En este estudio, mostramos que AIEX es una técnica alternativa prometedora para el aislamiento

de vehículos eléctricos de diferenteslíneas celulares de manera eficiente y rápida. Como se resume

en la Tabla complementaria 1, el aislamiento de vehículos eléctricos utilizandola técnica AIEX
modifcada tiene varias ventajas. Es un proceso más rápido que UC con menos tiempo
prácticonecesario, y AIEX aísla los EV de una calidad y pureza mejoradas a las de TFF y, por lo
tanto, los EV no

Figura 3:

La modificación del protocolo AIEX hace que el aislamiento de EV sea más rápido, más escalable y
elimina la contaminación proteinas (a) El cromatograma muestra la absorbancia UV a 280 nm
(mAu) durante la elución de EV de AIEXcolumna utilizando un protocolo de elución por etapas de
335 mM (10 % de tampón B) y 890 mM (40 % de tampón B). n=3. (b) occidentalblot de EV aislados
del pico 1 y el pico 2 después de pasar la primera y la segunda vez por los medios acondicionadosa
través de la columna AIEX utilizando el protocolo AIEX modifcado. Las muestras se transfirieron
para los marcadores EV CD63,CD81 y ALIX así como para el contaminante común calnexina n=3.
Los Western blot completos se pueden encontrar enFig. 6 complementaria. (c) El análisis de
seguimiento de nanopartículas permitió el cálculo de la concentración promedio de partículasy el
tamaño medio de EV (anotado en el gráfico) aislado del pico 1 y 2. También se anota el porcentaje
de partículasque se encontraron en cada pico n=3. Barras de error±SEM. Prueba t de dos colas no
pareadas, **p<0,01. (d) La proteínaLa concentración de cada pico se tomó usando Nanodrop, y las
concentraciones de partículas analizadas por NTAse usaron para calcular la concentración de
proteína/partícula n=3. Barras de error±SEM. Prueba t de dos colas no apareada,**p<0,01. ( e )
Microscopía crioelectrónica de vehículos eléctricos eluidos con NaCl 890 mM (40 % de tampón B)
en el pico 2 n = 3. Escalabarra=50nm.

Tabla 1:

El mapeo de péptidos muestra que el protocolo de elución por pasos AIEX se enriqueció para EV
en el pico 2. Pico 1 yel pico 2 se lisaron en urea 6 M y se sometieron a mapeo de péptidos. Las 50
proteínas principales reportadas que se encuentran enLuego se usaron exosomas en exocarta32
para determinar si la mayoría de las proteínas EV residían en el pico 1 oen el pico 2 n=3. ANOVA
calculado por el software Waters progenesis. Las proteínas con un valor de p de 0,05 o menos
fueronincluidos en este análisis posterior.

necesitan someterse a un segundo paso de purificación. Debido a la velocidad, pureza y eficiencia

del protocolo AIEX, es elmétodo de aislamiento de EV de un solo paso que tiene el mayor
potencial de ser ampliado para volúmenes de cultivo celular más grandes.Nuestros datos
confrman que los VE aislados por AIEX son comparables en términos de tamaño, concentración y
morfología a los aislados por ultracentrifugación, que es hasta la fecha la técnica más utilizada en
el campo.para el aislamiento de vehículos eléctricos. Además de ser comparable en tamaño, el
aislamiento de vehículos eléctricos mediante AIEX también consume mucho menos tiempo.que la
UC. El aislamiento de un litro de sobrenadante de cultivo celular por UC suele tardar un día
completo. Por otra parte,para AIEX, se puede procesar 1 litro de sobrenadante de cultivo celular
en menos de 3 horas. Vale la pena señalar que el cultivo celularLos sobrenadantes aislados en este
estudio se sometieron a un paso de filtración de 0,2 µm antes del aislamiento EV, por lo tanto,
noexiste el potencial de aumentar aún más el rendimiento de los vehículos eléctricos eliminando
el paso de filtración y recolectando las poblaciones más grandesde vehículos eléctricos juntos.
Aunque la filtración de 0,2 µm se usa comúnmente en el campo para la clarificación de medios
acondicionados36,Es importante reconocer que se desconoce qué impacto tiene la fltración en los
vehículos eléctricos y si los vehículos eléctricos más grandes son necesarios.forzado a través de los
poros del fltro.

Los EV aislados de TFF estaban contaminados con proteínas y gotitas de lípidos como se ve en el
microscopio crioelectrónico,lo que sugiere que TFF no es ideal como un procedimiento de
aislamiento EV a gran escala de un solo paso si se desea excluir la contaminación de proteínas no
vesiculares. De hecho, otros grupos han hecho uso de pasos de purificación adicionales como
uncojín de densidad para aplicaciones clínicas16,20, que también sirve para aumentar los tiempos
de procesamiento y puede dar lugar apérdidas potenciales en el rendimiento.NTA es una técnica
muy útil que utiliza la capacidad de las partículas para dispersar la luz y el browniano de las
partículas.movimiento para calcular el tamaño y la concentración de partículas en solución37. Por
la naturaleza de la técnica,no es posible distinguir entre EV, EV agregados/estructuras lipídicas y
agregados de proteínas. nuestra ANTLos datos sugieren que TFF aísla un mayor rendimiento de
partículas en comparación con AIEX y UC, sin embargo, como los EV de TFF sonmuy contaminado
con proteínas y desechos, como se muestra en la microscopía crioelectrónica, se necesitaría más
trabajoque se llevará a cabo para descifrar si el rendimiento de los vehículos eléctricos es de
hecho mayor que AIEX o si las proteínas / lípidos agregadoslas gotas se miden con NTA y
contribuyen al aumento del número de partículas.Hasta donde sabemos, muchos grupos no han
estudiado en detalle la morfología de los vehículos eléctricos aislados por AIEX.Por lo tanto,
analizamos la morfología de los vehículos eléctricos aislados por AIEX mediante microscopía
crioelectrónica. vehículos eléctricos intactosse observaron con cantidades variables de
contaminación proteica después de la elución mediante un gradiente lineal de NaCl; esto
eramejoró para mostrar mucha menos contaminación cuando se usó un gradiente escalonado en
su lugar. Tras una mayor optimización

Figura 4:

AIEX se puede utilizar para aislar vehículos eléctricos de otros tipos de células. Los vehículos
eléctricos se aislaron de las líneas celulares de cáncer H1299y HCT116, así como células de la línea
celular en suspensión Expi293F™ utilizando el protocolo AIEX optimizado. (un occidentalblot
mostró el contenido de marcador EV del pico 1 y el pico 2 de cada línea celular n = 3. Las
transferencias Western de longitud completa puedense puede ver en la Fig. 10 complementaria.
( b ) NTA muestra la concentración y el tamaño medio de los vehículos eléctricos en el pico 2
aisladode diferentes líneas celulares. El tamaño se anota en el gráfico (no significativo) n=3. Barras
de error±SEM. Ordinario de una maneraANOVA, ***p<0,001.

del protocolo AIEX, se usó una mayor velocidad de carga y elución de 2 ml/minuto a 10 ml/minuto
encombinación con un paso modificado de elución. Al hacer esto, no solo podríamos reducir cinco
veces el tiempo de procesamiento,pero también separar claramente un mayor número de
contaminantes proteicos de los vehículos eléctricos. Adicionalmente, el pasogradiente pareció
aislar vesículas de menor tamaño promedio (120 nm frente a 179 nm p<0,05) en comparación con
elgradiente lineal. Si esto se debe a que el método es más eficiente en el aislamiento de
poblaciones de tamaño más pequeñoEV, o porque la alta concentración de sal durante la elución
provoca cambios en las presiones osmóticas y, en consecuencia,altera la dinámica de los lípidos
para inducir la formación de ampollas en las vesículas, queda por dilucidar. El poco tiempo que los
EVsgastar en tampón con alto contenido de sal antes de cambiar el tampón a PBS, junto con el
microscopio crioelectrónico que muestra intactoLos EV de morfología normal sugieren que la
elución de los EV en un alto contenido de sal no es muy perjudicial. En general, ella preparación
contenía vehículos eléctricos intactos con una contaminación proteica mínima y algunas
estructuras lipídicas más pequeñas, como se vepor microscopio crioelectrónico.

Ha habido algunos estudios recientes que describen el uso de AIEX para el aislamiento de VLP y
EV. Paraaislamiento de VLP, Steppert et al.30 use una columna monolítica AIEX de 1 ml fuerte de
amina cuaternaria (QA) CIMmultusasí como una columna CIMmultus dietil amino (DEAE) débil de
1 ml (separaciones BIA) y obtuvo resultados comparablesutilizando HEPES 50 mM y tampón NaCl
350 mM, pH 7,2. Usaron un tampón HEPES 50 mM y NaCl 2 M para eluirVLP y sepárelos de los EV y
el ADN contaminantes usando un gradiente lineal de NaCl a 1 M y un pasoprotocolo de gradiente
de tampón de elución 0 mM-760 mM-1100 mM30. En el protocolo de gradiente escalonado,
observan EVeluyendo con NaCl 760 mM y las VLP con NaCl 1100 mM. Esto es similar a nuestro
estudio donde vemos EVs eluyendo a ununa concentración similar de NaCl de NaCl 890 mM y las
proteínas contaminantes eluyen a NaCl 335 mM.Kim et al.31 utilizaron resina de intercambio
aniónico (expressQ) en lugar de una columna monolítica para aislar los vehículos eléctricos de las
células madre mesenquimales utilizando NaCl 0,5 M. Una mejora significativa en el rendimiento de
vesículas positivas para CD63 en comparación con UCa 100.000 g durante 1 hora, mientras que
observamos una mejora modesta pero no significativa de 1,4 vecesla recuperación. Esto puede
deberse a las diferencias entre los estudios con Kim et al. análisis de vehículos eléctricos de
mesenquimalescélulas madre mientras que nos enfocamos en los vehículos eléctricos de las
células HEK293T, además, Kim et al. usar una resina AIEX mientrashemos utilizado una columna
monolítica AIEX. Recientemente ha habido otro estudio interesante en el que DEAESe usó resina
sephadex A50 para aislar vehículos eléctricos del líquido amniótico mediante AIEX. Los autores
encontraron que los EV eluyeron enEl NaCl 200 mM fue en promedio más pequeño (60-100 nm)
que los vehículos eléctricos eluidos con NaCl 1 M (90-220 nm)38. Esto sugiereque los protocolos
IEX podrían desarrollarse potencialmente para eluir y separar los vehículos eléctricos por tamaño.
También existe la posibilidad de combinar AIEX con otros métodos de cromatografía según el uso
final final de los EV recolectados,por ejemplo, podría combinarse con purificación por afinidad o
cromatografía de exclusión por tamaño para aislar unpoblación de vehículos eléctricos. Estas
técnicas no solo serían útiles para el aislamiento de poblaciones específcas de vehículos
eléctricospero también podría considerarse para ayudar en la eliminación de cualquier
apolipoproteína contaminante restante de EVpreparativos. Para evitar por completo la
contaminación por apolipoproteínas, se puede

Graficas: hay de la a a la e, la a es una grafica que hicieron en el paso de elución para separar las
proteínas y se hizo una grafica de dos buffers de la absorbancia de rayos uv en el proceso de
elución

La b es un western blod que es un proceso molecular para aislar y detectar proteínas, se

detectaron que proteínas están en los picos de la gráfica,
La c es una cuantificación de la cantidad de células o partículas pasaron por la detección según el
tamaño y la d es lo mismo pero es una cuantificación según la cuantificación.