Práctica 2: ¨extracción de ADN¨

Objetivos:

 Que el estudiante consiga extraer el ADN de un producto natural

 Que el estudiante explique porque es necesario el rompimiento de la pared celular
y membranas celulares para la obtención de ADN
Competencia específica a desarrollar:

 Identifica el lugar que ocupa los ácidos nucleicos dentro de una célula eucariota.
 Analiza y reflexiona el uso de las sustancias utilizadas para la obtención del ADN
 Muestra disposición e interés para trabajar con responsabilidad.
Introducción:
Los ácidos nucleicos desempeñan varias funciones en los organismos. Los
componentes de bajo peso molecular de los ácidos nucleicos son ampliamente
utilizados en las reacciones metabólicas. Cuando forman complejos con proteínas
ciertos ácidos nucleicos de alto peso molecular proporcionan estructura algunos
incluso son catalíticos.
El ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico (en inglés DNA). Es una
macromolécula que actúa en el almacenamiento y en la transferencia de la
información genética.
Es un componente principal de la célula. Aunque los ácidos nucleicos reciben esta
denominación porque el ADN fue aislado por primera vez del núcleo celular, tanto el
ADN como el ARN (ácido ribonucleico) se encuentran, también en otras partes de las
células. La unidad monomérica de una molécula de ácido nucleico es un residuo de
nucleótido.
El azúcar es ribosa o desoxirribosa y divide a los ácidos nucleicos en dos grupos
principales. El ácido ribonucleico (ARN) tiene como azúcar a la D-ribosa en la
configuración furanosa, mientras que el ácido desoxirribonucleico (ADN) tiene el
azúcar D-2-desoxirribosa en la configuración furanosa.
Todas las células tienen la capacidad de auto duplicarse: las moléculas en las que se
almacena esta propiedad son el ADN y el ARN. La importancia del ADN en la
reproducción y el crecimiento de las células residen en la información contenida en los
genes. Las moléculas de ADN son polímeros de unidades, llamadas nucleótidos,
constituidos por un azúcar, un fosfato y una base nitrogenada de cuatro tipos
diferentes.
La información genética es el conjunto de datos que determina la estructura y
propiedades funcionales en las células. La información genética es almacenada en el
núcleo de las eucariotas en estructuras llamadas cromosoma. En el caso de los
procariotas, el cromosoma se encuentra disperso en el citosol. El núcleo es un
orgánulo separado del citoplasma por la membrana nuclear, que, de hecho, es una
doble membrana que presenta poros, a través de los cuales las macromoléculas
pueden intercambiarse entre el citoplasma y el núcleo. La membrana nuclear, además
participa directamente en la duplicación de ADN y permite la comunicación directa del
núcleo con el medio que lo rodea. La mayoría del material nuclear esta formado por
núcleo-proteínas cuyo principal componente es el ácido desoxirribonucleico (ADN).
Las moléculas de ADN son polinucleótidas, o sea, cadenas compuestas de
mononucleótidos en las que la parte externa de la estructura esta constituida por los
esqueletos de desoxirribosa fosfato unidos entre si por enlaces fosfodiéster, de tal
manera que el grupo 5-fosfato unidos de la desoxirribosa de un nucleótido esta
esterificado con el grupo 3-OH de la desoxirribosa del nucleótido vecino. Las moléculas
de ADN contienen 2 tipos de bases nitrogenadas, dos bases pirimidicas (timina T y
atosina C) y dos bases púricas (Adenina A y guanina G). Estas bases se unen en el C 1 de
la desoxirribosa y en N1 de las pirimidinas o en el N o de las purinas por enlaces N-
glucosídicos. La secuencia de bases es altamente específica para cada molécula de
ADN.
La extracción de ADN en células eucariotas requiere romper la pared celular y
emulsificar los lípidos y proteínas de la célula, impidiendo las interacciones polares
que mantienen integra a la membrana, para posteriormente acceder al núcleo de la
célula y romper su membrana que dejara libre el ADN. Para proteger el ADN de
enzimas o agentes externos que puedas degradarlo debemos utilizar enzimas
proteolíticas contenidas en el jugo de piña natural.
El alcohol separa el ADN de otros componentes celulares los cuales son dejados en la
fase acuosa.
Material y equipo necesarios:

 Muestra vegetal (cebolla grande y fresca) *

 Piseta de agua destilada
 Sal de mesa o NaCl
 Detergente liquido Vel o champú *
 Etanol (70%-99%) a 0 oC
 Cuchillo (para cortar cebolla) *
 Bolsa de hielo*
 Baño maría (60 oC)
 Parrilla de calentamiento
  Licuadora*
 2 vasos de precipitado de 500 ml
 Jugo de piña natural (aproximadamente 20 ml) *
 Varilla de vidrio
 2 matraz Erlenmeyer de 250 ml
 Palillo de madera (para brochetas)*
 Papel filtro de café *
 Tubo de ensayo de 20 ml
 Embudo de vidrio grande
 Vaso de precipitado de 100 ml
 Charola para agregar agua con hielo
 2 pipetas de 10 ml
 Probeta de 100 ml
 Pipeta Pasteur o gotero
 Microscopio electrónico
 Azul de metileno
 Porta objetos
 Cubre objetos
NOTA: todo lo que tiene * lo traerá el alumno por equipo.
Metodología:
NOTA: la presencia de ADN en la muestra se puede comprobar utilizando un reactivo de
Dische (que contiene difenilamina) que es un indicador de la presencia de ADN, se calienta
1 mililitro de muestra en 3 ml de reactivo por 40 minutos, en un tubo de ensayo tapado
con algodón; inmediatamente se transferirá el tubo a un baño de agua fría. Comprobando
la presencia de ADN por la formación de un complejo coloreado azul.
Para iniciar la extracción del ADN (en este caso usando células eucariotas) se debe
preparar el tampón o solución amortiguadora de la siguiente manera: Agregar 50 ml de
detergente en un vaso de precipitado de 500 ml. Preparar una solución de NaCl en un
matraz de Erlenmeyer de 250 ml (7.5 gr de NaCl y 100 ml de agua destilada). agregar la
solución de cloruro de sodio al detergente y mezclar suavemente procurando no formar
espuma; completar con agua destilada hasta alcanzar un volumen de 500 ml y prosiga con
los siguientes pasos:
1. Corte la cebolla en tiras. Coloque las tiras en un vaso de precipitado de 500 ml.
2. Cubra la cebolla con 100 ml de solución amortiguadora. Esta solución solubilizará las
membranas nucleares y facilitará la liberación de los ácidos nucleicos del núcleo de la
célula.
3. Coloque el vaso de precipitado, que contiene la cebolla y la solución amortiguadora,
dentro de un baño de agua a 60°C por 15 minutos (revolviendo constantemente,
mediante una varilla de vidrio).
4. Inmediatamente transcurridos los 15 minutos en el baño de agua caliente, transfiera el
vaso de precipitado a un baño de hielo por 5 minutos (manteniendo agitación constante).
5. Licuar la mezcla (cebolla / sol. amortiguadora) 1 minuto a baja velocidad. Esta
trituración mecánica producirá la rotura de las células de los ojos tejidos u órganos de la
muestra y la liberación de contenido celular, donde se encuentran los ácidos nucleicos.
6. Filtrar el licuado de cebolla mediante papel filtro de café (teniendo cuidado de
mantener el recipiente, que recibirá el filtrado, en un contenedor con agua helada). La
filtración, se usará para separar y eliminar las estructuras celulares de mayor tamaño.
7. Tomar un tubo de ensayo de capacidad de 20 ml y añadir en el 6 ml del filtrado y 3.5 ml
de jugo de piña. Tapar el tubo con el pulgar y voltear el tubo una sola vez para que se
mezclen.
8. Añadir 9 ml de etanol frío lentamente (inclinando ligeramente el tubo y permitiendo
que el alcohol se deslice por las paredes del tubo). El alcohol produce la deshidratación y
total precipitación de ácidos nucleicos insolubles en alcohol frío; además de separar del
ADN otros componentes que serán dejados en la fase acuosa.
9. Dejar de reposar el tubo en un matraz de Erlenmeyer de 250 ml con agua helada por 15
minutos (el ADN no es soluble en etanol frío).
10.Se observará que los ácidos nucleicos se sitúan y visualizan en la interfase agua-alcohol
con apariencia de mucosidad densa y blancuzca (ese es el ADN).
11. Utilice el palillo de madera o la varilla de vidrio limpia y seca para enrollar el ADN que
obtuvimos y observar en el microscopio.
Observación al microscopio.
La muestra de los ácidos nucleicos se sitúa en un portaobjetos y agregue una gota de azul
de metileno, cubrir con el cubreobjetos y observe al microscopio electrónico.
Reporte del alumno
Conteste el siguiente cuestionario.
1.- ¿Cuál es el componente de las membranas celulares?
2.- ¿Estructuralmente las células vegetales y animales en qué se diferencian?
3.- ¿Cuál de los dos tipos de células (vegetal y animal) tiene mayor resistencia para extraer
el ADN?
4.- El jugo de piña natural, ¿qué tipo de enzima contiene?
5.- ¿Qué es una enzima proteolítica?
6.- ¿Dónde quedan los lípidos y proteínas en la capa acuosa o en la capa superior (el
alcohol)?
7.- ¿Qué entiende por “emulsificar” lípidos y proteínas de la célula?
8.- ¿Usted cree que las células de la cebolla contienen cromosomas? Si o no, y ¿cuál es la
cantidad de ellos?
9.- La membrana nuclear ¿Está formada de una membrana sencilla o doble?
10.- ¿Cuál es el diámetro de los poros que presenta la membrana nuclear?
Sugerencias didácticas:

 Discutir en grupos de trabajo para intercambiar ideas que analicen conceptos y

definiciones.
 Realizar reporte de la práctica.
 Discutir la practica realizada.
Reporte del alumno:

 La entrega será en equipo

 Este reporte se entregará una semana después de haberse efectuado dicha
práctica.
Bibliografía:
Eric E. Conn, Stumpf Paul K., Bruening George, Doi Roy H. Bioquímica Fundamental,
Cuarta edición. Editorial Limusa, S.A. de C.V. Grupo Noriega Editores 1996, impreso.