INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

Curso teórico de
Inmunología

Métodos inmunológicos
6QM2
Monzalvo Meza Laura
Denysse

Junio / 2016
Índice

Métodos inmunológicos

A. Técnicas de precipitación en gel

Inmunodifusión simple (Mancini)………………………………………………………………………………….1

Inmunodifusión doble (Oüchterlony)…………………………………………………………………………….2

Inmunoelectroforesis……………………………………………………………………………………………………3

Inmunoelectroforesis simple…………………………………………………………………………………………4

Inmunoelectroforesis doble…………………………………………………………………………………………..5

Contrainmunoelectroforesis………………………………………………………………………………………….6

B. Aglutinación

Aglutinación directa………………………………………………………………………………………………………7

Aglutinación indirecta o pasiva……………………………………………………………………………………..8

C. Complemento

Fijación del complemento……………………………………………………………………………………………9

D. Neutralización

Nutralización de virus y toxinas……………………………………………………………………………………10

E. Inmunofluorescencia

Por microscopía ………………………………………………………………………………………………………….11

Por citometría de flujo…………………………………………………………………………………………………12

F. Radioinmunoensayo………………………………………………………………………………………..14

G. Técnicas inmunoenzimáticas

ELISA ………….……………………………………………………………………………………………………………….15

Inmunoelectrotransferencia……………………………………………………………………………………….16
Inmunohistoquímica…………………………………………………………………………………………………..17

H. Intradermorreacciones…………………………………………………………………………………..18
I. Transformación blastoide……………………………………………………………………………….19
J. Medición de citocinas…………………………………………………………………………………….20
K. Técnicas de medición de citotoxicidad……………………………………………………………21
 Inmunodifusión simple (Mancini)

Fundamento
FUNDAMENTO USOS
Usos
La inmunodifusión radial (IDR) es una técnica que puede La Inmunodifusión Radial Cuantitativa fue el primer
determinar cuantitativamente la concentración de un procedimiento analítico que permitió cuantificar en
Ventajas
antígeno. Es una técnica sensible que es usada forma sencilla, precisa y exacta la concentración de
Desventajas
clínicamente para detectar niveles de proteínas proteínas especificas en fluidos biológicos.
plasmáticas. Por su simplicidad, rapidez y escaso requerimiento
técnico, continúa hoy siendo el método de referencia y
Un anticuerpo es incorporado en agarosa fundida, la la alternativa de elección en pequeños y medianos
cual es vertida en una superficie inerte y se deja laboratorios.
solidificar. Una vez solidificada, se elaboran pequeños
pozos en la agarosa, y estos son llenados con
concentraciones conocidas de antígeno
correspondientes al anticuerpo, con el objeto de
construir una curva de calibración. Las muestras
desconocidas también se colocan dentro de los pozos al
final de las muestras para la curva de calibración. Los
antígenos en solución difundirán hacia fuera del pozo en
un patrón circular rodeando al pozo. El anticuerpo está
presente en exceso y la difusión del antígeno continuará
hasta que se forme un precipitado antígeno-anticuerpo
en forma de anillo estable. Habrá complejo Ag-Ac en
toda la zona circundante al pozo dentro de la línea de
precipitación. En esta línea es donde está presente el
mayor número de complejos, ya que en ese punto el
antígeno y el anticuerpo están en proporciones iguales.
Esta es conocida como la zona de equivalencia. VENTAJAS
Es un método sencillo de realizar en laboratorio, los
materiales y reactivos que se utilizan son económicos

DESVENTAJAS
El desarrollo de la reacción es muy lento y la sensibilidad
del método es muy baja.
 Inmunodifusión doble (Oüchterlony)

FUNDAMENTO DESVENTAJAS

En este método se forman pozos en el gel de agarosa, 1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean
Fundamento
generalmente en patrón de roseta. Se depositan similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia
antisueros específicos en los pozos centrales y los y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma
Usos
estándares de proteínas y los problemas en los pozos en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero
Ventajas
circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el exceso de Ag.
anticuerpo y el antígeno alcanzan la equivalencia, se
Desventajas 2. Las moléculas más pequeñas migran con más rapidez
forman bandas de precipitados insolubles. La posición y
que las de gran tamaño y conforme la migración
forma de la banda se determinan según la concentración
continúa el precipitado puede redisolverse y volverse a
del antígeno y del anticuerpo, y sus tamaños. La
formar de acuerdo con los cambios de concentración de
distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es
Ag o Ac en el gel.
directamente proporcional a la cantidad de antígeno
presente. 3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antígeno no se
difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el
anillo es más grueso o espeso.

4. La sensibilidad de este método es muy baja

USOS

Identificación de sistemas Ag-Ac múltiples,

establecimiento de la relación inmunológica entre dos
antígenos, realizar estimaciones de la pureza de un
antígeno o anticuerpo. Análisis semicuantitativo de la
concentración de antígeno. Conocimiento del Título
precipitante de un antisuero.

VENTAJAS

Método relativamente rápido, pueden determinarse

varios aspectos inmunológicos a través del método. Es
un método sencillo.
 Inmunoelectroforesis

FUNDAMENTO
Fundamento
La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que
Usos
permite la identificación de diferentes componentes
proteicos a través de arcos de precipitación, que tienen
Ventajas
movilidad electroforética semejante, pero poseen
Desventajas
diferente peso molecular y/o diferentes determinantes
antigénicos.
La inmunoelectroforesis se realiza preferentemente en
geles agarosa y se distinguen dos etapas:

1) la muestra de proteínas se somete a separación

electroforética.
2) terminada la electroforesis, las proteínas son
precipitadas con antisueros poli o monoespecíficos,
aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de VENTAJAS
migración. Luego de un período de difusión en cámara
Permite identificar substancias en mezclas muy
húmeda, se observan arcos de precipitación cuya forma
complejas y en concentraciones muy bajas
y posición dependen de las características
inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.
DESVENTAJAS

Requiere que dichas substancias sean inmunogénicas y

depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es
difícil de estandarizar.

USOS
Diagnóstico de gamopatías monoclonales, mieloma y
macroglobulinemia de Waldeström.
Evaluación de gamopatías monoclonales encontradas
en electroforesis de proteínas séricas, enfermedades
linfoproliferativas (linfomas malignos y otras) y
enfermedades del tejido conectivo en general.
Diagnóstico y caracterización de estados
inmunodeficientes y disgamaglobulinemias.
 Inmunoelectroforesis simple
Fundamento
FUNDAMENTO VENTAJAS
Usos
Consiste en el transporte electroforético de proteínas Es una técnica cuantitativa en la que se puede construir
antigénicas através de una lámina con agarosa, que a su
Ventajas una curva estándar representando altura frente a
vez contiene incorporado un anticuerpo específico concentración de Ag, es un método cuantitativo sencillo
Desventajas
resuspendido, se realiza una serie de posos y en cada y económico.
uno se coloca una muestra a un pH que le proporcione
una carga negativa y se hace pasar una corriente DESVENTAJAS
electrica. Una vez finalizado el corrimiento, en la placa
El antígeno debe migrar hacia el polo positivo en la
se observan dicersas manchas que terminan en forma
electroforesis, por tanto, es conveniente para albúmina,
de estela de cohete; el área que se encuenta por debajo
transferrina y ceruloplasmina, pero para otras proteínas
del área del cohete será la concentración de antígeno. como las inmunoglobulinas es más conveniente la
inmunodifusión radial, entonces es un método poco
sensible y funcional.

USOS

Estudio de elementos de concentración desconocida,

haciendo una curva de calibración y en la misma placa
aplicando las muestras problemas para poder obtener
esta concentración.

Por mencionar un ejemplo se puede determinar la

concentración de albúmina en orina de pacientes con
enfermedades renales.
 Inmunoelectroforesis cruzada
Fundamento
FUNDAMENTO
Usos Inmunoelectroforesis cuantitativa de
También llamada
dos dimensiones,
Ventajas difiere del método de análisis
inmunoelectroforetico en el hecho de que las proteínas,
tras su electroforesis
Desventajas inicial, no se incuba con
anticuerpos. En su lugar, se vuelven a someter a una
segunda electroforesis, esta vez en un gel que además
de buffer y agarosa, contiene los propios anticuerpos
contra la proteína de interés, de forma que es durante
esta segunda operación cuando se forman los
inmunoprecipitados cada precipitado tendrá sus propias
características migratorias, con lo cual, cada banda que
veamos corresponderá a un antígeno diferente, y VENTAJAS
además podremos, según la posición del precipitado,
conocer la cantidad de proteína así como la cantidad de Cada banda corresponde a un Ag diferente además de
anticuerpo específico en el gel. conocer la cantidad de proteínas y Ac especifico
Se puede realizar una relativa cuantificación de los empleado en el gel
componentes. La sensibilidad de este ensayo es similar
al análisis inmunoelectroforético convencional, pero hay DESVENTAJAS
múltiples variaciones de la técnica que la hacen mas útil
según el propósito concreto. El método aunque tiene alta sensibilidad es superado
por otros con mayor sensibilidad, especificidad y menor
costo.

USOS

Este tipo de inmunoelectroforesis ha sido especialmente

usado en estudios de proteínas sericas y extractos
biológicos, en estudios generales.
Contrainmunoelectroforesis

DAMENTO

na inmunodifusión doble acelerada por el paso de

 Fundamento VENTAJAS
Usos Es un método rápido y sensible; la sensibilidad es de
Ventajas 10-20 veces mas que en el método de Mancini.

Desventajas DESVENTAJAS

Es únicamente un método cualitativo, no sirve para

determinar concentraciones de antígenos.

Aglutinación directa

FUNDAMENTO

Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación

de estos aglutinados son los mismos que gobiernan la
formación de un precipitado, la zona de exceso de
 Fundamento
VENTAJAS
Usos
Son pruebas que no requieren de mucho tiempo y
Ventajas además son sencillas de realizar, no requieren equipo
para llevar acabo su lectura por lo que son de fácil
Desventajas interpretación además tienen mayor sensibilidad que las
reacciones de precipitación.

DESVENTAJAS

Presentan una menor sensibilidad que las reacciones de

interacción primaria tales como ELISA e
Inmunofluorescencia indirecta. Esto hace que en
determinados casos se prefiera el empleo de una de
estas 2 técnicas para la detección de Acs contra un
determinado agente patógeno.

Aglutinación indirecta
FUNDAMENTO

Cuando se tiene un Ag soluble, es posible diseñar una

reacción de aglutinación gracias a que es posible utilizar
distintas partículas (partículas inertes o glóbulos rojos) y
 Fundamento VENTAJAS
Usos Son rápidas y sencillas de realizar, no requieren equipo
Ventajas para llevar acabo su lectura por lo que son de fácil
interpretación además tienen mayor sensibilidad que las
Desventajas reacciones de precipitación. En adición es una técnica
muy flexible donde podemos usar cualquier Ag de
interés y acoplarlo a un soporte.

DESVENTAJAS

Presentan una menor sensibilidad que las reacciones de

interacción primaria tales como ELISA e
Inmunofluorescencia indirecta. Esto hace que en
determinados casos se prefiera el empleo de una de
estas 2 técnicas para la detección de Acs contra un
determinado agente patógeno.

Fijación del complemento

FUNDAMENTO

Se basa en la capacidad hemolítica sobre eritrocitos

sensibilizados con anticuerpos específicos (hemolisina).
La reacción entre la cantidad de complemento
 Fundamento En las enfermedades autoinmunes, el C' juega un papel
Usos importante en la lesión a los tejidos y su determinación
puede orientar el diagnóstico, así como ayudar a evaluar
Ventajas el curso y la actividad de la enfermedad.
Desventajas

VENTAJAS

Esta técnica proporciona una visión global de la

funcionalidad del sistema de complemento sin la
necesidad inmediata de determinar cada uno de los
componentes

DESVENTAJAS

Para realizar esta determinación se deben tener

controlados, ya que la magnitud del complemento
depende en gran medida del número de eritrocitos
utilizados, su fragilidad, cantidad y clase de hemolisina,
fuerza iónica del medio de reacción, concentración de
calcio y magnesio, pH, temperatura, tiempo de
incubación, etc. Posee limitaciones, tales como su baja
sensibilidad para detectar disminuciones en el C' sérico

Neutralización de virus y toxinas

FUNDAMENTO

En el caso de los virus y toxinas, se puede medir la

capacidad que un determinado suero tiene para
neutralizar la efectividad del virus o de la toxina sobre
 Fundamento
VENTAJAS
Usos
Son altamente específicas y sensibles, y se consideran
Ventajas las pruebas de referencia para cualquier valoración
serológica. En la neutralización de toxinas es un método
Desventajas
rápido.

DESVENTAJAS

En cuanto a neutralización de virus las pruebas son

laboriosas, requieren de cultivos celulares, esterilidad,
además de ser generalmente más lentas que otras
técnicas.

En cuanto a neutralización de toxinas se corre el riesgo

de presentar la enfermedad del suero, aún cuando se
eliminó la porción inmunogénica de los anticuerpos.

Inmunofluorescencia por microscopía

FUNDAMENTO

La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica

que consiste en conjugar colorantes fluorescentes con
anticuerpos o antígenos, exponiendo después este
 Fundamento USOS
Usos Esta técnica tiene múltiples aplicaciones en diagnóstico
Ventajas e investigación. Se ha utilizado en estudios
bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se ha utilizado
Desventajas en el estudio de la distribución intracelular de las
moléculas.

VENTAJAS

Método Directo: Rápido y sencillo.

Metodo indirecto: Mas sensible. Un mismo Ac

secundario puede reconocer distintos Ac primarios
(generados en la misma especie).

Inmunofluorescencia por citometría de flujo

FUNDAMENTO

La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el

estudio de poblaciones de células de sangre periférica.
Actualmente el análisis de una suspensión de células
 Fundamento USOS
Usos La técnica de inmunofluorescencia se suele utilizar en el
Ventajas estudio de poblaciones de células de sangre periférica.
Actualmente el análisis de una suspensión de células
Desventajas vivas marcadas con un fluorocromo se realiza mediante
un citómetro de flujo.

VENTAJAS

Brinda información acerca del tamaño, la granularidad o

complejidad celular, como así también de la emisión de
fluorescencia en el caso de que la célula haya unido un
anticuerpo marcado con un fluorocromo.

DESVENTAJAS

Debido a las especiales características de los citómetros

de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en
forma de suspensión monodispersa. Hay muestras como
la sangre periférica, médula ósea, u otros fluidos
biológicos, que precisan de un mínimo procesamiento;
en cambio los tumores sólidos o las muestras
parafinadas necesitan de una disgregación más o menos
intensa (mecánica, enzimática, etc.).

Radioinmunoensayo
FUNDAMENTO
La técnica de radioimnunoanálisis (RIA) permite
cuantificar la presencia de pequeñas cantidades de un
determinado Ag o Ac en una muestra biológica. Si bien
USOS
Usos: Se utiliza para detectar y cuantificar sustancias
que se encuentran en cantidades muy pequeñas y
mezcladas con muchas otras.
 Fundamento

Usos

Ventajas

Desventajas

ELISA

FUNDAMENTO

Esta técnica, también se conoce como ensayo de ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La
identificación de los complejos Ag-Ac, se hace mediante
 Fundamento Aunque también existe el ELISA en sándwich, ELISA de
Usos inhibición y ELISA competitiva.

Ventajas USOS

Desventajas La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático

ampliamente empleado en el área médica para la
cuantificación de moléculas especialmente de aquellas
que experimentan cambios en diferentes estados como
pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o
parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes.
Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas,
autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de
patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son
también muy usadas en los ensayos de nuevos
medicamentos para comprobar sus efectos
cuantificando las moléculas de interés en cada caso.
Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo.

VENTAJAS

Especifico y de alta sensibilidad y no requiere de

radioistopos como en el caso de RIA.

DESVENTAJAS

Costoso debido a la necesidad de un lector de este tipo

de reacción.

Inmunoelectrotransferencia

FUNDAMENTO USOS
Es una técnica muy sensible que permite identificar La técnica de Western Blot para determinar la
antígenos y anticuerpos. La técnica de Western Blot se especificidad de los Acs contra Ag del virus de HIV es la
basa en la separación electroforética de proteínas en prueba confirmatoria de elección para los casos en que
 Fundamento

Usos

Ventajas

Desventajas

Inmunohistoquímica
FUNDAMENTO USOS

La inmunohistoquimica es un procedimiento que La inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en

combina técnicas inmunológicas con técnicas identificación de diferenciación y de marcadores
histoquímicaa en la observación de los tejidos, para eso pronósticos de neoplasias (marcadores tumorales).
 Fundamento

Usos

Ventajas

Desventajas

Intradermorreacciones

FUNDAMENTO

Las células que participan en este mecanismo son los

linfocitos T y son los responsables patogénicos de la
dermatitis por contacto y del rechazo a trasplantes. De
 Fundamento USOS
Usos Las pruebas intradérmicas o intradermorreacciones se
Ventajas han utilizado durante muchos años para valorar diversas
funciones cutáneas, para el diagnóstico de algunas
Desventajas enfermedades en las que la piel se encuentra afectada,
para tratamiento de procesos alérgicos y principalmente
para determinar la hipersensibilidad inmediata o
retardada. La hipersensibilidad retardada (HSR) se
refiere a la respuesta inmunitaria de tipo celular. Ésta
depende de linfocitos T CD4+ funcionales, por lo que
estas pruebas se usan para evaluar la inmunidad celular
en pacientes en quienes se sospecha cursan con una
infección, en inmunodeficiencias o en valoraciones
pretrasplante o pretratamiento con agentes biológicos.

VENTAJAS

Pruebas de bajo costo, detecta fácilmente algún

contacto con un organismo patógeno. Son pruebas
fáciles de aplicar

DESVENTAJAS

Su principal limitación es que una reacción positiva no

necesariamente significa que los síntomas son debidos a
una reacción mediada por Lc T, debido a que sujetos
libres de síntomas también puedentener IgE alergeno-
específica. Incluso familiares directos asintomáticos de
individuos alérgicos tienen mayor número de pruebas
positivas que la población general. Ello obliga a una
Transformación blastoide cuidadosa interpretación de las mismas y siempre
correlacionarlas con la clínica. Pueden existir reacciones
cruzadas.
FUNDAMENTO

Los linfocitos experimentan importantes

transformaciones específicas tanto in vitro como in vivo.
El estudio de las transformaciones in vitro ha permitido
 Fundamento
USOS
Usos
Se ha empleado la transformación blástica inducida para
Ventajas estudiar la competencia de los linfocitos y la respuesta
inmune en una serie de enfermedades metabólicas
Desventajas hereditarias mediante cultivos y proliferación de
linfocitos. Asi Como en la capacidad de respuesta
inmunológica y proporción en el individuo de linfocitos.

VENTAJAS

Puede hacerse un estudio in vitro para demostrar el

funcionamiento de los linfocitos ante diversos estímulos
y correlacionando lo obtenido in vitro con lo que sucede
in vivo conocer el estado funcional de los linfocitos.

DESVENTAJAS

Aunque es un método que puede representar el

funcionamiento de los linfocitos in vivo hay muchos
factores que no pueden controlarse que afectan el
funcionamiento de las células in vitro como el efecto de
reguladoras celulares, citocinas y otras células que
participan en la activación natural.

Medición de citocinas

FUNDAMENTO

Las citocinas, son un grupo de glucoproteínas solubles

de bajo peso molecular, responsables de la
comunicación intercelular y que a través de la activación
Fundamento USOS
Usos Debido a su importancia como mediadoras de la
Ventajas respuesta inmune, su determinación es esencial para
realizar el correcto diagnóstico de diversas
Desventajas enfermedades y infecciones como por ejemplo
patologías renales donde se determinan las
Interleucinas 6 y 8 que están presentes durante una
infección urinaria o bien para detección temprana de
riesgo de rechazo en un trasplante por tan solo citar
algunos ejemplos.

VENTAJAS

Existe una gran variedad de metodologías para

determinar las sustancias en estudio

DESVENTAJAS

En cuanto a las técnicas genéticas sunque son buenas

técnicas para detectar pequeños cambios en la
expresión de genes, es muysensible a la degradación de
la muestra por parte de RNAsas generadas por
contaminación ambiental.

Medición de citotoxicidad
 Fundamento
DAMENTO VENTAJAS
tividadUsos
citotóxica de los linfocitos T CD8+ y células Es un método sensible y exacto por el marcaje de
ente a Ventajas
una célula blanco (diana) se puede estudiar, células, además es un método cuantitativo muy
endo la capacidad citocida, que las células específico.
cionadasDesventajas
tienen para destruir un determinado
DESVENTAJAS
ero de células diana, al estar ambas poblaciones en
acto. Se puede medir mediante el marcaje de las Utilización de elementos radiactivos para el marcaje de
as diana con Cr51, posteriormente se ponen en las células, lo que puede resultar n daños a la salud para
acto con un número conocido de linfocitos T el personal que realiza la técnica, aun cuando sea a argo
óxicos o células NK y después de un tiempo de plazo.
bación se mide el cromo libre, el cual es liberado
ués de la muerte de la célula diana marcada por
a de las células citotóxicas.

determinar en un paciente la funcionalidad de las

as citotóxicas como son los linfocitos T y las células
rente a diversas infecciones a las que pueda
entarse.

rminar también la capacidad de la toxicidad para

nar agentes antigénicos en el organismo.