PRÁCTICA

ESPECTROFOTOMETRÍA: DETERMINACIÓN DE GLICEMIA

A. Objetivos:

1. Entender el principio de espectrofotometría como herramienta para determinar

la concentración de una solución.

2. Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro a través de la medición de

la concentración de soluciones problema.

B. Introducción:

El análisis colorimétrico es posible gracias a la fusión de las leyes de Lambert,

según la cual “cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente con el crecimiento de la
longitud”, y la ley de Beer que dice que “la intensidad de un rayo de luz
monocromática que atraviesa un medio absorbente, disminuye exponencialmente
con el aumento de la concentración”.

La medición cualitativa que involucra el colorímetro o espectrofotómetro requiere

encontrar la longitud de onda óptima para cada sustancia a medir elaborando el
espectro de absorción, y la construcción de curvas de calibración con patrones de
concentraciones conocidas que permitan encontrar las concentraciones de
soluciones problema.

El principio del espectrofotómetro se basa en la emisión de un haz de luz a la

longitud de onda seleccionada, que se hace incidir sobre un lado de la solución a
estudiar y la medición en el lado opuesto, de la cantidad de luz que logra atravesar
la muestra. La cantidad de luz que atraviesa (Transmitancia) es inversamente
proporcional a la concentración de la muestra, es decir que entre más concentrada
sea (más cantidad de soluto por unidad de volumen tenga) más luz va a absorber
(Absrobancia) y será menor la cantidad que logre pasar a través de ella.

La relación entre la luz incidente I o y la cantidad de luz que es transmitida T es la

siguiente:

T= transmitancia
A= absorbancia
D.O.= densidad óptica
Io= luz incidente
It= luz transmitida

A = D.O.= log Io / It
Si Io es del 100% y la It es igual a T, la ecuación resultante será:

A= D.O.= log (100/T) = log 100 – log T = 2- log T

Es decir que A = 2- log T

C. Materiales y Reactivos:

Kit de determinación de glucosa en sangre de Biosystems

5 Tubos de 12x75
Pipetas de 5 y 10ml
Pipeteadores
Espectrofotómetro y cubeta
Beaker de descarte
Toallas desechables
Lápiz de cera
Jeringa desechable
Tubo seco
Alcohol
algodón

Para el desarrollo de la práctica se tendrán en cuenta los siguientes pasos:

1. Sangrado de los estudiantes voluntarios con jeringa por venipunción (hecha por el
profesor). La sangre se centrifuga por 5 minutos a 2500 r.p.m. para obtener el suero.

2. Medición de la glicemia según el inserto del kit de Byosystems.

E. Análisis de resultados

En el informe de laboratorio debe responder a los siguientes puntos:

1. En las mediciones espectrofotométricas, ¿cuál es la función del blanco?

2. Calcule la concentración de las muestras de suero, demuestre cómo hizo para

calcularla a partir de los datos que obtuvo en la práctica, y de acuerdo a la edad y
sexo del paciente, determine si el resultado del analito correspondiente está dentro
del rango normal o si está alterado.

3.¿Cuál es el papel de la glucosa oxidasa en el procesamiento de la muestra de

suero para glicemia?

4. ¿Por qué la lectura en el espectrofotómetro se hace a 500nm?