Metodologías (ELISA y CLIA) y

Sistemas Automatizados

Octubre, 2015 – Lima - Peru

Amadeo Sáez-Alquezar
Pruebas para el Diagnóstico de Enfermedades
Infecciosas Transmisibles por Transfusión
 SIGLO XX
 Antes de los años 90
 Pruebas poco sensibles y poco específicas
 Anti-HIV de 1ª y 2ª generación
 Ag HBs con baja especificidad
 Anti-HBc como marcador indirecto para HNANB
 Muchas pruebas “in house”
 Principalmente para Chagas
 Muchas pruebas con lectura visual (subjetiva)
 HAI, RFC, IFI
 Pocos laboratorios haciendo pruebas ELISA
 La mayoría de los procedimientos manuales
Pruebas para el Diagnóstico de Enfermedades
Infecciosas Transmisibles por Transfusión
 SIGLO XX
 Años 90
 Mejoría de la sensibilidad y especificidad de las pruebas y
detección de nuevos parámetros
 Anti-HIV (3ª G)
 Anti-HCV (1ª G, 2ª G, 3ª G)
 Anti-HTLV (1ª G, 2ª G)
 La mayoría de los laboratorios haciendo Inmunoensayos (ELISA,
MEIA, ELFA..)
 Inicio de los equipamientos automatizados para grandes rutinas
 La mayoría de las pruebas: kits comerciales
Pruebas para el Diagnóstico de Enfermedades
Infecciosas Transmisibles por Transfusión
 SIGLO XXI
 Inicio
 Predominan los inmuno ensayos (ELISA)
 Equipamientos automatizados para atender a grandes rutinas
 Las pruebas “in house” poco recomendadas
 Se recomienda el uso de pruebas NAT en paralelo con el
tamizaje serológico
 Se recomienda la adopción de procedimientos de control de
calidad interno y externo
Pruebas para el Diagnóstico de Enfermedades
Infecciosas Transmisibles por Transfusión
 ESCENARIO ACTUAL
 Principales alternativas:
 ELISA (Enzyme linked immunossorbent assay)
 CLIA (Quimioluminiscencia)
 Equipamientos automatizados
 Rutinas grandes o medianas
 Puntos de interés:
 Disminución del periodo de ventana inmunológica
 Pruebas NAT en paralelo al tamizaje serológico
 Confirmación de los resultados de las pruebas serológicas
 Gestión de la Calidad y Control de Calidad
Factores que hacen la diferencia
 Características de las pruebas serológicas
 Sensibilidad / Especificidad
 Diseño de los Kits diagnósticos
 Periodo de ventana más corto
 Pruebas de 4ª G (Ag/Ac) y NAT en paralelo

 Desempeño de las plataformas con pruebas ELISA y

CLIA
 Aplicación en rutinas medianas
 Aplicación en rutinas grandes
 Tiempo de reacción
 Facilidad y robustez de los equipamientos
 Asistencia técnica preventiva y continua
Conjunto de factores que representan la
performance

Pruebas Serológicas
• Características y Desempeño

Plataformas ELISA/CLIA
• Aplicación y Desempeño
TAMIZAJE EN DONANTES DE SANGRE
Características de las pruebas serológicas
para tamizaje en bancos de sangre
ALTA SENSIBILIDAD
 Detección de Antígenos y
Anticuerpo en bajos niveles
 Pueden encortar el periodo
de ventana inmunológica
 Puede ayudar en la
detección de variantes
virales
MEJOR ESPECIFICIDAD
 Disminuye el número de
Resultados Falsos
Reactivos
 Disminuye la pérdida de
unidades de sangre
 Disminuye el problema de
la comunicación al
donante
Características de las pruebas serológicas
para tamizaje en bancos de sangre
 Las pruebas usadas en el tamizaje serológico de donantes de
sangre son Cualitativas.
• detectan si el parámetro (Ac o Ag) investigado está presente o
ausente
• Cada prueba tiene su valor de corte (cut off)
• El índice: valor de lectura / Cut off define si la muestra es
reactiva o no-reactiva.
• La mayoría de los laboratorios adopta la “zona gris” que
corresponde a un % alrededor del valor de corte, donde los
resultados son considerados indeterminados
Valor de corte para las pruebas serológicas
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
o Ensayo Inmunoenzimático
 Desarrollado inicialmente por Engwall & Perlman en
Suécia y por Weemen & Schuurse en Holanda.
 Uno de los reactivos (Ag o Ac) está inmovilizado en
una fase sólida, en cuanto el otro puede estar ligado a
una enzima, preservándose la actividad enzimática y la
actividad inmunológica del anticuerpo o del antígeno.
 Detecta cantidades extremamente bajas de antígenos o
anticuerpos con elevada precisión.
Engvall E, Perlman P (1971). "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Quantitative assay of immunoglobulin G". Immunochemistry 8 (9): 871–4.
Componentes y Características de las pruebas
ELISA
Pruebas ELISA
Plataformas ELISA
Quimioluminiscencia
Luminiscencia es la emisión de luz asociada a la disipación de
energía de una sustancia que se encuentra en un estado
eléctricamente excitado

Un átomo de H en su estado fundamental. Electrón en nivel 1

si absorbe un quantum de energía = nivel 2 pasa a un estado Excitado de alta
energía.
Cuando el electrón vuelve a su nivel original ocurre liberación de energía.
Quimioluminiscencia CLIA
 Producción de luz por una reacción química
 Reacción de óxido-reducción
 Sensibilidad: ato mol 10-18 a zeptomol 10-21
 Derivados del isoluminol (H2O2 + catalizador) 1976
 Esteres de acridina (NaOH + H2O2) 1978
 H2O2 agente oxidante
 NaOH altera el pH para que ocurra la reacción de oxidación
Aplicaciones de la Quimioluminiscencia en el
laboratorio
 Marcadores serológicos
 Hormonas
 Marcadores tumorales,
 Drogas
 Inmune globulinas
 Vitaminas
 Homocisteína…

Las pruebas utilizan anticuerpos ligados a un marcador luminiscente

(cromógeno) que puede ser el luminol o derivados de acridina en sistema
avidina-biotina. Pruebas cuantitativas presentan alta sensibilidad.
Cuando se cambia un sustrato cromógeno por un luminiscente, se
obtiene una sensibilidad 10X mayor
Electro-Quimioluminiscencia
• La Electro-quimioluminiscencia consiste de un proceso
de reacciones químicas que generan luminiscencia a
partir de un estímulo eléctrico
• Las especies reactivas que producen la luminiscencia
son generadas en la superficie de un electrodo.
• El quelato tris (bipiridil) de rutenio es el marcador más
utilizado siendo que la ECL es generada en un
electrodo con tripropilamina
Plataformas de CLIA
CLIA - ARCHITECT® HIV Ag/Ab Combo Assay
CLIA - BIO-FLASH Anti-HIV
 ELISA CLIA
Soporte Micro placa Partícula magnética
Posibilidades Acceso aleatorio
Sensibilidad Semejante
Especificidad Semejante (?)
Velocidad +++ ++++
Pequeño porte Pequeño porte
Opciones
Gran porte Gran porte
Equipamientos Abiertos / Cerrados Cerrados
Tendencia en Disminución gradual,
los próximos principalmente en Aumentar
años grandes rutinas
PERFORMANCE
Point of Care – Pruebas Rápidas (PR)
 La Sensibilidad y Especificidad siempre son inferiores a
las pruebas tradicionales (ELISA / CLIA)
 El uso de las PR está aumentando en todo el Mundo por
la facilidad de utilización como atendimiento primario
de salud en condiciones donde la ejecución de otras
pruebas seria imposible
 Las PR son extremamente útiles para diagnóstico en el
terreno y para controlar enfermedades congénitas.
Pruebas tradicionales
 Pruebas No-Treponémicas
 VDRL – RPR
 Pruebas de IFI
 Sífilis, Chagas
 Pruebas de HAI
 Sífilis, Chagas
 RETROVIRUS
HIV y HTLV
Virus RNA que, a través de la enzima DNA-polimerasa
RNA dependiente (Transcriptasa reversa), son capaces de
copiar su genoma de RNA en una dupla cinta de DNA e
integrarse al genoma de la célula del huésped.
 HIV
Octubre, 2015 – Lima - Peru
Amadeo Sáez-Alquezar
Genoma del HIV
Clasificación del HIV
Tipo Grupo Sub-tipo
M (major) A , B, C , D, F, G, H, J, K
O (outlier) (Sub-subtipos)
1 N (non-M non-O) (A1 – A5)
(F1 – F2)
P
2 A–H

Formas recombinantes: Inter subtipos / Inter grupos

Formas recombinantes Circulantes: CRFs (1....43)

Virus Virus
heterozigoto recombinante
Estructuras de CRFs del HIV-1
Distribución geográfica de subtipos y CRFs del
HIV-1 identificados en Brasil
Representación del virus HIV-1
Proteínas de envoltura
Proteína matriz gp120
p17
Proteínas del envoltura
gp41
Membrana RNA
lipídica
Transcriptasa reversa

Capsula p24
HIV – Conceptos: Transmisión

 Transfusión sanguínea.
 Uso de jeringas y agujas contaminadas
 La transmisión sexual
Pruebas utilizadas para el diagnóstico y
seguimiento de infectados por el HIV
1. Diagnóstico y Tamizaje serológico
Pruebas serológicas
Pruebas de biología molecular
2. Tratamiento con antirretrovirales (TARVs)
Carga Viral
CD4
Genotipo/fenotipo
3. Seguimiento
Los mismos del ítem 2
Pruebas Serológicas (HIV)

 Directas: pesquisa de antígenos

Ag p24 HIV
 Indirectas: pesquisa de anticuerpos
 HIV: anti-HIV
 Combo: pesquisa de Ag + Ac
HIV: Ag/Ac;
 Pruebas HIV/RNA
PCR, TMA, NASBA, NAT
Pruebas Serológicas - Metodologías

 Inmunoensayos
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
CLIA (quimioluminiscencia)
 Pruebas Rápidas
Inmunocromatografía
Evolución de las pruebas serológicas para diagnóstico de
la infección por HIV
GENER. PRINCIPIO VENTANA FRACCIONES
Detección: Ac IgG Lisado viral
1ª e 2ª 4 – 12 semanas
2ª G prot purificadas Ag rec
a) rec HIV-1: env y gag
rec HIV-2: env
b) gp160 y p24 purificadas
3ª Detección: Ac IgG y IgM 3 – 4 semanas
PS de la región gp41 del HIV-1 “O”
gp36 del HIV-2

HIV-1 gp160, Ag p24

Usan un Ac para detectar el Ag PS de la región gp41 del HIV-1 “O”
4ª p24 2 semanas gp36 del HIV-2
“combo”

Anti-HIV 1+2 Anti-HIV 1+2+”O” HIV Ag/Ac

Pruebas Serológicas HIV
 Pruebas de 3ª generación
 JI: en media 21 días
 Pruebas de 4ª generación
 JI: en media 17-18 días
 Pruebas Rápidas
 JI: semejante a las de 3ª o 4ª generación
 Sensibilidad y especificidad inferiores a las pruebas
convencionales
 Prueba Oral (saliva)
 JI: semejante a las pruebas de 3ª generación
 Precisión: 97 - 99%
Pruebas para Tamizaje Serológico del HIV

 Recomendaciones:
 Alta Sensibilidad Analítica
 Alta Sensibilidad Clínica
 Capaces de detectar ≠ tipos, subtipos, sub-subtipos y
CRFs
 Para las pruebas de 4ª Generación, alta sensibilidad para
el Ag p24
 La mejor especificidad (≥ 99,8%)*

K. Malm, M. von Sydow & S. Andersson; Transfusion Medicine, 2009; 19(2): 78-88,
Pruebas Serológicas

 Confirmatorias
 Alta especificidad
 Ejemplos
 HIV-1: Western blot / inmunoblot
 HIV-2: Inmuno blot
Bandas observadas - WB para HIV-1
BANDAS GENOMA PRECURSORES DE
GP160 ENV GP110/120 E GP41
GP110/120 ENV Envoltorio
P68/66 POL Transcriptasa reversa
P55 GAG Proteínas del core
P52/51 POL Transcriptasa reversa
GP41 ENV GP Transmembrana
P40 GAG Proteínas del core
P34/31 POL Endonucleasa
P24/25 GAG Proteínas del core
P18/17 GAG Proteínas del core
Interpretación de resultados del WB-1

OMS
Bandas observadas - WB para HIV-2

BANDAS GENOMA PRECURSORES DE

GP140 ENV GP105 E GP36
GP105/125 ENV Envoltorio
P68 POL Transcriptasa reversa
P56 GAG Proteínas del core
GP36 ENV GP Transmembrana
P34 POL Endonucleasa
P26 GAG Proteína interna
P16 GAG Proteína interna
Interpretación de resultados del WB-2
INTERPRETACIÓN PERFIL PERFIL (DVV)
POSITIVA ENV + GAG + POL Una ENV y por lo menos
GAG o POL
ENV + GAG
ENV + POL
GAG + POL Cualquier perfil que no
INDETERMINADA
GAG corresponda a los anteriores
POL
ENV
NEGATIVA AUSÊNCIA DE AUSENCIA DE BANDAS
BANDAS
Resultado reactivo de una prueba serológica

Deberá ser confirmado:

• Por Pruebas serológicas confirmatorias
• Por Pruebas de biología molecular

Siguiendo un Algoritmo pre establecido

Marcadores de la infección por el HIV
en la sangre
marcadores en el plasma
Concentración de los

Semanas de infección
Clasificación de Fiebig para las etapas por
el laboratorio de la infección por HIV
MARCADOR Duración en días (IC 95%)
ETAPA
RNA p24 Ag IE 3aG WB Individual acumulado
0 - - - - 10 (7-21) 10
I + - - - 7 (5-10) 17

II + + - - 5 (4-4) 22
III + + + - 3 (2-5) 25
IV + +/- + Ind 6 (4-8) 31
V + +/- + +(-p31c) 70 (40-122) 101
VI + +/- + +(+p31) Sin límite Sin límite
Fases de la infección reciente por HIV-1
 En el tamizaje de
donantes de sangre
% de descarte para HIV (HCSP)
Pruebas y critério:

ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%)

CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%)

Levi JE, 2013

Riesgo residual por transfusión en donantes
de sangre de Brasil *
Banco se Sangre Riesgo residual / 1.000.000 (IC 95%)
Ag Ac IE (15 dias) MP NAT (9.0 dias) ID NAT (5,6 dias)
Recife 13,1 (8,3 - 17,8) 7,8 (5,1 – 10,6) 4,9 (3,2 – 6,6)
BH 10,0 (5,4 – 14,6) 6,0 (3,3 – 8,7) 3,7 (2,0 – 5,4)
São Paulo 10,6 (6,9 – 14,4) 6,4 (4,2 – 8,5) 4,0 (2,6 – 5,3)
Brasil 11,3 (8,4 – 14, 2) 6,8 (5,1 – 8,4) 4,2 (3,2 – 5,2)

MP: mini pools; ID: Muestras individuales

Sabino EC et al; Transfusion, 2012; 52: 870-879

Ejemplo de suero-conversión

Levi JE, 2013

Pruebas Rápidas

(Reactivo)

(No Reactivo)

Inmuno cromatografía Inmuno cromatografía

Flujo lateral de dupla migración
Algoritmo 1 (PR-1 + PR-2)
Muestra de Resultados válidos
sangre Discordancias
Nueva muestra:
prueba convencional
Prueba Rápida 1 Prueba Rápida 2

Si
Reactivo Reactivo

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
Algoritmo 2 (PR-1- oral + PR-2)
Muestra de Muestra de Resultados válidos
sangre saliva Discordancias
Nueva muestra:
prueba convencional
Prueba Rápida 1 Prueba Rápida 2

Si
Reactivo Reactivo

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
Algoritmo 3 (IE 4ª G + Prueba molecular)
Muestra de suero o
plasma WB

NO Reactivo
Prueba
IE 4ª G No reactivo
molecular
indeterminado
Si Si Si
Reactivo* Reactivo

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
(*): ≥ 5000 cópias/mL
Algoritmo 4 (IE 3ª G + Prueba molecular)
Muestra de suero o
plasma WB

NO Reactivo
Prueba No reactivo
IE 3ª G
molecular indeterminado
Si Si Si
Reactivo Reactivo*

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
(*): ≥ 5000 cópias/mL
Algoritmo 5 (IE 3ª G + Western blot o IB)
Muestra de suero o
plasma Prueba
molecular
NO Reactivo*
IE 3ª G WB No reactivo
indeterminado
Si Si Si
Reactivo Reactivo

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
(*): ≥ 5000 cópias/mL
Algoritmo 6 (IE 4ª G + WB o IB)
Muestra de suero o
plasma Prueba
molecular
NO Reactivo*
IE 4ª G WB No reactivo
indeterminado
Si Si Si
Reactivo Reactivo

NO Si

No Reactivo Reactivo para

para HIV HIV
(*): ≥ 5000 cópias/mL
Posibles errores en el diagnóstico de infección
por el HIV
 Ventana inmunológica
 Cepas o variantes virales
 Individuos “Inmunosilenciosos”
 “Controladores de elite”
 Durante el procesamiento
 Fase pre-analítica, analítica e póst-analítica
 Procedimientos inadecuados de CQI
HTLV
HTLV - Conceptos
En 1977 fue descripta en Japón una nueva entidad
clínica llamada Leucemia das células T del adulto
(ATL).
El primer retrovirus humano, el HTLV-1 fue
descubierto en 1980 y el HTLV-2 en 1982. Ambos están
asociados con enfermedades hematológicas y
neurológicas graves.
Paraparesia espática tropical
Leucemia de las células T del adulto
HTLV - Conceptos

Más recientemente fueron descubiertos dos nuevos

miembros: HTLV-3 y HTLV-4

Entre 15 a 25 millones de personas están infectadas

por el HTLV en el Mundo.
HTLV – Conceptos: Transmisión

 Transfusión sanguínea principalmente por

componentes celulares.
 Uso de jeringas y agujas contaminadas
 La transmisión sexual es de bajo riesgo
 Transmisión madre / hijo, por la leche materna
HTLV - Conceptos

 El periodo de ventana para la infección por el

HTLV ha sido estimado en 51 días (rango: 36 –
72 días) en estudios epidemiológicos que
evaluaron individuos que habían recibido
transfusión de donantes infectados.
¿Cuales son los factores de riesgo para HTLV-1?
 Que vive o viene de región donde el HTLV-1 es más
prevalente
 Sudoeste de Japón, algunas regiones del Caribe, algunas partes
de África y de América del Sur (Brasil, Perú, Chile, Guyana)
Oriente Medio, Melanesia..)
 Usuario de drogas inyectables (presente y pasado)
 Contacto sexual de riesgo (no protegido)
 Si fue Amamantado por madre infectada por HTLV-1
 Transfusión sanguínea (antes de 1988 en USA)
¿Cuales son los factores de riesgo para HTLV-2?
 Uso de drogas inyectables (presente y pasado)
 Contacto sexual de riesgo (no protegido)
 Fue Amamantado por madre infectada por HTLV-1
 Transfusión sanguínea (antes de 1988 en USA)
 Etnias indígenas en el continente Americano
 Norte, Centro y Sur
 Etnias de Pigmeos en África
HTLV – Conceptos: Prevención
 Informar a la persona que está infectada
por HTLV.
 Cual el significado
 Riesgos de transmisión
 Transfusión sanguínea
 Contacto sexual
 Amamantar
Pruebas de laboratorio para la infección por HTLV

 Serológicas
 ELISA; CLIA; HAP
 Serológicas complementarias
 WB; IB
 Moleculares
 PCR (Sangre total)
HTLV - Conceptos

 PCR anidada (nested PCR) capaz de detectar dos

fragmentos virales: uno correspondiente al gen
tax y outro al gen pol, siendo este gen el que
permite diferenciar el tipo viral,
HTLV - Conceptos
 El diagnóstico clínico de la infección por el HTLV 1 y 2
todavía está basado principalmente en pruebas serológicas
(ELISA y Western blot).
 La mejoría del desempeño de los ensayos serológicos para el
diagnóstico del HTLV podrán traer beneficios para el
control de las enfermedades relacionadas con el HTLV.
 Los ensayos Inmunoenzimáticos de 3ª y 4ª generación han
empleado antígenos recombinantes en la captura y
antígenos marcados como conjugado.
Inmunoensaios para diagnóstico da infecção por
HTLV (HTLV-1, HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4)

1ª Generación
Lisado viral / Ac marcado – baja especificidad
2ª Generación
Ag rec / Ac marcado – especificidad mejorada
3ª e 4ª Generación
Ag rec / Ag marcado – Alta Sensibilidad y
especificidad
Pruebas para diagnóstico de la infección por
HTLV

Selección de
antígenos recombinantes
y de péptidos sintéticos

Gp 21 Ag recombinante Gp 21 Ag recombinante
HTLV I HTLV II
Gp 46 péptido sintético Gp 46 péptído sintético
Pruebas anti-HTLV para el Tamizaje serológico

Deben poseer antígenos específicos para HTLV-1 y HTLV-2

La mejor sensibilidad y especificidad

3ª y 4ª generación (Gp21, gp46-I , gp46-II)

Sin anticuerpo secundario

(Ag marcado como conjugado)
Detección simultanea de Acs: IgA, IgG e IgM
Detección precoz
Proteínas del HTLV usadas en la interpretación
de Western blot
Proteínas virales genes Características
Gp 46 ENV Proteínas de superficie del envelope
rgp 46 ENV Proteína rec derivada de la gp 46
gp 21 ENV Proteína transmembrana del envelope
Gd 21 POL Proteína rec que contiene el epitopo
inmunodominante de la gp 21
p 24 GAG Proteína del cápsideo viral
p 19 GAG Proteína de la matriz viral
 Pruebas serológicas complementarias para
HTLV
Western Blot - HTLV I 2.4 Inmuno Blot - Lia INNOLIA
MP Biomedicals, Singapore Immunogenetics, Belgium

HTLV-1 STLV3 NEG HTLV-3

HTLV-2
HTLV-3Pyl43 strain
strain of HTLV-3 : Lobak18

The Journal of Infectious Diseases 2009; 199:561– 4

Interpretación de los resultados del WB
PERFIL DE BANDAS INTERPRETACIÓN
Ausencia de bandas Negativo
Proteínas del GAG (p19 con o sin p24) y Positivo p/ HTLV-1
Dos proteínas del ENV (GD21 y rgp 46-1)
Proteínas del GAG (p24 con o sin p19) Positivo p/ HTLV-2
Dos proteínas del ENV (GD21 y rgp 46-2)
Proteínas del GAG (p19 y p24) Positivo p/ HTLV
Proteínas del ENV (GD21)
Cualquier otra combinación de bandas Indeterminado
Algoritmo para HTLV
Tamizaje
Anti-HTLV-1+2*

Reactivo Indeterminado No Reactivo

Repetir en duplicado

Reactivo / IND No Reactivo

WB/IB PCR en nueva
muestra de ST
HTLV-1 HTLV-2 HTLV IND Negativo
(*): 3ª ou 4ª G
Gracias - Preguntas
amadeo62@gmail.com