Prctica 4 Espectrofotometra: cuantificacin de protenas totales por el mtodo de Biuret

Objetivo 1: que el estudiante aprenda los conceptos tericos relacionados a la espectrofotometra y cmo stos son aplicados en el laboratorio de Bioqumica para la cuantificacin de sustancias. Objetivo 2: realizar una determinacin correctamente el resultado obtenido espectrofotomtrica y reportar

Fundamentos de espectrofotometra
La luz puede ser clasificada de acuerdo a su longitud de onda. La luz con una longitud de onda corta, entre 200 nm y 400 nm se conoce como ultravioleta, mientras que aquella que posee una longitud de onda ms larga, entre 700 nm y 900 nm se conoce como luz infrarroja cercana. La luz con longitudes de onda de entre los 400 nm a los 700 nm contempla el rango de luz de diferentes colores visible al ojo humano. Qu ocurre cuando una radiacin electromagntica atraviesa la materia? Si la radiacin tiene energa adecuada con la estructura de la materia, sta ltima podr absorberla. La medicin de la cantidad de luz absorbida puede ser usada para detectar, identificar molculas y medir su concentracin en solucin. Esta medicin se basa en la Ley de Beer y Lambert o simplemente Ley de Beer. Esta ley establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energa radiante absorbida por la sustancia, o inversamente proporcional al logaritmo de la energa radiante transmitida por la sustancia. Considrese un rayo de energa radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a travs de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solucin homognea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda, como se ilustra en la Figura 1.

Io

Is

Figura 1. Transmisin de energa radiante a travs de una celda de vidrio, donde Io representa la intensidad de la luz incidente e Is representa la intensidad de luz transmitida. La intensidad de la energa radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial Io. debido precisamente a que la solucin fue capaz de absorber cierta cantidad de energa radiante. La transmitancia para un compuesto en solucin es definida como la proporcin de luz incidente que es transmitida:

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Transmitancia=T= Is / Io. Esta proporcin generalmente es expresada como un porcentaje de la siguiente forma: Porcentaje T= %T= Is / Io. X 100%

El concepto de transmitancia es importante porque solo la luz transmitida, no la absorbida, puede ser medida directamente en el laboratorio.
Conforme la concentracin del compuesto en solucin aumenta, ms luz ser absorbida por el mismo y por lo tanto menos luz ser transmitida. El porcentaje T vara de forma inversa y logartmica con respecto a la concentracin (Figura 2B). A esta relacin se le llama absorbancia o A. Es decir: A= -log Is / Io.= -log T= log 1/T Para convertir T en %T, tanto el denominador como el numerador deben ser multiplicados por 100%: A= log 1/T X 100%= log 100% / %T Esta expresin es equivalente a: A= log 100% - log %T A= 2- log %T (ecuacin 1)

Mediante esta transformacin matemtica se obtiene entonces una relacin entre la absorbancia y el porcentaje de transmitancia. En el laboratorio, una vez determinado el porcentaje de transmitancia, ste se transforma a absorbancia, la cual, segn la ley de Beer es directamente proporcional a la concentracin de una sustancia, como se observa en la Figura 2A. La mayora de los instrumentos utilizados hoy en da para estas determinaciones, llamados espectrofotmetros, realizan esta conversin automticamente, de forma tal que el valor reportado es la absorbancia, no la transmitancia. La funcin matemtica que relaciona a la absorbancia con la concentracin de una solucin est dada por la ley de Beer en la forma: A=abc Donde A es absorbancia, a es el coeficiente de absortividad molar (una propiedad fsica propia de cada sustancia), b es la distancia en cm recorrida por la luz dentro de la solucin (dimetro de la cubeta utilizada) y c es la concentracin de la

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sustancia. Los valores de absorbancia no tienen unidades ya que las unidades del coeficiente de absortividad molar son recprocas a las de b y c.

Absorbancia (A)

12 10 8 6 4 2

100

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

0

0 0 5 10 15

% T

10000 1E+08 1E+12 1E+16 Concentracin

Concentracin

(A)

(B)

Figura 2. Representacin grfica de la relacin que existe entre la absorbancia (A) y el porcentaje de transmitancia (B) con respecto a la concentracin de una sustancia. La determinacin se realiza utilizando muestras de concentracin conocida que se denominan patrones o estndares. La mayora de las sustancias a cuantificar en bioqumica no poseen color. Por lo tanto es necesario acoplar algn tipo de reaccin qumica que involucre la aparicin o desaparicin de un cromgeno con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromgenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor ser la absorbancia a medir y por tanto la tcnica tendr mayor sensibilidad. El siguiente paso es corroborar bajo qu condiciones se cumple la ley de Beer, es decir cul es la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qu concentraciones son las adecuadas. Para ello se determina la absorbancia de la sustancia en cuestin a diferentes concentraciones. Las soluciones de concentracin conocida que se preparan para este propsito se conocen como patrones o estndares. La relacin absorbancia versus concentracin debe generar un grfico que demuestre una lnea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero (Figura 2A). Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentracin de una solucin midiendo su absorbancia y extrapolando dicho valor en el grfico. Debido a que existe una relacin lineal entre ambas variables, es posible relacionar la concentracin desconocida a un solo estndar (generalmente el que tiene la absorbancia ms similar a la muestra) mediante una simple relacin de tres: Ae = Ce Am Cm

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Donde Ae es la absorbancia del estndar, Am es la absorbancia de la muestra, Ce es la concentracin del estndar y Cm es la concentracin de la muestra. Esta relacin se convierte en: Cm= Am X Ce Ae Esta ltima ecuacin es vlida solo si el cromgeno a detectar cumple con la ley de Beer y tanto estndares como muestra son medidos bajo las mismas condiciones. Otra forma ms exacta es determinar la ecuacin de la lnea recta generada y de sta extrapolar el valor de concentracin de la muestra incgnita. El rango de concentracin dentro del cual un cromgeno cumple con la ley de Beer debe determinarse experimentalmente. La ley de Beer es una relacin matemtica ideal que contiene ciertas limitaciones. Desviaciones de la misma, es decir circunstancias en las cuales la relacin entre la absorbancia y la concentracin de una muestra no es lineal pueden ocurrir cuando: 1. La concentracin de la solucin a medir es muy elevada 2. La luz incidente no es monocromtica 3. La cantidad de luz absorbida por el solvente es significativa con respecto a la sustancia en solucin que se desea medir 4. Hay luz transmitida que no es generada a partir de la sustancia a cuantificar 5. Los lados de la celda donde se deposita la muestra no son paralelos 6. Mezcla de varias especies qumicas que absorben luz de la misma longitud de onda: las especies competirn entre s por la luz, cada una con diferente absortividad. Cada uno de los puntos mencionados anteriormente puede evitarse haciendo un uso correcto del espectrofotmetro como se ensear en la prctica de laboratorio de hoy, adems de una buena aplicacin de la teora de la ley de Beer en la prctica. En el caso del punto uno, la mejor forma de evitar esta situacin es diluyendo la muestra a cuantificar. En el caso del punto dos, es necesario tener una buena fuente de energa radiante. La mayora de los instrumentos de buena calidad la poseen hoy en da. Para el punto tres, es necesario corroborar que la cantidad de luz absorbida por el solvente no es significativa. Para ello, se debe utilizar cada vez que se hace una determinacin espectrofotomtrica el blanco reactivo. El blanco reactivo es una muestra ms que contiene todos los componentes utilizados para la determinacin (por ejemplo agua, reactivo, etc) excepto el compuesto a medir (ver seccin de procedimiento). La cantidad de luz transmitida por este blanco no debe ser detectada por el aparato. Para ello, el espectrofotmetro se ajusta manualmente de forma tal que esta cantidad de luz no sea medida. Este procedimiento se conoce comnmente como calibracin del cero, es decir, la cantidad de absorbancia del blanco es reconocida o cuantificada como cero por el aparato. En el caso del punto cuatro, es necesario asegurarse de que no

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existan otras fuentes de luz cercanas cuando se hace la medicin. Para evitar la situacin expuesta en el punto cinco, se deben utilizar celdas certificadas, las cuales son hoy en da fciles de conseguir a un precio razonable. Por ltimo, para evitar el aspecto mencionado en el punto seis, es necesario asegurarse de que el compuesto a medir se encuentre en solucin de forma pura o en presencia de otros compuestos que no absorben a la misma longitud de onda. Es tambin imprescindible recordar que si se hacen mediciones en el rango de luz ultravioleta es necesario utilizar celdas de cuarzo, ya que el vidrio absorbe luz a esas longitudes de onda. En la prctica del da de hoy se determinar la concentracin de protenas en una muestra de suero. Dado que la mayora de las protenas no absorben luz dentro del rango de longitud de onda visible, es necesario acoplar una reaccin qumica que genera color y as poder cuantificarlas.

Fundamento de la prueba
Las protenas y pptidos reaccionan con iones de cobre en solucin alcalina, formando un quelato color violeta de configuracin desconocida. La intensidad de color es directamente proporcional a la concentracin de protenas presente en la muestra.

Reactivos
A. Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de Na2EDTA en 350 ml de agua destilada. Agregar lentamente y con agitacion constante 100 ml de solucin fresca de NaOH 5 mol/l. Aforar a 500 ml con agua destilada. B. Solucin patrn de protenas: preparacin comercial, generalmente de 6g/dl. C. Muestras: suero o plasma de diferentes especies animales.

Procedimiento
Precaucin: el da de hoy usted trabajar con muestras biolgicas. Una regla de oro preventiva es trabajar cualquier muestra biolgica como potencialmente infecciosa. El uso de guantes es recomendado. Si ocurre algn derrame, avise inmediatamente al instructor ms cercano.

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A. Se obtienen muestras de plasma o suero por centrifugacin de la sangre total de diferentes especies animales, utilizando citrato de sodio al 3.8% como anticoagulante o sin anticoagulante.

B. Rotular 3 tubos de ensayo como muestra, patrn y blanco reactivo. Aadir a cada tubo: Reactivo Biuret Agua destilada Estndar 6g/dl Muestra Tubo blanco 2 ml 20 l Tubo estndar 2 ml 20 l Tubo muestra 2 ml 20 l

C. Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente. D. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotmetro o en el fotmetro a 540nm.

Notas
A. El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora. B. La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl

Clculos
[Protenas totales] = Absorbancia de la muestra X [patrn] Absorbancia del patrn

Resultados
A. Calcule la concentracin de protenas totales de su muestra, describiendo detalladamente los pasos matemticos realizados.

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B. Cules son los valores de referencia para la especie animal a la que pertenece la muestra que usted cuantific? Se encuentra el valor obtenido para su muestra dentro de los valores de referencia?

C. Qu patologas pueden presentar niveles elevados o niveles bajos de protenas totales. Averige.

D. Por qu es importante agitar los tubos de ensayo despus de preparar las disoluciones, particularmente en esta determinacin? 49

E. Qu aparato se utiliza en esta prctica? Describa sus componentes internos.

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Bibliografa -Amato M, S y Granados P, F. Manual de Laboratorio. Ctedra de Bioqumica. Universidad Nacional, 1994 -Angulo Ugalde, Y. Bioqumica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa Rica. 1999 -Kaplan, L et al. Clinical Chemistry: theory, analysis and correlation. 2nd edition. CW. Mosby Company, 1989 -Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods. 3rd edition, Freeman and Company, New York 1999

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