FASES DEL PROCESO

FASE ANALITICA.
 Proceso analítico : Tiene una entrada ( la muestra validada para
ser procesada) y una salida ( la información resultante del
procesamiento )
 Sistema analítico : Todo lo que interviene en esta fase para
procesar la muestra.( materiales, licenciado , equipos, insumos,
método analítico ,etc. )
 Método analítico : Es el conjunto de procedimientos y técnicas para
realizar una actividad ordenada y en forma sistemática.
 Procedimiento :Conjunto de instrucciones escritas ( inserto )
El inserto son las instrucciones que me dará el fabricante ( o los
hacemos nosotros ) para usar los kit de los reactivos con la muestra.
 ESPECTROFOTOMETRIA:
1. Es uno de los métodos analítico más usados en el laboratorio
clínico
2. El equipo que usaremos será el Espectrofotómetro.
3. Se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por
parte de un compuesto y su concentración.
4. Se hace incidir luz monocromática ( de una sola longitud de onda )
sobre un medio homogéneo ,una parte de la luz incidente es
absorbida por el medio y otra es transmitida.
5. Nos permitirá conocer la concentración de un analito
 Fundamento :
 A un recipiente transparente que contiene una solución de una
sustancia determinada lo atravesamos por un haz de luz
monocromática
 Medimos las intensidades del haz incidente ( Po en el dibujo )y el
emergente ( Pt) ,se observa que la ultima es menor que la primera.
 Esto se debe a que parte de la
radiación que recibió la
sustancia en solución; es
absorbida por sus moléculas .
 Conceptos :
 Espectro de electromagnético ( luz) :
Conjunto de radiaciones que se mueven por todo el espacio. (como
partículas o como ondas )Aquellas detectables por el ojo corresponden
a la luz visible ( los 7 colores ), la mayoría son invisibles para nosotros.
Se definen por la longitud de onda y frecuencia.
 La longitud de onda distancia recorrida por la radiación
electromagnética en un ciclo completo de cresta a cresta de la onda
y se mide en nanómetros
 Conceptos :
 Nanómetros : medida de longitud que equivale a la
milmillonésima parte del metro.
 Frecuencia ( numero de oscilaciones completas que realiza la
onda por segundo ).
 Disolución : Es la mezcla de uno o mas soluto en un disolvente.

 Analito: Todo lo que puedo obtener de información de la muestra

ya sea la concentración de una sustancia como una propiedad de
ese liquido biológico .
Espectro electromagnético
Espectro electromagnético
visible
 Espectro de absorción
 Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, es
decir, a una determinada longitud de onda de la energía
radiante ,cada sustancia absorbe una cantidad de radiación
que es distinta a la que absorbe otro compuesto

 Por lo que para cada analito obtendremos su absorbancia a

determinada longitud de onda , esa longitud de onda será la
que el analito absorbe su máxima cantidad luz .
Espectrofotómetro
 Espectrofotómetro
➢ La palabra espectrofotómetro deriva de la palabra Spectrum : del
latín que significa imagen, Photo : del griego que significa luz
➢ El principio de su fundamento es usar la luz de una lámpara de
características especiales la cual es guiada a través de un
dispositivo que selecciona y separa luz de una determinada
longitud de onda y se hace pasar por la cubeta que contiene la
solución para luego pasar de señal luminosa a señal eléctrica .
Que en términos logarítmicos obtendremos la absorbancia de la
solución que estaba en la cubeta ( son de medidas y materiales
especiales para uso en dicho equipo )
➢ Mide la Transmitancia ( %T) y por un calculo matemática (
Transmitancia y sistema fotométrico ) ,le presenta al operador las
absorbancias .
 Espectrofotómetro
Espectrómetro Fotómetro
COMPONENTES DE UN
ESPECTROFOTÓMETRO
 Manejo del Espectrofotómetro
 Encender el espectrofotómetro antes de realizar la medición
teniendo en cuenta el tiempo de termostatizacion recomendado
por el fabricante
 Seleccionar la longitud de onda
 Seleccionar la temperatura de trabajo( si corresponde )
 Utilizar la cubeta correspondiente al instrumento que estamos
usando y que este en buen estado
 Llevar a cero de absorbancia con agua destilada
 Cargar la cubeta con la solución a medir.
 Leyes de la absorción
 Establece la relación entre el grado de absorbancia una solución y
otras dos variables , la concentración y la longitud del trayecto que el
haz de luz recorre en la solución ( Lambert-Beer)

Beer : La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye

exponencialmente al aumentar aritméticamente la concentración de la
sustancia absorbente, cuando este haz pasa a través de un medio
homogéneo.(la absorbancia de una solución es directamente
proporcional a la concentración).
 Leyes de la absorción
 Lambert: La intensidad de un haz de luz monocromática
disminuye exponencialmente al aumentar
aritméticamente el espesor del medio absorbente,
cuando este haz pasa a través de un medio homogéneo (
la absorbancia es directamente proporcional el espesor
del medio)
 Ley de Lambert-Beer

 Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de

Lambert-Beer
A=abc
A= absorbancia ( DO)
a = constante de absortividad ,es una constante relacionada con
la naturaleza química del soluto
b = longitud o espesor del medio ( Long de la cubeta )
c = concentración de la solución
 Los valores de absorbancia no tienen unidades
 La absorbancia es conocida como densidad óptica (DO)
 Transmitancia y Absorbancia
 Transmitancia: Es la relación entre la luz transmitida y la luz
incidente a ,a misma longitud de onda.
T= P/Po
En la practica se define
en porcentaje
%T=P/Po.100 es de escaso empleo pero es lo que se puede medir.
 Transmitancia y Absorbancia
 En la practica se usa la Absorbancia
Se define como la cantidad de energía radiante que absorbida por
una sustancia pura o en solución y los cálculos matemáticos son:
 ¿Como llegamos a conocer la
concentración de un analito?( por este
método analito )

1. Comparando la radiación absorbida o transmitida por una solución

que contiene una cantidad de soluto conocida ;con la radiación
absorbida o transmitida de la solución que contiene el soluto con
cantidad desconocida.( Leyes de absorción )Queda claro aca, que
necesito una sustancia de concentración conocida para comparar
con la de concentración desconocida.

2. Curvas de Calibración.( Leyes de absorción )

 1. Por comparación de una solución
conocida
 Solución de concentración conocida = Estándar ,patrón, calibrador
 Tenemos dos soluciones : la muestra ( conocer la concentración ) y la de
concentración conocida; aplicando la leyes de absorción puedo establecer la
siguiente relación matemática
Ley de Lambert-Beer : A= a.b.c

Am(muestra) = a.b.c a.b.cm Am Cm Cm= Cs . Am

As(estándar) =a.b.cs a.b.cs As Cs As

Cs es constante; es un factor =Fc Fc es el Factor de calibración

As

Cm= Am . Fc C m= Cs .Am
As
 Por comparación de una
solución conocida

CONCENTRACIÓN DEL PATRÓN = CONCENTRACIÓN DE LA MUESTRA

ABSORBANCIA DEL PATRÓN ABSORBANCIA DE LA MUESTRA

C muestra= C patrón x A muestra

A patrón

Solución de concentración conocida = Estándar ,patrón, calibrador

 Patron,estandar,calibrador
 En química analítica es una preparación que contiene una
concentración conocida de un elemento o sustancia. Puede estar
pronto para usar (lo compro al fabricante ) o puedo tener que
prepararlo .Su presentación es liquida o liofilizado.
 2. Curvas de Calibración

a. Es la representación grafica en un eje de coordenadas de

absorbancia (ordenadas) frente a concentración (abscisas) de
un estándar, calibrador o patrón.
b. La concentración desconocida la obtendremos por:
interpolación de las absorbancias o por el inverso de la
pendiente de de la grafica.
c. Sirve para conocer como responde mi método analítico
d. La muestra y el estándar deben ser procesados en Idénticas
condiciones .( establecidas en el inserto )
 Para realizar la curva de
calibración
 Necesitaremos el kit del analito
 Haremos diluciones seriada del estándar al menos tres (puntos
mínimos para armar la grafica)para obtener diferentes
concentraciones y se obtendrán las absorbancia correspondiente a
cada una de ellas
 La grafica se arma con la unidad que daré el informe
 Debe dicho estándar ; cumplir la ley de Lambert-Beer.
KIT (Reactivos, solventes, material de control , de calibración )
 Para realizar la curva de calibración
 El espectrofotómetro , pronto para usar
 Efectuar la medida del “blanco”(consiste en hacer una primer medida
solo con el solvente, la absorbancia del blanco se restara de las
absorbancias que se midan para los problemas)
 Papel milimetrado.
 Interpolación de las absorbancias para
conocer la concentración de la muestra
Una vez dibujada la curva en el papel milimétrico , y sabiendo que se
cumplen las leyes de absorción , podremos obtener la concentración
de la muestra por :

 interpolar la curva : Proceso la muestra según inserto ( iguales

condiciones que se proceso el estándar ) obtendré un valor de
absorbancia la cual la interpolare en la grafica

 sacar el factor de calibración que será

el inverso de la pendiente .
 Inverso de la pendiente para
obtener la concentración
 Calcular el factor de calibración( fc)
por inverso de la pendiente
1/pendiente (m)
 Tomando la formula de Lambert-
Beer
Cm=Absm . Fc
 Desempeño Analítico
La calidad de una técnica espectrofotométrica se basa
esencialmente en estos parámetros
 La linealidad
 Especificidad
 La sensibilidad
 El limite de detección
 El limite de cuantificación
 El intervalo analítico
 LINEALIDAD

 Se entiende por linealidad la capacidad de un método analítico

de obtener resultados proporcionales a la concentración de
analito en la muestra dentro de un intervalo determinado
 La linealidad es la proporcionalidad entre concentración del
analito y la respuesta del método en un intervalo o rango de
concentraciones
 SENSIBILIDAD

 La sensibilidad del método mide su capacidad para discriminar

entre pequeñas diferencias en la concentración del analito
 A medida que la concentración es menor ,la sensibilidad es
mayor o sea es necesaria menor concentración para que se
pueda detectar.
 LIMITE DE DETECCION

 Se define como la mínima concentración del analito

detectable por el método
 LIMITE DE CUANTIFICACION
 Llamado también limite de determinación, se define como la mas
pequeña concentración del analito que puede ser determinada
con un nivel de exactitud y precisión aceptables.
 INTERVALO ANALITICO
 Esta definido como intervalo de concentración en que el
analito puede ser determinado mediante la utilización de la
curva de calibración ; se considera que es el comprendido
entre el limite de cuantificación hasta la concentración en la
cual se pierde la linealidad de la curva
¿CALIBRADOR Y CONTROL
DE CALIDAD ES LO MISMO?

NO
 Calibrador
 Un patrón es una solución
absolutamente correcta en  Un suero control es aquel
cuanto a concentración e
identidad que sirve como
base para calcular la
concentración de una
sustancia en una muestra
 Su valor se calcula por la
problema.
 Se prepara a partir de una
muestra química conocida,
pesada con exactitud y
disuelta en un disolvente
adecuado
Control de
Calidad
que simula la composición
química y las características
físicas de la muestra que se
esta analizando
comparación con el valor
dado por un patrón. Queda
claro que un suero control no
reúne los requisitos de
exactitud de un patrón de
referencia ya que un suero
control debido a la presencia
de determinadas sustancias,
dará valores diferentes .
 ACTIVIDAD
Averiguar la concentración de la glucosa de un paciente.
Que necesitamos ?