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Ivette Espinosa Castaño 1 *, Michel Báez Arias 1 , Rosa Elena Hernández Fillor 1 ,
Yanet López Dorta 1 , Evelyn Lobo Rivero 1 , Belkis Corona-González 1
Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10, CP 32 700, San José de las Lajas,
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Mayabeque, Cuba.
RESUMEN: La resistencia antimicrobiana (RAM) constituye una crisis global con impacto en la
salud humana y animal. El consumo de antibióticos en la crianza animal, también propicia la selección
y propagación de cepas y sus determinantes de resistencia al ambiente y en la cadena de producción de
alimentos. Una de las iniciativas estratégicas para la contención de la RAM, es asegurar el uso
apropiado de los antibióticos disponibles, en lo cual, los laboratorios de microbiología tienen un
importante papel, a través del diagnóstico y las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. La presente
revisión tiene como objetivo proporcionar información sobre las pautas, dificultades y los desafíos en
la interpretación de datos derivados de las pruebas de laboratorio para la identificación de bacterias, su
tipificación y la estimación del perfil de susceptibilidad a los antibióticos. También se describen
enfoques para la distinción entre bacterias patógenas, comensales e indicadoras a considerar en los
planes de vigilancia y monitoreo de la RAM. En la crianza de los animales suelen aparecer cepas
zoonóticas o indicadoras de multirresistencia, que son prioridad en programas de vigilancia, bajo el
concepto Una Salud, por presentar resistencia adquirida con ventaja para su diseminación. Ejemplos
alarmantes en los últimos años son Escherichia coli productora de betalactamasas de espectro
extendido (E. coli BLEE) y Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM). Además, se diserta
sobre las expresiones transitorias de resistencia microbiana, las biopelículas y células persistentes, que
explican las recidivas de infecciones y aún son poco consideradas en la medicina veterinaria.
Finalmente, se enfatiza en la necesidad de estrategias para armonizar y divulgar datos que soporten
guías para el tratamiento de infecciones bacterianas de interés veterinario.
Palabras clave: resistencia antimicrobiana, animales, pruebas de susceptibilidad antimicrobiana,
diagnóstico.
ABSTRACT: Antimicrobial resistance (AMR) constitutes a global crisis with an impact on human
and animal health. The consumption of antibiotics in animal husbandry also encourages the selection
and propagation of strains and their determinants of resistance to the environment and in the food
production chain. One of the strategic initiatives for the contention of AMR is to ensure the
appropriate use of available antibiotics, in which microbiology laboratories play an important role,
through diagnosis and microbial susceptibility testing. The purpose of this review is to provide
information on patterns, difficulties and challenges in interpreting data derived from laboratory tests to
allow the identification of bacteria, their typing and the estimation of the antibiotic susceptibility
profile. Methodological approaches for the distinction between pathogenic, commensal and indicator
bacteria to be considered in the AMR surveillance and monitoring plans are also described. In the
breeding of animals, strains of zoonotic bacteria or multiresistance indicators usually appear, which
are a priority in surveillance programs, under the concept of One health, for presenting acquired
resistance with an advantage for their dissemination. Alarming examples in recent years are extended
spectrum betalactamases producing Escherichia coli (E. coli ESBL) and methicillin resistant
Staphylococcus aureus (MRSA). It also discusses the transient expressions of microbial resistance,
biofilms and persistent cells, which explain the recurrence of infections and are still poorly considered
in veterinary medicine. Finally, the need for strategies to harmonize and disseminate data that support
guidelines for the treatment of bacterial infections of veterinary interest is emphasized.
Key words: Antimicrobial resistance, animals, antimicrobial susceptibility tests, diagnosis.
_______________________________
*Autor para la correspondencia: Ivette Espinosa Castaño. E-mail: espinosa@censa.du.cu
Recibido: 28/09/2019
Aceptado: 15/11/2019
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órganos, donde ocurren con mayor frecuencia infecciones bacterianas y son la base de los AST
infecciones que precisan un uso de antibióticos (de sus siglas en inglés Antimicrobial
para su control (14,15). Por tanto, aunque en la susceptibility test), tanto en salud humana y
actualidad existen diferentes metodologías para animal (13). Estos métodos resultan laboriosos y
abordar el diagnóstico, aún existen brechas que requieren un tiempo nunca inferior a 48 horas,
dificultan su alcance, los siguientes párrafos incluso algunas especies precisan de tiempos
hacen referencia a los desafíos que aún existen. prolongados para lograr su multiplicación. En el
Un área válida para iniciar algoritmos de afán de superar estas limitaciones, desde entonces
diagnóstico es potenciar las investigaciones se han introducido diversas alternativas que, de
futuras en los biomarcadores, se trata de forma directa o indirecta, determinan la
moléculas primarias indicadoras de procesos naturaleza bacteriana de un proceso clínico. Las
biológicos y estados patológicos que se generan reacciones antígeno-anticuerpo
en el organismo ante el daño a los tejidos a partir (inmunodiagnóstico), la detección de ácidos
de múltiples condiciones clínicas, como las nucleicos y su secuenciación, así como la
infecciones. Muchos de estos biomarcadores se espectrometría de masa y en los años más
detectan en el suero, orina, heces fecales y fluido recientes la nanotecnología, constituyen las
cerebroespinal. Desde hace dos décadas estas principales opciones (21).
moléculas son motivo de investigación Ciertamente, el inmunodiagnóstico es de gran
exhaustiva en la salud humana, con la perspectiva utilidad fundamentalmente en el pesquisaje
de su utilización como soporte temprano al masivo de animales, su formato de uso más
diagnóstico, parecen ser de gran utilidad para amplio se basa en la detección indirecta de una
discriminar procesos inflamatorios, sepsis severas infección bacteriana a partir de los anticuerpos
e indicar la posible etiología viral o bacteriana, al inducidos en la respuesta humoral frente algunos
aparecer los primeros signos. Las principales géneros bacterianos como Brucellas, Leptospira,
investigaciones se han focalizado en la Mycobacterium y especies del orden Ricketsiales
procalcitonina (PCT) y la proteína C-reactiva (22,23,24,25). Sin embargo, la detección de
(CRP), determinar su dinámica de expresión, la anticuerpos en animales infectados por patógenos
concentración que alcanzan en fluidos corporales que afectan las mucosas no suele ser exitosa
acorde a infecciones virales o bacterianas. Estos debido a la alta homología que comparten las
factores podrían incluso monitorear, una terapia proteínas de superficie de muchos géneros y
con antibióticos (16,17,18). especies que agrupan cepas comensales y
En la salud animal las investigaciones sobre patógenas que colonizan estos tejidos, por la que
biomarcadores son limitadas, se han informado las infecciones por estas bacterias precisan de
resultados experimentales en perros y cerdos para métodos que permitan detectar directamente su
proteínas en fase aguda, específicamente los presencia y discriminar entre las cepas.
componentes del suero amiloide y haptoglobulina La reacción en cadena de la polimerasa PCR
(19,20). Pero muchos biomarcadores conocidos (de sus siglas en inglés Polymerase Chain
no son patognomónicos de las enfermedades, por Reaction) permite la confirmación de la mayoría
eso constituye un reto la búsqueda de nuevas de las especies microbianas que afectan la salud
moléculas con valor para el soporte del animal, a partir de genes conservados como el
diagnóstico preciso y sensible. ARNr 16S. Hoy se conocen secuencias
Una vez que el diagnóstico presuntivo, acorde específicas para discernir entre especies
a la anamnesis de un proceso clínico, orienta la bacterianas incluso muy cercanas. Mediante PCR
posible etiología bacteriana de una infección, la es posible detectar directamente en la muestra,
identificación se apoya en la experticia del con inmediatez la presencia de una especie
microbiólogo para la elección de la batería de bacteriana, sin necesidad del cultivo y en
pruebas, acorde a su fiabilidad (13). El cultivo ocasiones identificar más de un patógeno en una
microbiológico y la microscopía, iniciados en el misma reacción (PCR múltiplex). Sin embargo,
siglo XIX por Pasteur y Koch, aún desempeñan algunas limitaciones son los procedimientos para
un papel principal en la identificación de la extracción de ADN en la muestra clínica que
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genotípicos que se basan en tres categorías ser sinérgicas, por tanto, también promueven la
generales de procedimientos de biología evolución de la resistencia a los antibióticos, o
molecular: la electroforesis, la amplificación y la son antagonistas impidiendo el desarrollo de
secuenciación de ácidos nucleicos. La resistencia (35). Estos efectos se explican por la
electroforesis en campo pulsátil PFGE (de sus modulación de la respuesta inmune en presencia
siglas en inglés pulsed field gel electrophoresis) y de un agente primario o la disponibilidad de
el análisis de secuencias multilocus, MLST (de nutrientes, proteínas, receptores de membrana
sus siglas en inglés Multilocus Sequence Typing), basal para los patógenos oportunistas (34). El
son las de mayor uso en los últimos años para efecto de la coinfección aún recibe un escrutinio
abordar la epidemiología molecular en bacterias. limitado en la salud animal y son escasos los
La PFGE se basa en la digestión del genoma datos disponibles sobre este tema.
bacteriano con enzimas específicas que dan lugar Por lo general, los procesos respiratorios,
a fragmentos visualizados por sus tamaños en entéricos y reproductivos que requieren un mayor
geles de agarosa; mientras, el MLST se basa en la empleo de antibióticos son provocadas por virus,
selección de genes conocidos como housekeeping bacterias y en ocasiones en coinfecciones; de ahí
por realizar funciones metabólicas y conservadas la necesidad de contar con herramientas precisas
en la célula bacteriana. La amplificación y la de diagnóstico. En un estudio sobre el
secuenciación de fragmentos de 500-700 pares de tratamiento antimicrobiano de cerdos de cría
base contenidos en estos genes, la consideración coinfectados por virus del síndrome reproductivo
de cada secuencia nueva obtenida como un alelo y respiratorio porcino, PRRSV (de sus siglas en
para dicho gen, así como su comparación con inglés Porcine reproductive and respiratory
ciertos alelos (cuyas secuencias se encuentran síndrome virus) y Streptococcus suis, la
depositadas en el sitio web http://www.mlst.net) penicilina y la ampicilina usualmente efectivas
permiten obtener un perfil de secuencias tipos no lograron minimizar la enfermedad en
(ST), comparable a nivel local y global (32,33). presencia de PRRSV, solo la administración de
Sin embargo, se percibe que las tecnologías de ceftiofur fue adecuada para tratar cerdos de cría
secuenciación masiva NGS (de sus siglas en coinfectados (36).
inglés Next Generation Sequence), la Un estudio realizado por Pomorska-Mól et al.
secuenciación de genomas completo, WGS (de (18), evidenció la dinámica de aparición de
sus siglas en inglés Whole Genome Sequencing) biomarcadores, en presencia de co-infecciones.
y la metanogenómica revolucionarán la La dinámica en fase aguda de la expresión de la
microbiología clínica y la epidemiología proteína C reactiva, amyloide A y Haptoglobina
molecular. Estas técnicas permiten el tipaje al en el suero de cerdos co-infectados por el virus
nivel de cepa o clon, con un procesamiento de Influenza porcina H1N1 y la bacteria Pasteurella
alto flujo, hoy se utilizan en investigaciones multocida, las proteínas comenzaron a aparecer
académicas y en el manejo de algunos brotes. El entre el segundo y séptimo día posinfección,
gran reto de estas tecnologías es alcanzar mucho antes de la aparición de anticuerpos a
estándares clínicos a partir de la armonización y ambos agentes microbianos. Estos resultados
validación de los procedimientos, así como de los señalan la necesidad de realizar investigaciones
programas bioinformáticos amigables para el en la búsqueda de algoritmos para biomarcadores
análisis de datos (34). en presencia de coinfecciones en la salud animal.
Otro aspecto de importancia al considerar el En los párrafos anteriores se comentó sobre la
diagnóstico microbiológico es su valoración amplia disponibilidad de metodologías que
como monoinfección o simples patógenos, existen para identificar una especie bacteriana y
cuando a menudo los procesos clínicos abordar su tipaje, sin embargo, aún existen
transcurren como coinfecciones entre diferentes brechas en su análisis como coinfecciones y su
microorganismos. Estas coinfecciones tienen un relación con la expresión de biomarcadores.
efecto fundamental y alteran el curso y la También es un reto, garantizar la viabilidad de las
gravedad de las diferentes enfermedades. Las bacterias, impedir el sobrecrecimiento de cepas
interacciones de patógenos coinfectantes pueden comensales para lograr el aislamiento por cultivo
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forma mucho más eficaz que la ocurrida a través fisiológicamente activas o que interfieren con los
de millones de años y por consiguiente la procesos celulares activos, como la síntesis
selección y propagación de cepas macromolecular, son ineficaces en las células
multirresistentes (50). persistentes debido a su inactividad metabólica
reducida. Dichas células podrían volver a un
RESISTENCIA TRANSITORIA estado de crecimiento cuando cesa el tratamiento.
Ambas expresiones (biopelículas y células
En las bacterias existen otras manifestaciones
persistentes) desempeñan un importante un papel
de resistencia denominadas transitorias,
en las recidivas de muchas infecciones (53,54).
fenotípicas o reversibles; que se vinculan al
estado fisiológico de las células cuando se PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD
enfrentan a diferentes estreses; pueden consistir ANTIMICROBIANA
en la producción de biopelículas o células
persistentes y no se deben a la adquisición de un Los AST predicen el éxito de un tratamiento
mecanismo genético como se explicó en la salud humana y animal. Aunque se han
anteriormente. Por lo general, cuando las descrito fracasos en estas predicciones, pues se
bacterias producen estas formas de resistencia basan en metodologías estandarizadas in vitro
transitoria son cepas que en las pruebas que no logran simular todas las circunstancias
convencionales en el laboratorio como los clínicas que ocurren in vivo. Existen
antibiogramas fueron sensibles a los fármacos. La metodologías fenotípicas y genotípicas para la
población bacteriana trata de asegurar la realización de estas pruebas. Los métodos
sobrevivencia en presencia de condiciones de fenotípicos para testar la susceptibilidad
estrés; para esto, una subpoblación sobrevive al microbiana se clasifican en tres categorías 1)
antibiótico, aun cuando pertenece a una difusión 2) mínima concentración inhibitoria
población bacteriana clonal que en su mayoría MIC (de sus siglas en inglés Minimal Inhibitory
resulta sensible (52). Aunque lo anterior se define Concentration) y 3) procedimientos que
como resistencia fenotípica, el número de genes combinan la dilución y difusión (específicamente
que soportan este comportamiento es superior al método E-Test) (57).
que podría soportar la resistencia, si la célula El método de agar difusión (AD), Kirby-Bauer
evoluciona a través de elementos específicos o antibiograma es la prueba más utilizada,
genéticos para contrarrestar el efecto del fármaco aparentemente tiene poca complejidad, pero es
(53,54,55). esencial asegurar la concentración del inóculo.
Las células formadoras de biopelículas se Para este propósito, algunos laboratorios utilizan
adhieren a superficies bióticas o no, conforman la comparación con la escala 0.5 McFarland;
una matriz en la que se crea un gradiente de otros emplean dispositivos fotométricos (57). La
nutrientes y oxigeno que establece diferentes colocación de los discos requiere ciertas
estados metabólicos en las células atendiendo a precauciones, incluyendo su conservación en
su profundidad dentro de la matriz, de esta refrigeración y el número de ellos a utilizar según
manera disminuye la difusión de los antibióticos, el tamaño de las placas petri (58). El método que
permitiendo la sobrevivencia en estas se basa en la determinación de la MIC consiste en
condiciones de parte de la población celular. La el testaje de la actividad antibacteriana del
estructura de las biopelículas propicia los eventos fármaco a partir de un rango de diluciones
de THG (53,56). seriadas dobles (log2) (ej, 4, 8, 16 mg/mL, y así
Las células persistentes representan una
continuamente) y se enfrenta a una concentración
pequeña subpoblación que pasan
del inóculo bacteriano equivalente en este ensayo
espontáneamente a un estado latente, no
a 1x105ufc/mL. La dilución del fármaco más baja
divisorio, por lo que son tolerantes a altas dosis
de antibióticos bactericidas, alcanzando este que inhibe el crecimiento visible del
estado sin sufrir cambios genéticos. Por tanto, los microorganismo se designa como MIC
antibióticos que actúan sobre células bacterianas (59,60,61). La siembra de estos cultivos en un
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medio específico, permite además conocer la armonizados, según cada especie de bacteria y
mínima concentración bactericida. antibióticos en cuestión (60,61).
Las pautas para la armonización de los AST y VetCAST inició la consideración adicional de
los puntos de cortes para su interpretación se puntos de cortes epidemiológicos, ECOFF (de
establecen a nivel mundial por el Instituto de sus siglas en inglés Epidemiological cut off). Los
Estándares Clínicos y de Laboratorios CLSI (de ECOFF son valores de MIC que separan las
sus siglas en inglés Clinical Laboratory poblaciones bacterianas de una misma especie en
Standards Institute), una organización de Estados dos grupos, cepas salvajes y no salvajes, basado
Unidos de América, no gubernamental y en presencia o ausencia de mecanismo de
reconocida internacionalmente. El Comité resistencia fenotípico detectable, según los
Europeo para testaje de susceptibilidad valores de MIC. Por tanto, los ECOFF se basan
antimicrobiana EUCAST (de sus siglas en inglés en información in vitro únicamente, todas las
European Committee on Antimicrobial cepas que presentan valores de MIC por encima
Susceptibility Testing) contribuye también a los de los ECOFF son consideradas resistentes desde
datos para la armonización internacional. El un punto de vista ecológico. Estos datos alertan
CLSI es representado por médicos, agencias sobre la emergencia o la evolución de cepas no
regulatorias, industria farmacéutica, mientras salvajes (61).
EUCAST por comités nacionales europeos. El Los párrafos anteriores se refieren a los
CLSI requiere pago para el acceso a algunos de criterios para la interpretación de los resultados
sus documentos, mientras para EUCAST el del laboratorio a partir de los AST. Sin embargo,
acceso es libre. Ambas organizaciones cuentan los regímenes efectivos de tratamiento
con un subcomité para el ámbito veterinario, en antimicrobiano para las infecciones bacterianas
CLSI el subcomité veterinario VAST, mientras son fundamentales para lograr el efecto
EUCAST VetCAST (de sus siglas en inglés terapéutico y minimizar el desarrollo de
Veterinary Committee on AST) (61). En 1997, resistencia antimicrobiana bacteriana. Para
considerando la creciente importancia de RAM a diseñar las dosis y los esquemas de tratamiento,
nivel mundial, la OIE decidió desarrollar un se requiere conocer la farmacocinética (PK) y
conjunto completo de normas relacionadas a los farmacodinamia (PD) del antimicrobiano y
programas de vigilancia de resistencia. Estas establecer los modelos de interacción PK/PD.
normas son contenidas en el Capítulo 6.7 Desde el comienzo de la era antibiótica, la MIC
Armonización de los antimicrobianos nacionales. es el principal parámetro de la PD sobre el cual
Programas de vigilancia y monitoreo de se basan estos diseños; se refiere a la interacción
resistencia OIE (62). entre la concentración del fármaco en el foco
Los criterios de interpretación de los AST son infeccioso y la MIC del patógeno. Mientras que
la expresión de los puntos de corte clínico (PCC), la farmacocinética determina los niveles
los valores de MIC expresados en µg/mL o sus alcanzados por el fármaco en varios fluidos
subrogados en diámetros de halos de inhibición corporales y tejidos para varias infecciones. Otros
expresados en mm. Estos PCC se seleccionan por ensayos, como las curvas de letalidad y la
los subcomités ad hoc para ser utilizados por los evaluación del efecto posantibiótico, se adicionan
laboratorios y establecer las categorías de a las pruebas de laboratorio e intentan adicionar
sensible (S), intermedio (I) y resistente (R) para información de la farmacodinamia al simular las
la cepa en cuestión. Los PC se definen y variaciones en las concentraciones del fármaco
actualizan anualmente para cada antibiótico a en el tiempo, que pueden ocurrir en el hospedero.
utilizar en cada especie animal y según los Ciertamente, los modelos PK/PD para diversos
patógenos bacterianos de relevancia. Cada país, agentes antimicrobianos a usar en diferentes
al elaborar su plan para la contención de la RAM, especies animales y contra patógenos específicos
debe establecer pautas acordes al CLSI o son limitados (62).
EUCAST para la ejecución, lectura e Los datos sobre la toma de decisiones de los
interpretación de los AST y garantizar resultados veterinarios europeos, al elegir antibióticos para
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recetar, demostraron que los AST generalmente las instituciones para aprovechar la información
se realizaron después del fracaso del tratamiento acumulada y orientar la optimización de las
empírico elegido (64,65). Una tendencia en los terapias, promover la adecuada selección,
últimos años consiste en la armonización de las dosificación, ruta de administración y duración
pautas para fortalecer el valor de los datos de los mismos. Los equipos de los PROA
acumulados en el tiempo. Los datos de implementan estrategias como la auditoría
susceptibilidad acumulada cAST (de sus siglas en prospectiva, la restricción en el formulario,
inglés Cumulative Antimicrobial Susceptibility prescripción pre-autorizada, algoritmos de terapia
Test) son de gran valor para implementar terapias empírica, uso de programas informáticos que
empíricas, cuando los resultados del diagnóstico apoyan la decisión terapéutica y la combinación
por cultivo u otra metodología no son de tecnologías que favorecen el diagnóstico
disponibles, fundamentalmente en países en vías rápido en los laboratorios de microbiología (69).
de desarrollo. Muchos laboratorios realizan el Los resultados de los PROA pueden ser una
testaje de la susceptibilidad bacteriana en cepas motivación para su aprovechamiento en el sector
de origen animal asociadas a procesos clínicos, veterinario.
sin embargo, a menudo los criterios para generar Las metodologías clásicas para el testaje de la
estos reportes son inconsistentes (63,65,66). susceptibilidad microbiana se basan en el
El CLSI establece para los laboratorios de crecimiento plantónico de la bacteria. Sin
salud humana pautas para el manejo de los datos embargo, las mencionadas formas de resistencia
de cAST, por ejemplo, solo se consideran fenotípica o transitoria (biopelículas o células
aislados derivados del diagnóstico y se excluyen persistentes), no se consideran en la práctica in
aquellos derivados de la vigilancia de individuos vitro para evaluar el éxito de un antibiótico. Las
sin síntomas clínicos o de muestras ambientales. bacterias que muestran estos fenotipos de
Propone considerar al menos 30 aislados para una resistencia, son, sensibles en los AST
especie dada, suficientes para garantizar el valor convencionales, por lo que se espera que el
estadístico de la estimación, indica que el cálculo tratamiento antimicrobiano sea efectivo, pero al
se debe realizar a partir de la combinación expresar estas formas de tolerancia ocurren
antibiótico-especie bacteriana y eventualmente, fracasos terapéuticos y recidivas de las
pueden incluirse datos de más de un año para infecciones (69). Las bacterias que crecen en
alcanzar este valor de referencia (67). Aún no biopelícula son más resistentes que sus
existen pautas para el aprovechamiento de estos contrapartes en crecimiento plantónico (69,71).
datos en medicina veterinaria. Los resultados de Existe un interés en el desarrollo de AST
cAST deben contar con medios que recopilen la específicos para las bacterias en biopelícula, que
mayor información, un software de gran utilidad son patógenas para la salud humana como
resulta WHONET (68) por su factibilidad en el Pseudomonas aeroginosa (fibrosis quística) o
registro y almacenamiento de información. Es Mycobacterium tuberculosis (72). Sin embargo,
necesario para cada país promover el desarrollo la relevancia clínica de la tolerancia fenotípica
de estudios multicéntricos nacionales sobre para bacterias patógenas en animales aún es
tendencias de sensibilidad en patógenos de especulativa y poco investigada. Por el momento
interés veterinario. estudios in vitro han demostrado un amplio
El aprovechamiento de datos acumulados es incremento de la MIC para erradicar biopelículas
más exitoso bajo el amparo de los programas de in vitro de especies bacteriana de interés
optimización de uso de antibióticos (PROA) veterinario (73).
denominación y siglas empleadas en el idioma Los ensayos moleculares de primera línea
español para el concepto ASPs (de sus siglas en como PCR, microarreglo de ADN y
Inglés antimicrobial stewardship programs), se secuenciación útiles en la confirmación de una
implementan en varios países en los sistemas de especie y las relaciones entre cepas, como se
salud humana, con resultados exitosos. El explica anteriormente, también se aplican en la
establecimiento de los PROA, requiere equipos detección de genes de resistencia y en la
multidisciplinarios con capacidad de liderazgo en tipificación de las cepas en cuanto a la RAM.
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