10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

Agronomía Tropical Servicios Personalizados

versión impresa ISSN 0002-192X
Articulo
Agronomía Trop. v.53 n.1 Maracay mar. 2003
Articulo en XML

Referencias del artículo

DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE
RAPDS Como citar este artículo

Traducción automática
Martha E. Osorio*, Efraín Salazar,** Asia Y. Zambrano** y J. R.
Demey*** Enviar articulo por email

*Estudiante graduado. UCV Indicadores

**Investigadores. CENIAP-INIA Citado por SciELO

***Consultor. TI-GC Accesos

Resumen Links relacionados

Compartir
Se estudia la diversidad genética de los materiales de cacaos criollos
pertenecientes al Banco de Germoplasma Colección 95 ubicado en Otros
Ocumare de la Costa, estado Aragua, Venezuela y materiales Otros
pertenecientes a los tres grupos de cacaos de referencia: criollos (Chuao-
120, Porcelana y Guasare), trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros (IMC- Permalink
11 e IMC-67), a través de la amplificación al azar de fragmentos de ADN
polimórficos (RAPD). El iniciador OPC-14 fue el que produjo la estructura
que mejor describe la diversidad natural de los genotipos y permitió la formación de cuatro grupos. Esta
clasificación prueba una relación entre la procedencia y los grupos generados por medio de la caracterización
molecular, sugiriendo que los genotipos de la Colección 95 han sido propagados a partir de una planta común.

Palabras Clave: Theobroma cacao L.; diversidad genética; marcadores moleculares; RAPD.

Summary

A study was undertaken of the genetic diversity of criollo cocoa materias belonging of the germ plasm bank
collection 95 in Ocumare de la Costa, Aragua State, Venezuela and materials of belonging to the three reference
cocoa groups: criollo (Chuao-120, 1-Porcelana and Guasare), trinitarios (ICS-8 and OC-61) and forasteros (IMC-
11 and IMC-67), through a random amplication of polymorphic DNA (RAPD) fragments. The OPC-14 indicator
produced the structure which describes best the natural diversity of the genotypes and allowed the formation of
four groups. This classification proves a relation between origin and the groups generated through molecular
characterization. Results suggest that genotypes of collection 95 have been propagated from a common plant.

Key Words: Theobroma cacao; genetie diversity; rnolecular markers; RAPD.

Recibido: abril 06, 2001

Introducción

La totalidad del cacao, Theobroma cacao L., cultivado en Venezuela hasta mediados del siglo XIX era del tipo
criollo (Pittier, 1933). La alta calidad reconocida mundialmente de este tipo de cacao ha sido el soporte del
desarrollo de la industria cacaotera nacional. Sin embargo, a finales de ese siglo se produjo un proceso de
hibridación descontrolada con los cacaos traídos de Trinidad lo cual originó la pérdida de los árboles criollos
típicos, ocasionando la disminución de la calidad del producto venezolano.

Debido a la necesidad urgente de rescatar los genotipos criollos típicos, para mantener los precios del mercado
basados en la calidad, así como para, iniciar programas de mejoramiento genético tendentes a la obtención de
plantas de cacao criollo con productividad aceptable y alta calidad en sus frutos, se crea la colección de
germoplasma conocida como colección 95, en la Estación Experimental de Ocumare de La Costa, conformada

ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 1/6
10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

por plantas con características propias de cultivares criollos, y cuyos rendimientos fueron sostenidamente
superiores al promedio para este tipo de materiales.

La selección se realizó utilizando metodologías tradicionales basadas en la combinación de aspectos

agronómicos y morfológicos siguiendo descriptores para esta especie. No obstante, esta caracterización ha sido
cuestionada por basarse en caracteres fenotípicos, directamente influenciados por la heredabilidad del rasgo,
factores ambientales, herencia multigénica, herencia cuantitativa y por la dominancia parcial en algunos
caracteres, lo cual puede confundir la expresión de un rasgo genético (Wilde et al., 1992).

El desarrollo de marcadores como los polimorfismos en las longitudes de los fragmentos de restricción de ADN
(RFLP) y la amplificación al azar de fragmentos de ADN polimórficos (RAPD) han hecho posible caracterizar los
individuos, así como evaluar relaciones filogenéticas entre los mismos de manera más eficiente (Figueira et al.,
1992; Wilde et al., 1992).

Por lo antes expuesto, el estudio de la diversidad genética de la colección basada en marcadores moleculares se
presenta como una alternativa más precisa para la identificación de los materiales, ya que estas técnicas
permiten la discriminación de los individuos en función del genotipo, independientemente del efecto ambiental o
de las interacciones entre genes. Entre las metodologías desarrolladas, los RAPD ofrecen la ventaja adicional de
ser una metodología más rápida, sencilla que no presenta el riesgo de uso de materiales radioactivos (Thormann
y Osborn, 1992; N'Goran et al., 1994; Figueira et al., 1994; Lazo et al., 1994).

Lanaud et al. (1999) estudiaron cacaos criollo, trinitaria y forastero mediante RFLP y RAPD y establecieron las
relaciones filogenéticas entre estos tipos, facilitando un punto de referencia para el análisis de los resultados
que se obtengan en la caracterización de poblaciones de cacao utilizando cualquiera de estos dos tipos de
marcadores.

Este trabajo tiene como objetivo estudiar la diversidad genética de las entradas de cacao de la colección 95 de
la Estación Experimental de Ocumare de La Costa, estado Aragua y su comparación con los cacaos de referencia
criollo, trinitaria y forastero, empleando marcadores moleculares (RAPD).

Materiales y métodos

Material Vegetal

Se seleccionaron hojas jóvenes y frescas de los materiales de la colección 95 de cacao criollo (Cuadro 1) según
la caracterización definida por Sánchez y Tortolero (1996) y materiales pertenecientes a los tres grupos de
cacaos de referencia: criollos (Chuao-120, Porcelana y Guasare), trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros (IMC-
11 e IMC-67).

Aislamiento de ADN

Las hojas seleccionadas se pulverizaron con nitrógeno líquido, añadiéndosele posteriormente 5 ml de buffer
CTAB 2X (2% de CTAB, 100 mM de tris base pH 8,0, 20 mM de EDTA pH 8,0, 1,4M de cloruro de sodio y 0,3%
de b-Mercaptoetanol con 100 mg de Polyvinilpirrolidona 40,000 (PVP-40) por gramo de tejido foliar, para ser
llevado a incubación a 60 °C por 60 minutos. Luego se agregó cloroformo: octanol (24:1) precipitándose con
dos volúmenes de Etanol 95% y 0,5 volúmenes de NaCI 5M. Una vez precipitado y peletizado el ADN se
agregaron 300 m l de buffer de resuspensión TE (10 mM de tris-HC1,1 mM de EDTA pH 8,4), para dejarse
resuspendiendo durante toda la noche a 4 °C; seguidamente se realizó una doble purificación con fenol
equilibrado: cloroformo (1:1), eliminando así la presencia de ARN con ARNasa A (Promega) según estudios de
Porebski et al. (1997).

CUADRO 1. Colección 95 de cacao criollo

Material Procedencia Código

Tamaira-3 Chuao TA-3Los

Serapios-2 Chuao LS-2
Palmira-1 Chuao PAL-1
Pasaguapo-5 Chuao PAS-5
La Vega-3 Chuao LV-3
La Vega-6 Chuao LV-6
La Vega-15 Chuao LV-15
La Madre de Dios-1 Chuao LDM-1
Cata-1 Cata Cata-5
Cata-8 Cata Cata-8
Cata-16 Cata Cata-16
Cuyagua el coco Cuyagua CEC-1
Cuyagua paso clarito-1 Cuyagua CPC-1
Cuyagua remedio de pobre-1 Cuyagua CRP-1
Cuyagua remedio de pobre-2 Cuyagua CRP-2
Cuyagua nombre María-4 Cuyagua CNM-4
Cuyagua mamei roleao-2 Cuyagua CMR-2

ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 2/6
10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

Cuyagua mamei roleao-4 Cuyagua CMR-4

Cuyagua mamei roleao-5 Cuyagua CMR-5
Capellania-1 Cumboto CP-1
Capellania-4 Cumboto CP-4
Capellania-5 Cumboto CP-5
Capellania-8 Cumboto CP-8
Capellania-9 Cumboto CP-9
Santa Cruz de la Vega-6 Cumboto SCLV-6
Santa Cruz de la Vega-7 Cumboto SCLV-7

Los ADN fueron cuantificados de manera visual con la ayuda del ADN del fago lambda (470 m g/m l) de
Promega, almacenados luego a -20 °C para los usos subsiguientes.

Amplificación del ADN

Para la amplificación se utilizaron iniciadores de Operon Technology (Alameda, California) con aproximadamente
70% de G=C y 10 mer, Taq ADN polimerasa (Promega, Corp.), dNTPs (100 mM) y buffer de reacción 10 X
(Promega, Corp).

La mezcla de amplificación para un volumen total de 25 m l estuvo compuesta de: 1,5 mM de MgC12, 5 mM de
dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1 m M de iniciador, 25 ng de ADN genómico, 1,25U de Taq polimerasa y 3 m l de
buffer Taq polimerasa (1OX). Los iniciadores probados fueron: OPA-01, OPA-02, OPA-04, OPA-07, OPA-10, OPA-
11, OPA-12, OPA-15, OPA-17, OPA-18, OPA-19, OPB-01, OPB-03, OPB-05, OPB-06, OPB-07, OPB-11, OPC-13,
OPC-14, OPC-15, OPC- 16, OPD-01, OPE-02, OPE-08, OPF-12, OPF-13, OPF-14, OPM-04, OPM-14 y OPM-20.

Las mezclas fueron sometidas a un primer ciclo de desnaturalización del ADN a 94 °C por 5 min, hasta cumplir
42 ciclos de cambios de temperaturas; cada ciclo estuvo compuesto de los siguientes segmentos: 93 °C por 1
min; 37 °C por 30 segundos y 72 °C por 2 min. Luego se llevó a cabo una fase final de incubación a 72 °C por 7
min (Porebski et al., 1997).

Para la visualización de los fragmentos amplificados se tomaron 10 ml de cada una de las soluciones de ADN
amplificadas al azar, mezclándolas con 2,2 m l de glicerol 65% y 0,8 m l de azul de Bromofenol (1%),
separados electroforétícamente en geles de agarosa 2% (con 2 m l de una solución de bromuro de etidio a
razón de 10 mg/ml) a 40 mA durante 2 h y 45 min, utilizándose el buffer TBE 1X, pH 8,3 como buffer de
electrodo. Los pesos moleculares de los genotipos estudiados se establecieron mediante el Molecular Weight
Markers 50 bp DNA Step Ladder, 90 m g de Promega.

Análisis de la diversidad

Para el análisis digital de la imagen de los productos de PCR se utilizó la cámara Kodak DC-40, lentillas de
acercamiento de 6 dioptrías (+6), el cono N° 4 (Edas Hood N° 4) y un filtro para Bromuro de Etidio (590 Df, 100
nm). La sensibilidad de banda utilizada fue de 75%. Los geles fueron digitalizados utilizando el ID lmage
Analysis Software (EASTMAN KODAK COMPANY, 1977). Con el analizador de imágenes se realizó un análisis
cuantitativo de las bandas separadas, lo que permitió reconocer los patrones para cada material genético en
pares de bases.

Con las bandas identificadas en los patrones de cada material genético, se generó un vector de orden para el
conjunto de las movilidades absolutas y construyó una matriz, en ella la movilidad fue sustituida por ausencia o
presencia de la banda, es decir, una matriz de ceros (0) y unos (1) que indicaron el patrón observado para cada
individuo, según metodología descrita por Zambrano (1999).

La diversidad genética entre los materiales de la colección 95 y los cacaos criollos, trinitarios y forasteros,
utilizados como genotipos de referencia, fue estudiada usando tres coeficientes de similitud: Jaccard, Simple y
Dice (Sokal y Sneath, 1963). Se utilizó el dendrograrna como método de representación gráfica; se probaron
tres métodos de agregación: ligamiento simple, ligamiento medio y ligamento completo (Sneath y Sokal, 1973).

El coeficiente de correlación cofenética sirvió para evaluar cómo era preservada la estructura de los datos por
los diferentes métodos de agrupación, esperando que el agrupamiento con mayor coeficiente fuese el que mejor
describa el agrupamiento natural de los datos (Rohlf y Sokal, 1981).

Todos los análisis se realizaron utilizando el NTSYSpc ver 2,10t (Exeter SOFTWARE, 2000).

Resultados y discusión

De los 30 iniciadores empleados, sólo OPA-04 (AAATCGGGCT), OPB-07 (GGTGACGCAG) y OPC-14

(TGCGTGCTTG) fueron los que produjeron la mayor cantidad de fragmentos amplificables y reproducibles. El
iniciador OPC-14, cuya electroforesis de productos de amplificación se presenta en la Figura 1, fue el que
produjo la estructura que mejor describe la diversidad natural de los genotipos.

La mejor representación gráfica (Figura 2) se obtuvo de la distancia medida mediante del coeficiente de
similitud de Jaccard bajo el método de agrupación de ligamiento medio, con un coeficiente de correlación
cofenética (r=0,96908; Cuadro 2).

ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 3/6
10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

El estudio de las relaciones genéticas de los cacaos de la colección 95 permitió la formación de 4 grupos (Figura
2); el 1ro con los materiales cuya distancia entre los miembros de cada grupo es menor o igual a 0,40, formado
por tres materiales provenientes de Cata (CATA-5, CATA-8 y CATA-16), 6 materiales de Chuao (PAL-1, PAS-5,
LV-3, LV-6, LV- 1 5 y LDM-1), 4 de Cuyagua (CNM-4, CMR-2, CMR-4 y CMR-5), los genotipos criollos (Porcelana
y Guasare) y los trinitarios (ICS-8 y OC-61). Los resultados indican que existe una similaridad genética de los
genotipos de la colección 95 con los genotipos de referencia criollos y trinitarios, estos últimos con una alta
cercanía genética entre ellos. Resultados similares han sido señalados por Lanaud et al. (1999), lo que explicaría
la disminución de la calidad del producto venezolano como resultado del proceso de hibridación desconocida.

FIGURA 1. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico (RAPD), usando el iniciador OPC-14,
en los 26 materiales pertenecientes a la colección 95 y los tipos de referencia.

FIGURA2. Relaciones genéticas de los cacaos de la colección 95 y los tipos de referencia (Chuao-
120, Porecelana y Guasare, trinitarios (ICS-8 y OC-61) y forasteros . estudiadas a traves de (1-
coeficiente
de similitud de Jaccard) y el método de ligamiento medio para su agrupación jerárquica. Iniciador
OPC-14.

CUADRO 2. Coeficientes de correlación cofenética para las distancias medidas mediante los
diferentes coeficientes de similitud y métodos de agrupación para cada primer.

Coeficientes de Similitud

Iniciador Métodos de Agrupación Jaccard Simple Dice

Ligamiento simple 0,93978 0,88668 0,90017

OPA-04 Ligamiento medio 0,96757 0,94744 0,94046
Ligamiento completo 0,95219 0,93024 0,92355

Ligamiento simple 0,93918 0,81622 0,86044

OPB-O7 Ligamiento medio 0,95815 0,94468 0,90731
ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 4/6
10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

Ligamiento completo 0,88451 0,86749 0,88604

Ligamiento simple 0,91067 0,84731 0,86144

OPC-14 Ligamiento medio 0,96908 0,89419 0,95075
Ligamiento completo 0,92935 0,79477 0,90075

El 2do grupo correspondiente a los materiales cuya distancia es menor o igual a 0,55 constituido por los dos
restantes genotipos de Chuao (TA-3 y LS-2), los materiales procedentes de Cumboto (CP-1, CP-4, CP-5, CP-8,
CP-9, SCLV-6 y SCLV-7) y los genotipos de referencia forasteros (IMC-11 y IMC-67).

El 3er grupo lo forma únicamente el tipo de referencia Chuao-120, y el 4to grupo integrado por los restantes
cuatro materiales de Cuyagua los cuales se segregan del resto, con alta similitud entre ellos, lo que hace
presumir que son los que verdaderamente se destacan del resto de la colección.

Esta clasificación sugiere que existe relación entre la procedencia y los grupos generados a través de la
caracterización molecular. La hipótesis de que los grupos generados por la clasificación son independientes de la
procedencia, fue rechazada según el estadístico Chi-cuadrado con una significancia de p<0,01, lo que corrobora
que los genotipos de la colección 95 se agrupan casi exclusivamente por su procedencia o sitio de colecta,
sugiriendo que estos materiales han sido propagados a partir de una planta común y que, tal como lo señalan
Figueira et al. (1994), se han producido algunas alteraciones o cambios morfológicos en las partes más
preciadas por el hombre (y que permitió colectarlas como materiales diferentes), sin un cambio substancial en la
base genética, detestable a través de un marcador dominante como el RAPD.

Lo antes señalado corrobora la limitación principal de los descriptores morfológicos, que favorecen una imagen
sesgada de la verdadera diversidad de los materiales en función del paisaje y un interés agronómico.

En su conjunto, estos resultados concuerdan con los obtenidos por Lanaud et al. (1999), quienes señalan que
las variedades de criollos son muy contrastantes en cuanto a su morfología y que van desde el tipo porcelana de
mazorcas lisas, al tipo pentágono de mazorcas particularmente rugosas, pero que son muy homogéneas desde
el punto de vista genético. También señalan que la selección humana ha jugado un papel fundamental en la
situación mencionada, ya que ha contribuido a la fijación y conservación de tipos morfológicos muy diferentes
resultado de mutaciones puntuales.

La alta heterogeneidad detectada dentro de los grupos sugiere que el germoplasma ha sido expuesto a una alta
hibridación natural en el tiempo. De allí la necesidad de incluir poblaciones naturales de Theobroma en estudios
genéticos de variedades cultivadas para discernir mejor las relaciones genéticas dentro de estas, lo cual es
esencial para el desarrollo de los planes dirigidos a la conservación y el mejoramiento del banco de
germoplasma.

Los resultados obtenidos incorporan elementos que apoyan la necesidad de revisar la actual clasificación de los
tipos de cacaos que posibilite establecer relaciones de parentesco entre los mismos.

Bibliografía

1. EASTMAN KODAK COMPANY. 1997. 1 D Image Analysis Software. 230 p. [ Links ]

2. EXETER SOFTWARE. 2000. NTSYSpc ver 2.10t. Applied Biostatistics lnc. [ Links ]

3. FIGUEIRA, A., J. JANICK and P. GOLDSBROUGH. 1992. Genome size and DNA polimorphism in Theobroma
cacao L. J. Amer. Soc. Hort. Sei. 117 ( 4): 673-677. [ Links ]

4. FIGUEIRA, A., J. JANICK, M. LEVY and P GOLDSBROUGH. 1994. Reexamining the classifícation of
Theobroma cacao L. using molecular rnarkers. J. Amer Soc. Hort. Sei. 119 ( 5): 1073-1082. [ Links ]

5.LANAUD, C., J. C. MOTAMAYOR and O. SOUNIGO. 1999. Le cacaoyer. In: Diversité génétique des plantes
tropicales cultivées. P. Hamon, M. Seguin, X. Perrier et J. C. Glaszman Editeurs scientifiques. CIRAD. p. 141-
170. [ Links ]

6. LAZO, G. R., P. YONG-HA and J. K. RUSSELL. 1994. ldentification of RAPD markers linked to fiber strength
in Gossypium hirsutum and G barbadense Interspecific Crosses. The Biochemistry of Cotton Workshop. Sept. p.
1-7. [ Links ]

7. N'GORAN, J., V. LAURENT. A. RISTERUCCI and C. LANAUD. 1994. Comparative genetic diversity studies of
Theobroma cacao L. using RFLP and RAPD markers. Heredity 73: 589-597. [ Links ]

8. PITTIER, H. 1933. Degeneration of cocoa through natural hybridization. The Journal of Heredity. 36: 335-
390. [ Links ]

9. POREBSKI, S., L. G BAILEY and B. R. BAUM. 1997. Modification of CTAB DNA extraction protocol for plants
containing high polysaccharide and polyphenol component. Plant Molecular Biology Reporter. 15 ( 1): 8-
ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 5/6
10/4/2021 DIVERSIDAD GENÉTICA DE UNA COLECCIÓN DE CACAO MEDIANTE RAPDS

15. [ Links ]

10. ROHLF, F. J. and R. R. SOKAL. 198 1. Comparing numerical taxonomic studies. Systematic Zool., 30: 459-
490. [ Links ]

11. SÁNCHEZ, P. y J. TORTOLERO. 1996. Caracterización y establecimiento de un banco de germoplasma de

cacao criollo en el litoral aragüeño. Informe Final. 53 p. [ Links ]

12. SNEATH, P. H. A. and R. R. SOKAL. 1973. Numerical taxonomy. Freeman. San Francisco. 573
pp. [ Links ]

13. SOKAL, R. R. and P. H. A. SNEATH. 1963. Principles of numerical taxonomy. Freeman. San Francisco. 359
pp. [ Links ]

14. THORMANN, C. and T. OSBORN. 1992. Use of RAPD and RFLP markers for germplasm evaluation.
Department ofagronomy. University of Wisconsin, Madison. 80: 3 560-3 566. [ Links ]

15. WILDE, J., R. WAUGH and W. POWELL. 1992. Genetic fingerprinting of Theobroma clones using randomly
amplified polymorphic DNA markers. Theor. Appl. Genet. 83: 871-877. [ Links ]

16. ZAMBRANO, A. Y. 1999. Generación de variabilidad para resistencia a dosis crecientes del herbicida Glifosato
y selección in vitro en cultivo de células en suspensión en tres cultivares de caña de azúcar Saccharum spp.
TesisDoctoral. Maracay, Aragua. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. Ven. 80 p.
[ Links ]

Av. Universidad, vía El Limón, Edificio Gerencia General, INIA. Apartado 2103. Maracay 2105. Aragua-
Venezuela.

agrotrop@inia.gov.ve

ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0002-192X2003000100001 6/6