuando se muele el plátano se
acelera la etapa de oxidación, esto
por la enzima polifenol oxidasa que
contiene el plátano, que junto al
oxígeno producen una reacción
química o degradación oxidativa de
los compuestos fenólicos
(metabolitos secundarios en reino
plantae) dando como producto
quinonas e hidroxiquinonas que
después se polimerizan para dar
pigmentos pardos como la melanina.
Esto ocurre como sistema de
protección a un estrés oxidativo que
forma radicales libres y especies
reactivas de oxígeno como (O2, OH,
H2O2). Si en la célula persiste este
ciclo redox los sistemas de protección
son insuficientes y se produce un
aumento de especies oxidantes, que
promueven el daño a componentes
como membranas, proteínas y ácidos
nucleicos. El radical hidroxilo puede
dañar el genoma celular provocando
la alteración de señales de
transcripción y mutación de genes.
También el grupo OH puede causar la
apoptosis celular. En la degradación
de ADN por OH puede llegar a la
formación de 150,000 subproductos
por célula. Entre otros daños
oxidativos del ADN también se
produce la ruptura del esqueleto
azúcar fosfato de una o de las 2
hebras, modificación de las bases
nitrogenadas (saturación
fragmentación del anillo de timina).
Las ERO (especies reactivas de
oxígeno) pueden estimular el
desarrollo tumoral en el cáncer desde
la carcinogénesis, además tienen
participación en múltiples patologías.
En el cáncer se propone un
tratamiento antioxidante.
La mayor parte del ADN se encuentra
dentro del núcleo de la célula pero también
existe una pequeña parte de ADN dentro
de las mitocondrias se llama ADNmt. Las
células procariotas tienen organizado su
ADN de una forma distinta pues no tienen
nucleo pero su ADN está dispuesto en el
citoplasma, esta zona se reconoce como
nucleoide por no estar rodeada con una
membrana nuclear, también existen dentro
de si una molécula circular de ADN, que se
replican de forma autónoma y se transiten
Ilustración 2 Localización del ADN en la idependientemente del ADN cromosómico.
célula eucariota.
¿CÓMO EXTRAER ADN?
Para extraer el ADN se requiere primero hacer una lisis celular, este es un
proceso donde se rompe la membrana celular y la envoltura nuclear de las
células para liberar las biomoléculas que están dentro de ellas, se
desnaturalizan las proteínas que envuelven al ADN llamadas histonas. La
trituración ayuda a que la membrana sea más fácil de disolver y una mejor
absorción de calor y de soluciones que después se añaden para romper estas
membranas. Generalmente se usan detergentes, pero ¿Por qué? … Las células
tienen en su membrana muchas biomoléculas, mayormente Fosfolípidos y
proteínas, el detergente ayuda a romper esta bicapa de fosfolípidos por su
naturaleza anfipática, la disocia o solubiliza, Lo que ocurre es que cada
molécula de detergente tiene una parte hidrofóbica, que se une a los ácidos
grasos que también son hidrofóbicos, y una hidrofílica, que se une al agua. Se
forman unas nanopartículas esféricas, las micelas, que contienen detergente y
grasa. Las micelas se organizan de modo que los grupos polares de los
detergentes queden en el exterior, pero en su interior es hidrofílico. Así se
solubiliza la membrana plasmática y nuclear. Y ¿qué pasa entonces con las
proteínas? Bueno se pueden desnaturalizar y una forma de hacerlo es con
calor, con esto las proteínas de las membranas y las que recubren al ADN ya
dejan libre al ADN para su posterior filtración del tejido. La desnaturalización
debe hacerse cuidadosamente pues si se prolonga el calentamiento de podría
desnaturalizar el ADN y destruirlo. El ADN no es visible porque es soluble en
agua, pero se puede precipitar con la adición de etanol muy frio o de alguna sal
concentrada. El alcohol disminuye la constante dieléctrica del solvente acuoso,
provocando una disminución en la solubilidad del ADN, se vuelve apolar y
termina formándose un precipitado justo entre la capa con etanol líquido y la
capa con el extracto, las demás sustancias permanecen disueltas. Se puede aún
y teñir el ADN con azul de metileno, también es una técnica usada en
electroforesis. El azul de metileno en su forma reducida es incoloro, en su
forma oxidada su coloración es azul, esto comprueba la desnaturalización de
las proteínas entre ellas enzimas que de no ser así reducirían al azul de
metileno dejándolo incloro, y cuando no hay enzimas y al contrario se expone
a unn ambiente oxidativo, el azul de metileno da una coloración azul intenso.
Ilustración 4 Cromosoma humano visto en microscopio electrónico de barrido.
BIOLOGÍA CELULAR
OBJETIVO
Obtener DNA de plátano

MATERIALES Y
MÉTODOS
PROCEDIMIENTO

1. Muele el plátano en el mortero o licuadora con 30mL de agua

destilada hasta que quede una pasta homogénea.
2. En un vaso de precipitado, agrega 60mL de agua destilada, 10mL del
detergente, agítalo cuidadosamente con una varilla por dos minutos
sin hacer espuma.
3. Al vaso de precipitado anterior, agrégale 30mL de la pasta del tejido,
y luego revuelve con mucho cuidado por 3 minutos. Coloca el vaso 10
minutos en un baño a 60°C.
4. Colocar la gasa en un embudo, y filtra la mezcla (puede tardar varios
minutos.
5. Marcar dos tubos con los números 1 y 2.
6. Al tubo número 1, agregarle 1-2mL de Etanol 96° frío. Al tubo número
2, agregarle 1-2mL del homogenado de plátano con detergente.
7. Al tubo 1, agregarle el homogenado de plátano, en un volumen
igual al de etanol.
8. Al tubo 2, agregarle etanol de 96° frío, en un volumen igual al
del homogenado de plátano.
9. Colocar 1-3 gotas de azul de metileno a uno de los tubos y
agitar girando el tubo entre las palmas de las manos.
10. Observar la tinción.
(No se añadió foto de protocolo sólo para un buen aspecto del
reporte)
M AT E R I A L E S REACTIVOS
• Mortero o Licuadora • Plátano Verde *
• Probeta 100mL • Detergente
• Vasos de precipitado de 250mL • NaCl
• Tubo de ensayo 13x100mm • Etanol 96°
• Gradilla para tubo de ensayo • Azul de Metileno 0.5%
• Embudo • Agua Destilada
• Gasa
• Varilla de Agitación
• Lámpara UV
• Tubos para sulfhidrar
• Parrilla de Calentamiento

BIOLOGÍA CELULAR

Ilustración 5 Tubo uno, izquierda. Tubo actuó como precipitante para el ADN, y se ve en la parte posterior porque fue
dos, derecha.
Ilustración 6 Tubo uno, izquierda. Tubo
dos, derecha.
Ilustración 7 Tubo uno, izquierda. Tubo
dos, derecha. Se puede observar el color
pardo o marrón característico de la
melanina, producida por las quinonas que
se polimerizan, producto de la oxidación
en un intento de salvar las células.
RESULTADOS
A D N D E P L ÁTA N O
Después de realizar el procedimiento se obtuvieron varias hebras de ADN
visibles, que en la introducción respaldamos el porqué son visibles, entender
cómo se hizo que el material genético fuera insoluble y posteriormente teñido.
En el tubo uno de la Ilustración 5 podemos observar una densa cantidad de
ADN en la parte superior, esto porque se añadió al final el homogenado, que
la zona inicial de contacto mientras se iba agregando todo el etanol. En el
segundo tubo se adicionó primero el homogenado y después el etanol, al
instante se precipitó por eso se ve mayor concentración en la parte media, se
logró la obtención del ADN sin desnaturalizarlo ni dañar su estructura pues fue
debido a una buena preparación de la muestra, sin dejar que el plátano se oxide
y rápidamente desnaturalizar todas las proteínas y enzimas que participan en
esta oxidación, en la extracción del ADN de la cáscara del plátano sí ocurrió
esto. El resto del material biológico se quedó disuelto.
Después para visualizar mejor la densidad de hebras de ADN añadimos azul de
metileno qué coloró el ADN pues s un colorante derivado de la fenotiazina que
produce un color azul cuando se disuelve en agua. Se utiliza como tinción de
ácidos nucleicos por su capacidad para unir ADN y ARN. Esta tinción reversible
minimiza la interferencia cuando los ácidos nucleicos se transfieren a
membranas de hibridación para la transferencia. Por lo que, también se puede
teñir el núcleo de las células. Observamos en el tubo 1 la nubosidad densa en
la parte posterior del tubo, en el tubo dos se ve la densidad de ADN
específicamente en la parte intermedia.
A D N D E C Á S C A R A D E P L ATA N O
En esta parte se utilizó la misma metodología que para el experimento del
plátano en sí, donde al primer tubo se le agrego el etanol frio y posterior la
muestra de la cascara, y al tubo 2 donde primero se le agrego la muestra de la
cascara y finalmente el etanol. Aquí a diferencia del experimento 1, en este
experimento, ambos tubos mostraron una menor densidad de hebras de ADN,
esto debido a la elaboración de la muestra, pues hubo dos factores que
causaron esto; la mala preparación de la muestra dado que se adiciono
bastante agua al momento de licuar la cascara y que la cascara estaba oxidada.
Inicialmente el que la cascara estuviera oxidada interfirió con los resultados
para observar el ADN, en la introducción se mencionan los daños de la
oxidación al ADN, además cuando la cascara esta oxidada, libera un gas que se
conoce como eteno (antes, etileno). Este gas hace que madure la fruta o que
se ablande porque rompe las paredes de las células, convierte los almidones
en azúcares y hace desaparecer los ácidos. Así, daña las hebras de ADN.
Sumado a que, al momento de realizar la muestra, el hecho de adicionar
bastante agua hizo que la misma quedara bastante acuosa.
En el tubo 1 podemos observar mayor densidad de hebras de ADN esparcidas
de la parte media a la parte superior del tubo, esto debido a que al tubo 1 se le
adiciono primero el etanol, la adición de etanol frío precipita el ADN dado que
es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El ADN precipitado forma
BIOLOGÍA CELULAR

Ilustración 8 Tubo uno, izquierda. Tubo
dos, derecha.
Existen más colorantes
Igualmente se pudieron usar otros superior solo vemos teñido el solvente. En la parte inferior vemos el material
colorantes básicos como
difenilamida y el Bromuro de Etidio,
este último es un agente intercalante
usado comúnmente como aclarador
de ácidos nucleicos en laboratorios de
biología molecular para procesos
como la electroforesis en gel de
agarosa.
¿Cuándo se descifró el genoma
humano?
En 2003 se publicaron los resultados
finales del Proyecto Genoma
Humano, un proyecto científico
internacional que pretendía descifrar
toda la información de un genoma
humano. En ese momento, se
hablaba de que se había secuenciado
el genoma de la especie humana,
pero no fue así del todo. Para ese
entonces, se había secuenciado
prácticamente todo el genoma
humano (92%), pero se obviaron
ciertas regiones difíciles,
generalmente regiones altamente
repetitivas. Los seres humanos
compartimos el 99,9% de nuestro
ADN con cualquier otro ser humano.
Cromosomas...
Cada célula humana contiene 23
pares de cromosomas: 22
compartidos entre hombres y
mujeres y el par de cromosomas
sexuales, que es diferente entre
hombres y mujeres. Los hombres
tienen un cromosoma X y un
cromosoma Y, mientras que las
mujeres tienen dos cromosomas X.
unas finas hebras blancas visibles en el límite de separación de la fase de
alcohol, por ello vemos la fase intermedia y superior pues como la muestra se
agregó al final, el etanol precipitó el soluto que estaba en la parte superior.
Contrario pasa con el tubo 2, donde primer se agregó la muestra de la cascara
y luego el etanol, la fase igual se forma en medio del tubo, pero no en la parte
superior ya que el soluto estaba en la parte inferior. En ambos tubos, el AND
no bajo de la fase del etanol, es decir de la parte media dado que se precipito,
pero el material celular sobrante si es soluble en el etanol y este es visible en
la parte inferior del tubo.
Al momento de adicionar azul metilo debemos tomar en cuenta que los tubos
fueron agitación con rotación entre nuestras palmas, por ello en el tubo 1, la
agitación fue un poco más fuerte por ello vemos las hebras esparcidas a lo largo
de todo el tubo destacando por aparentar una nubosidad. En el tubo 2, donde
la agitación fue un poco menos fuerte, se conservó la fase media del etanol, en
este tubo podemos ver una coloración azul oscuro en la parte media y en la
el celular si teñir.
CONCLUSIÓN
Reconocemos que el proceso de la obtención del ADN por primera vez digno
de premio nobel no fue nada fácil, ni mucho menos lograr determinar la
estructura doble hélice, entender el funcionamiento del ADN es lo más
importante en Biología celular, pues de ahí se parten a otros procesos
biológicos celulares dentro de un organismo eucarionte y procarionte. El
descubrimiento del ADN trajo con si una gran diversidad de aplicaciones como
se mencionaron en la introducción y muchas otras más, una de las cosas más
estudiadas hoy en día es la genética, por su grande diversidad en el código
secuencial que caracteriza a todos los organismos vivos, en sus propiedades
físicas y en una forma biológica interna, donde conocemos que cada organismo
tiene una secuencia diferente y por lo tanto su vida o su adaptación al ambiente
también difiere en cada especie. Aprendimos que el proceso de oxidación se
encuentra presente en varios organismos diferentes como es en el reino
plantae, en el reino animalia, muy posiblemente en otros o todos los reinos y
lo que provoca en la célula. También abarcamos el fundamento para la
extracción del ADN, el motivo de cada proceso físico y químico como el
rompimiento de la membrana celular (lisis) y también la desnaturalización de
proteínas con calor, el efecto disolvente de las micelas en un ambiente
afipático, el ¿Por qué el Etanol es importante en este proceso? Y la generación
de insolubilidad de este material genético también vimos la explicación
química del uso de los colorantes y como estos nos ayudaron en la
identificación del material genético. Con el fin de relacionar completamente la
teoría con la práctica con una basta profundidad en el tema.
BIOLOGÍA CELULAR
Premio nobel por retrasar oxidación de
frutas.
Desde hace muchos años, la búsqueda de
métodos que inhiban o retrasen la
aparición de las clásicas manchas oscuras
en frutas y verduras que tanto repelen al
consumidor, ha sido uno de los objetivos
prioritarios de la industria alimentaria.
Tradicionalmente se han empleado
métodos como la adición de sulfitos, de
boratos, de sal, el empleo de un
tratamiento térmico adecuado, la
eliminación del oxígeno, la disminución
del pH del medio u otros similares. Sin
embargo, la mayoría de ellos llevan
asociados problemas nutricionales,
sanitarios, etc. por lo que se están
buscando nuevas alternativas. Uno de los
nuevos métodos para inhibir esta
oxidación temprana es la modificación
genética, esto por el descubrimiento del
ARNi, responsable de que la traducción y
sintetización proteíca que ocurre en los
ribosomas sea regulada. Con esto se
desea tener aplicaciones en medicina
pues muchas proteínas implicadas en la
aparición y desarrollo de enfermedades
pueden ser bloqueadas y muchas otras
reguladas. Y bueno se usó primeramente
para inhibir la pronta oxidación de varias
frutas, comenzaron con las manzanas,
dos variedades transgénicas donde se
reduce la actividad de la polifenoloxidasa
aguantando así hasta 17 días para no
pardearse.
CUESTIONARIO
¿Cuáles son los ácidos nucleicos
enco ntrado s en las células ?
Existen dos tipos de ácidos nucleicos química y estructuralmente distintos:
el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN); ambos se
encuentran en todas las células procariotas, eucariotas y virus. El ADN
funciona como el almacén de la información genética y se localiza en los
cromosomas del núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos de las células
eucariotas. En las células procariotas el ADN se encuentra en su único
cromosoma y, de manera extracromosómica, en forma de plásmidos. El
ARN interviene en la transferencia de la información contenida en el ADN
hacia los compartimientos celulares. Se encuentra en el núcleo, el
citoplasma, la matriz mitocondrial y el estroma de cloroplastos de células
eucariotas y en el citosol de células procariotas.
La unidad básica de los ácidos nucleicos es el nucleótido, una molécula
orgánica compuesta por tres componentes: Base nitrogenada, una purina o
pirimidina. Pentosa, una ribosa o desoxirribosa según el ácido nucleico.
Grupo fosfato, causante de las cargas negativas de los ácidos nucleicos y
que le brinda características ácidas.
¿Q ué diferencias estructurales y f uncio nales
presentan entre ellos?
ADN y ARN son moléculas parecidas, pero como ocurre en papel, la
fotocopia no es exacta y, por tanto, existen algunas diferencias entre
ambas:
- El ADN está formado por dos cadenas largas que se enrollan entre sí en
una espiral, en cambio el ARN está compuesto por una única cadena con
estructura lineal y de menor longitud.
- El alfabeto del ADN y ARN no son exactamente iguales, mientras el ADN
está formado por A (adenina), T (timina), G (guanina) y C (citosina), el del
ARN sustituye la T por U (uracil).
- A nivel químico las dos moléculas son muy similares, pero el ADN tiene un
grupo hidroxilo (-OH) menos que el ARN, haciendo la molécula de ADN
menos reactiva y mucho más estable.
Al tratarse de una fotocopia de una región del ADN, el ARN también lleva
información genética pero sus características y su tamaño mucho más
reducido le permite pasar a través de los poros de la membrana del núcleo
de la célula (donde se encuentra el ADN) y llegar hasta el compartimento
celular donde se ensamblan las proteínas. Así, podemos decir que mientras
el ADN “porta” la información genética, el ARN la “transporta”.
¿Qué importancia tiene el DNA en la
trasmisió n de la informació n genética?
BIOLOGÍA CELULAR

Ilustración 9 Duplicación del ADN
Ilustración 10 La huella de cada humano es
diferente y está parcialmente decidida por la
genética, es decir, “está determinada por el
contenido genético del individuo, como todos
los rasgos y caracteres que nos definen a cada
uno”.
El ADN tiene la función de “guardar información”. Es decir, contiene las
instrucciones que determinan la forma y características de un organismo y
sus funciones. Además, a través del ADN se transmiten esas características
a los descendientes durante la reproducción, tanto sexual como asexual.
La información está guardada en el ADN, en el código de secuencia de
bases A, T, C y G que se combinan para originar “palabras” denominadas
genes. Los genes son fragmentos de ADN cuya secuencia nucleotídica
codifica para una proteína. Es decir que a partir de la información “escrita”
en ese fragmento de ADN se fabrica (sintetiza) una proteína. Aunque, en
realidad, los genes también llevan la información necesaria para fabricar
moléculas de ARN (ribosomal y de transferencia). Todas las células de un
organismo tienen el mismo genoma, o conjunto de genes. Pero, en cada
célula se expresan los genes que se usan. Por ejemplo, aunque una célula
de la piel tiene toda la información genética al igual que la célula del
hígado, en la piel solo se expresarán aquellos genes que den
características de piel, mientras que los genes que dan características de
hígado estarán allí “apagados”.
¿Có mo s e transmite la info r mació n genética
a partir de los ácidos nucleicos?
El dogma central de la Biología describe cómo la información genética
contenida en el núcleo celular en forma de ADN es copiada a ARN
mensajero (ARNm), transportada al citoplasma y, posteriormente, usada
para producir proteínas. Este proceso consta de dos pasos: transcripción y
traducción.
En la transcripción, la secuencia de ADN de un gen se copia para obtener
una molécula de ARN. Este proceso es llamado transcripción porque implica
volver a escribir, o transcribir, la secuencia de ADN en un "alfabeto" de ARN
similar. En eucariontes, la molécula de ARN debe someterse a un
procesamiento para convertirse en un ARN mensajero (ARNm) maduro.
En la traducción, la secuencia de ARNm se decodifica para especificar la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido. El nombre traducción refleja
que la secuencia de nucleótidos del ARNm se debe traducir al "idioma",
completamente diferente, de los aminoácidos.
Los genes no codificantes (genes que producen ARN funcionales) también
se transcriben para producir ARN, pero este ARN no se traduce en un
polipéptido. Para cualquier tipo de gen, el proceso de pasar de ADN a
producto funcional se conoce como expresión génica.
¿Cómo podríamos determinar que las hebras
son puros ácidos nucleicos ?
Para comprobar que las hebras son ácidos nucleicos, por ejemplo, en un
experimento para determinar el ADN, usamos una solución de detergente,
el detergente tiene moléculas que destruyen las membranas celulares que
rodean a todas las células, ya que tienen un extremo hidrofóbico y otro
extremo hidrofílico. El detergente, entonces, se intercala en estas
membranas e inicia lo que se llama la lisis o ruptura celular, disolviendo las
grasas presentes en la célula, y también se le adiciona alcohol cuya función
deshidratar las moléculas de DNA (quitándoles el agua intramolecular), las
cuales, por la gran cantidad de ADN existente, forman estos hilos blancos,
que son muchísimas moléculas de ADN.
BIOLOGÍA CELULAR
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