A spectos de la biotecnología

microbiana
Jesús Campos-García, Carlos Cervantes, Martha I. Ramírez-Díaz y Carlos R. Sosa Aguirre
Cuerpo Académico de Biotecnología

Resumen
La biotecnología moderna se ha enfocado al empleo de los organismos vivos, o de
sus componentes, con distintos objetivos de beneficio para la sociedad. Entre ellos se
encuentran los procesos de biorremediación y de biodegradación utilizando microor-
ganismos. Estas herramientas biotecnológicas aprovechan la amplia capacidad me-
tabólica que poseen las células microbianas. La biorremediación pretende disminuir o
eliminar los niveles de la contaminación ambiental, mientras que los sistemas micro-
bianos de biodegradación pueden aprovecharse para la optimización de procesos in-
dustriales. En este trabajo se resumen las líneas de investigación desarrolladas
actualmente por los integrantes del Cuerpo Académico de Biotecnología. Estos te-
mas incluyen aspectos relacionados con la degradación microbiana de hidrocarbu-
ros, los sistemas de tolerancia bacteriana al ión tóxico cromato y su regulación, y la
degradación de carbohidratos de la caña de azúcar mediante enzimas provenientes
de bacterias termofílicas.

Abstract
Modern biotechnology has focused to the use of living organisms, or their compo-
nents, with different objectives for the benefit of society. Among them are the proces-
ses of bioremediation and biodegradation employing microorganisms. The
application of these biotechnological tools takes advantage of the wide metabolic abi-
lities that display microbial cells. Bioremediation intends to diminish or to eliminate the
levels of environmental pollution, whereas the microbial biodegradation systems may
be used for the improvement of industrial processes. This article summarizes the cu-
rrent research lines carried out by the members of the Biotechnology academic group.
These subjects include aspects related to the microbial degradation of hydrocarbon
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compounds, the bacterial systems for the tolerance to the toxic ion chromate and its
regulation, and the degradation of sugarcane carbohydrates by enzymes isolated
from thermophilic bacteria.

Introducción
Los microorganismos se encuentran en el ambiente expuestos a numerosos com-
puestos tóxicos, tanto de origen orgánico como de naturaleza inorgánica. Entre ellos se en-
cuentran, por ejemplo, cierto tipo de hidrocarburos y los derivados de los metales pesados.
Por otra parte, la contaminación ambiental provocada por las actividades humanas es uno
de los grandes problemas a los que se enfrenta la sociedad hoy en día. Algunas de las princi-
pales causas de esta grave situación son el aumento de la población, el uso desmedido de
fertilizantes y plaguicidas agrícolas, y la expansión de las industrias alimenticia y de manu-
facturas. Esto ha originado que en las últimas décadas se hayan liberado al ambiente una
gran cantidad de compuestos químicos, muchos de los cuales constituyen contaminantes
de alto riesgo debido a sus propiedades tóxicas, mutagénicas o carcinogénicas. Ante estas
agresiones, las bacterias han desarrollado diversos mecanismos para asimilar, degradar o
tolerar los compuestos nocivos presentes en el entorno.
Los investigadores han empleado estos variados mecanismos microbianos con fines
de beneficio para la sociedad por medio de la biotecnología. El uso de las herramientas bio-
tecnológicas intenta aprovechar, con distintos propósitos, la amplia capacidad metabólica
que han desarrollado los microorganismos. Ejemplos de estas aplicaciones son el uso de
microorganismos para disminuir la contaminación (biorremediación) y el empleo de siste-
mas catabólicos microbianos (biodegradación) para la optimización de procesos industria-
les. Un más profundo entendimiento de las capacidades metabólicas microbianas
redundará sin duda en un mejor aprovechamiento de las propiedades biotecnológicas que
ofrecen los microorganismos.

Análisis de los genes involucrados en el catabolismo de terpenos

acíclicos y leucina en Pseudomonas aeruginosa
En la naturaleza existen diversas comunidades microbianas que influyen en la trans-
formación de los contaminantes ambientales y que son el principal mecanismo de elimina-
ción de muchos compuestos tóxicos, convirtiéndolos en biomasa, dióxido de carbono y
agua, u otros compuestos más simples y fáciles de asimilar por otros organismos. En ecosis-
temas no contaminados, los microorganismos degradadores de hidrocarburos constituyen
menos del 0.1% de la comunidad microbiana, mientras que en ecosistemas contaminados
con hidrocarburos pueden constituir hasta el 100% de dicha comunidad. Sin embargo, un
gran número de estos compuestos químicos sintéticos son destruidos a una baja velocidad,
por lo que se acumulan en el ambiente, persistiendo durante periodos prolongados de tiem-
po, es decir, se comportan como recalcitrantes.

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Figura 1. Rutas propuestas para la degradación de terpenos acíclicos y leucina en Pseudomonas aeruginosa. Se marcan los
puntos donde participan los productos codificados en los operones liu y atu en las rutas superior (A) o inferior (B) del catabolis-
mo del citronelol. También se indican las rutas superior (C) e inferior (D) del catabolismo de la Leucina. Tomada de Aguilar et
al. (2006).

La biodegradación de hidrocarburos ha sido ampliamente estudiada, encontrándose

que los hidrocarburos lineales y ramificados son transformados, mediante una serie de oxi-
daciones, hacia un ácido carboxílico, el cual puede ser utilizado como fuente de carbono y
energía por medio de la oxidación â (Pirnik et al., 1974). Sin embargo, la biodegradación de
los hidrocarburos ramificados se ve afectada sustancialmente, ya que las ramificaciones,
especialmente aquellas localizadas cerca de los extremos de la cadena principal, disminu-
yen la capacidad de metabolizarlos (Pirnik et al., 1974; Schaeffer et al., 1979).

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Biodegradación de terpenos acíclicos

Los hidrocarburos 3-metil ramificados son compuestos con características recalci-
trantes debido a que la ramificación sobre el carbono 3 (o â) de la cadena principal bloquea la
mencionada oxidación-â, por la cual son metabolizados (Pirnik et al., 1974). Este patrón es-
tructural se ha encontrado en ciertos terpenos acíclicos y en los surfactantes sintéticos del
tipo alquilbenceno sulfonato ramificado (Campos-García et al., 1999). Dentro de este grupo
de compuestos se encuentra el citronelol, un terpeno acíclico que se ha utilizado como mo-
delo para el estudio de la degradación de compuestos 3-metil ramificados, los cuales sólo
pueden ser metabolizados por algunas especies de Pseudomonas (Seubert y Fass, 1964;
Alexander, 1973; Cantwell et al., 1978).
La ruta degradativa del citronelol ha sido propuesta en Pseudomonas citronellolis, en
los 70’s (Cantwell et al., 1978; Fall et al., 1979), y recientemente en P. aeruginosa
(Díaz-Pérez et al., 2004; Hoschle et al., 2005) (Figura 1). Para que se lleve a cabo la degra-
dación del citronelol es necesaria la remoción del grupo 3-metilo mediante la formación de
una molécula de acetato en los dos intermediarios 3-metil ramificados (geranil-CoA y
3-metilcrotonil-CoA) que se generan durante la ruta degradativa (Hoschle et al., 2005; Agui-
lar et al., 2006). Este proceso ocurre mediante un grupo de reacciones homólogas que invo-
lucra a una deshidrogenasa, una carboxilasa y una hidratasa, que son específicas para cada
intermediario, y una liasa que al parecer actúa en el proceso de eliminación de la ramifica-
ción de ambos intermediarios 3-metil ramificados (Aguilar et al., 2006).

Los operones catabólicos liu y atu de Pseudomonas

Para identificar los genes que codifican las enzimas involucradas en la degradación
de terpenos acíclicos, en nuestro grupo de trabajo, se llevó a cabo mutagénesis por transpo-
sición de P. aeruginosa, obteniéndose varias mutantes incapaces de crecer en citronelol
como única fuente de carbono y energía. La secuenciación de las regiones donde ocurrió la
inserción del transposón, y un análisis informático, identificaron siete marcos de lectura, los
cuales se denominaron gnyRDBHALS (Díaz-Pérez et al., 2004), ahora renombrado como el
operón liuRABCDE. La organización, el análisis de las regiones promotoras y la regulación
transcripcional sugiere fuertemente que los genes liu conforman un operón catabólico
(Díaz-Pérez et al., 2004; Aguilar et al., 2006) (Fig. 1). El operón liu codifica potencialmente
una acil-CoA deshidrogenasa, las subunidades á y â de la acil-CoA carboxilasa, una
acil-CoA liasa, y dos reguladores transcripcionales (Díaz-Pérez et al., 2004).
Recientemente se encontró que el genoma de P. aeruginosa posee dos operones ho-
mólogos, uno cuyas enzimas se relacionan con el metabolismo de leucina e isovalerato, el
operón liu (leucine and isovalerate utilization), y el operón atu, encargado de la degradación
de terpenos acíclicos (acyclic terpenes utilization) (Aguilar et al., 2006; Forster-Fromme et
al., 2006) (Fig. 1).

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Caracterización de los operones catabólicos

Con el fin de dilucidar con detalle los mecanismos catabólicos de terpenos acíclicos y
de leucina, se ha iniciado la caracterización de las regiones genéticas y de sus productos.
Dicha caracterización se plantea a tres niveles: 1) Nivel transcripcional, que involucra cono-
cer el mecanismo de control de la expresión de los genes que constituyen los sistemas de-
gradativos; 2) Nivel traduccional, en el cual se pretende analizar la expresión de los
productos proteicos codificados en los genes que constituyen los operones identificados; y
3) Nivel funcional, donde se buscará caracterizar las actividades enzimáticas, o la función
reguladora, de los productos génicos involucrados. Algunas de las aportaciones que se
plantean con este proyecto es contribuir, desde el punto de vista tecnológico, al desarrollo de
biocatalizadores con interés industrial y ecológico.

Análisis de la relación estructura-función del transportador ChrA

de Pseudomonas aeruginosa
Los organismos vivos se encuentran expuestos en la naturaleza a los metales pesa-
dos, comúnmente en sus formas ionizadas. Estos iones ejercen diversos efectos tóxicos so-
bre los microorganismos. Las bacterias han desarrollado variados y eficientes mecanismos
de resistencia para tolerar estos efectos nocivos. Entre ellos se cuentan principalmente: a)
los componentes celulares que capturan a los iones, neutralizando su toxicidad; b) los siste-
mas enzimáticos que modifican el estado redox de los metales convirtiéndolos en formas
menos tóxicas; y c) los transportadores de membrana que expulsan las especies nocivas del
citoplasma.
Con el advenimiento de las secuencias de genomas completos, se cuenta actualmen-
te con una gran cantidad de información sobre la codificación de transportadores de metales
pesados, muchos de los cuales se han caracterizado a nivel molecular. Entre ellos se en-
cuentran los sistemas que expulsan iones derivados de los cationes cobre, cadmio, cobalto,
plata, plomo, níquel y zinc, así como los oxianiones de arsénico y cromo. La estructura, com-
plejidad y requerimientos energéticos de estos transportadores varía ampliamente. Las fa-
milias proteicas que agrupan a los sistemas de expulsión de metales muestran una vasta
distribución en el reino bacteriano, lo cual ha permitido reconocer su importancia adaptativa
para los microorganismos (Cervantes et al., 2001).
Aunque se han descrito varios sistemas bacterianos de resistencia al oxianión tóxico
cromato (CrO42-), el ejemplo más estudiado es el determinante plasmídico chrA de P. aerugi-
nosa, que codifica la proteína de membrana ChrA (Cervantes y Campos-García, 2007). Se
ha demostrado, en ensayos in vitro e in vivo, que ChrA confiere resistencia mediante la ex-
pulsión del cromato del citoplasma (Alvarez et al., 1999; Pimentel et al., 2002). La expulsión
ocurre mediante un proceso dependiente de energía que es abolido por inhibidores de la ca-
dena respiratoria y por el ión análogo sulfato. En los últimos años, hemos enfocado las in-
vestigaciones sobre la relación estructura-función de este transportador bacteriano al
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análisis filogenético de la familia de proteínas homólogas a ChrA, al estudio de la topología

membranal de la proteína, así como a la identificación de residuos esenciales para la expul-
sión de cromato.

Figura 2. Arbol filogenético de la familia LCHR de transportadores de cromato. Se muestran las 77 secuencias de proteínas ho-
mólogas de ChrA de Pseudomonas aeruginosa. A la izquierda se muestra la clasificación taxonómica de los organismos y a la
derecha las siete subfamilias. Las flechas rojas señalan las dos proteínas caracterizadas a nivel funcional. Tomada de Cervantes
y Campos-García (2007).

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Análisis filogenético de ChrA

Después de una búsqueda exhaustiva en las bases de datos, se obtuvieron 135 se-
cuencias homólogas a ChrA de P. aeruginosa: 77 secuencias mayores, o bidominio (Figura
2), y 58 secuencias pequeñas, o monodominio. La distribución de las proteínas incluyó bac-
terias, arqueas y hongos. Las secuencias bidominio se dividieron en los dominios amino y
carboxilo, y se alinearon con las proteínas monodominio (212 dominios en total). Se constru-
yó un árbol filogenético aplicando cuatro métodos diferentes, obteniéndose resultados muy
similares. Se observó que los dominios se agrupan de manera independiente: las proteínas
monodominio, los dominios carboxilo y los dominios amino. Este tipo de distribución, auna-
do al hecho de que sólo se ha comprobado el transporte de cromato en proteínas bidominio,
parece indicar que las proteínas monodominio forman un grupo parálogo de la familia de
ChrA, y que sólo las proteínas bidominio constituyen una familia de transportadores de cro-
mato (Díaz-Pérez et al., 2005).
El análisis filogenético sugiere que las proteínas de la superfamilia CHR se han deri-
vado de una duplicación génica, como ha ocurrido con miembros de otras familias de trans-
portadores (Nies et al., 1998; Cervantes y Campos-García, 2007). El árbol construido de la
familia de secuencias mayores (LCHR) consta de siete subfamilias (LCHR1 a LCHR6 y una
subfamilia de proteínas de hongos). Los subgrupos LCHR2 y LCHR5 contienen secuencias
de las únicas proteínas caracterizadas: ChrA de Cupriavidus metallidurans y de P. aerugino-
sa, respectivamente (Díaz-Pérez et al., enviado para publicación) (Fig. 2).

Topología de ChrA en la membrana

La determinación de la topología membranal de ChrA se inició construyendo los vec-
tores binarios de expresión pUCPphoA y pUCPlacZ, para la generación de fusiones traduc-
cionales. Esto dio como resultado que los fragmentos del gen chrA quedaran unidos al gen
reportero, dando origen a las fusiones, las cuales conservan un solo marco de lectura entre
chrA y el gen reportero. Puesto que los vectores de expresión contienen orígenes de replica-
ción para Escherichia coli y P. aeruginosa, la determinación de la actividad de las enzimas
reporteras se hizo en los dos géneros bacterianos, con resultados muy similares. Las fusio-
nes localizadas en los aminoácidos Ala188, Val233, Ala310, Glu369, Pro413 y Gly416 mos-
traron alta actividad de PhoA, lo cual indica que se localizan en el periplasma, mientras que
los aminoácidos Ile159, Phe263, Asp276, Ala334 y Asn393 produjeron actividad de LacZ, lo
cual indica que se ubican en el citoplasma. Con las fusiones en los aminoácidos Val152,
Asp162, Gly305 y Met313 no se obtuvo actividad de ninguna de las enzimas, por lo que es-
tos aminoácidos pueden estar en segmentos transmembranales (STM). De acuerdo con los
resultados obtenidos, se concluyó que la proteína ChrA contiene 13 STM, con el amino ter-
minal en el citoplasma y el carboxilo terminal en el periplasma (Jiménez-Mejía et al., 2006).
El alineamiento de las dos mitades de ChrA mostró que poseen homología: los STM I,
II, III, IV, V y VI presentaron similitud con los STM VIII, IX, X, XI, XII y XIII, respectivamente.
Estas dos regiones, sin embargo, poseen una orientación opuesta con respecto a la mem-
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brana. Estos datos sugieren que ChrA surgió como resultado de un evento de duplicación
génica, seguida de la inserción del STM VII. Estos resultados también sugieren que las dos
mitades de la proteína llevan a cabo funciones distintas para el transporte de cromato (Jimé-
nez-Mejía et al., 2006).

Residuos esenciales para el funcionamiento de ChrA

Mediante mutagénesis al azar y dirigida se han identificado varios aminoácidos neu-
tros esenciales para la función de la proteína y se les ha asignado un papel estructural (Agui-
lera et al., 2004). Como el mecanismo de resistencia de ChrA consiste en la expulsión del
oxianión cromato, es posible que los residuos básicos, arginina (Arg) y lisina (Lys), interac-
cionen con el cromato para su translocación. Para probarlo, se analizaron ocho residuos bá-
sicos de ChrA con altos niveles de conservación en las subfamilias LCHR2 y LCHR5: Lys37
y Arg34, ubicados en el STM I; Lys248, ubicado en el STM VIII; Arg55, Arg98, Arg201 y
Lys394, presentes en asas hidrofílicas, y Arg154, localizado en la interfase del STM IV y el
citoplasma. Usando mutagénesis dirigida se obtuvieron mutantes en los aminoácidos selec-
cionados, a las cuales se les evaluó su nivel de susceptibilidad a cromato. Los resultados lle-
varon a concluir que los residuos Lys37, Arg34 y Arg55 probablemente son importantes para
mantener una adecuada estructura de ChrA; Arg98 y Arg201 son importantes para la fun-
ción general de la proteína, mientras que los residuos Arg154, Lys248 y Lys394 son esencia-
les para el funcionamiento de ChrA y probablemente participan de manera directa en su
interacción con el cromato (Moreno et al., 2007).
También se evaluó el papel de los aminoácidos con grupos R ácido [Aspartato (Asp) y
Glutamato (Glu)] en el funcionamiento de ChrA. Para ello, se seleccionaron 11 residuos áci-
dos con una conservación superior al 50% con respecto a los homólogos de las subfamilias
LCHR2 y LCHR5. Las mutantes afectadas en los residuos Glu60, Glu230 y Asp281 (presen-
tes en asas hidrofílicas de ChrA) mantuvieron el nivel de resistencia a cromato de la cepa
con el gen chrA silvestre, sugiriendo que no son importantes para el funcionamiento de la
proteína. En las mutantes en los residuos Glu56 y Asp59 (presentes en el asa periplásmica
1, P1) y Glu83, Glu86, Asp162, Asp330, Asp346 y Asp362 (los únicos seis residuos en
STMs en ChrA), la resistencia a cromato se abatió en forma considerable, señalando que
estos residuos son esenciales para el funcionamiento de ChrA. Los resultados indicaron que
el asa P1 participa de manera importante en el proceso de expulsión de cromato por la pro-
teína ChrA. Los datos también sugieren que los residuos ácidos presentes en STM están in-
volucrados en generar una correcta estructura de ChrA en la membrana, relacionada con su
función como un transportador de cromato (Cortés, 2007).

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Regulación de la expresión de genes de respuesta al daño causado

por cromo en Pseudomonas aeruginosa
Los metales pesados se encuentran de manera abundante sobre la corteza de la Tie-
rra y los microorganismos han estado expuestos a ellos básicamente desde el inicio de la
vida. El uso industrial del cromo (Cr), un metal pesado, ha ocasionado que éste sea conside-
rado un serio contaminante ambiental, lo que ha convertido el estudio de los mecanismos
biológicos que contrarrestan a este metal en un campo fértil de investigación. En la naturale-
za, el Cr se encuentra principalmente en los estados de oxidación Cr(III), que es relativa-
mente inocuo, y Cr(VI), considerado una especie más tóxica. El Cr(VI) en forma de cromato
(CrO42-) es transportado a través de las membranas biológicas, tanto en procariontes como
en eucariontes (Cervantes et al., 2001).

Resistencia bacteriana a cromato

Las bacterias han desarrollado diversas estrategias contra los efectos nocivos del Cr
(Cervantes et al., 2001). Los plásmidos pUM505 de P. aeruginosa (Cervantes et al., 1990) y
pMOL28 de C. metallidurans (Nies et al., 1990) codifican la arriba citada proteína ChrA, que
confiere resistencia a cromato. El gen chrA del plásmido pMOL28 forma parte de un operón
que incluye el gen chrB, el cual codifica una proteína de 324 aminoácidos (aa) que regula la
expresión de ChrA, y el gen chrC, que codifica una proteína de 197 aa homóloga a superóxi-
do dismutasas (SOD) (Nies et al., 1990; Juhnke et al., 2002). Adicionalmente, se reportó que
el plásmido pB4 de Pseudomonas sp. posee los genes chrA, chrB y chrC, manteniendo el
mismo arreglo estructural que presentan en el plásmido pMOL28 (Tauch et al., 2002). Sin
embargo, los productos de estos genes no han sido caracterizados a nivel molecular y sus
funciones se desconocen. El objetivo general de este proyecto es conocer la función y los
mecanismos de regulación de la expresión de los genes que participan en la resistencia a
cromato del plásmido pUM505 de P. aeruginosa.

Los genes chr bacterianos

Siguiendo diversas estrategias, inicialmente encontramos que el plásmido pUM505
posee, aledaño al gen chrA, secuencias homólogas a los genes chrB (al extremo 5´) y chrC
(al extremo 3´) de C. metallidurans (Ramírez-Díaz et al., en preparación). La proteína ChrB
codificada por pUM505, de 314 aa, posee 46% y 90% de identidad con las proteínas ChrB
de C. metallidurans y Pseudomonas sp., respectivamente. Por otra parte, la proteína ChrC
de pUM505, de 86 aa, presenta 45% y 53% de identidad con las proteínas ChrC de C. meta-
llidurans y Pseudomonas sp., respectivamente. Recientemente encontramos que los genes
chrB y chrC, de manera independiente, no participan en la resistencia a cromato (Ramí-
rez-Díaz et al., en preparación). La participación de ChrB, en la regulación de la expresión
del operón, y de ChrC, como un sistema adicional de destoxificación, aún está por determi-
narse.

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La invertasa BrfA de Thermotoga maritima en la elaboración de

azúcar invertida
La diversificación de la caña de azúcar para la búsqueda de productos con mayor va-
lor agregado puede ser un factor para la reactivación de la industria azucarera en México, la
cual se ha limitado al abasto nacional de azúcar de mesa, causando una baja rentabilidad
del cultivo de caña. La enzima invertasa, o sacarasa (EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de la
sacarosa, produciendo una mezcla equimolar de glucosa y fructosa, por lo que se ha postu-
lado que el uso de invertasas termoestables puede ser rentable para la producción de azú-
car invertida (Alberto et al., 2004). El gen brfA de la bacteria extremotermófila Thermotoga
maritima codifica la invertasa BrfA, que consta de 432 aminoácidos y tiene un peso molecu-
lar de 50 kilodaltones. BrfA pertenece a la familia de proteínas GH32. Una característica in-
teresante de esta enzima es que no requiere de metales como cofactores (Liebl et al., 1998).
Estructuralmente, la proteína BrfA presenta dos dominios, uno de â-propela de cinco
aspas, donde encontramos los aminoácidos involucrados en el sitio activo de la enzima, y
otro tipo â~-sandwich (Figura 3). El sitio activo está compuesto por dos residuos catalíticos:
Glu190 (D190), que generalmente actúa como ácido/base, y Asp17 (D17), que funciona
como nucleófilo (Fig. 3). El sitio de unión consta de cinco residuos polares (Asn16, Gln33,

Figura 3. Representación esquemática de la estructura de la proteína BrfA de Thermotoga maritima. El dominio â-sandwich
está coloreado en amarillo arriba a la derecha y las cinco aspas del dominio â-propela están representadas con colores individua-
les. La molécula de rafinosa está representada en “bonds” y los residuos catalíticos (D17 y D190) en “ball and stick”. Las coor-
denadas se obtuvieron del archivo 1W2T (Alberto et al., 2004) y la figura se preparó con los programas Molscript (Kraulis,
1991) y Raster3D (Merrit y Bacon, 1997).

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Glu101, Arg137 y Glu188) y cinco residuos aromáticos (Trp41, Phe74, Tyr92, Tyr240 y
Trp260) (Alberto et al., 2006).
La enzima BrfA ha mostrado tener afinidad por diversos sustratos, como sacarosa, ra-
finosa, levana e inulina. Estudios con mutantes de esta enzima han señalado que, a pesar
de tener una mayor afinidad por sustratos como rafinosa o inulina (Km 15 y 19 mM, respecti-
vamente) que por sacarosa (Km 59 mM), al estudiar la eficiencia catalítica de la enzima se
observó que esta situación se invierte, encontrándose valores de kcat/Km de 9.3 x 103, 3.1 x
104 y 4.1 x 104 M-1s-1 para rafinosa, inulina y sacarosa, respectivamente (Alberto et al., 2006;
Merlos, 2007).
La alta eficiencia catalítica de la invertasa BrfA de T. maritima, y su alta termoestabili-
dad (temperatura óptima de 85ºC), la hacen compatible con los procesos industriales de ex-
tracción de sacarosa a partir de jugos de caña, que se realizan a 85ºC. Sin embargo, la
actividad de la enzima se ve drásticamente disminuida cuando se obtiene de jugo de caña
crudo en lugar de jugo de caña que fue sometido a un proceso de clarificación y desminerali-
zación (Tabla 1; Merlos, 2007). El tren de desmineralización, en consecuencia, toma un pa-
pel relevante; éste proceso consta de un tratamiento en serie con resinas catiónica fuerte,
aniónica débil, aniónica fuerte y catiónica fuerte. Este último paso se utiliza para controlar la
fuga de iones y regular el pH del jugo a 4.5.

TABLA 1
Actividad de BrfA en jugo de caña de azúcar

Jugo filtrado Jugo filtrado y desmineralizado

a
28.09 µmol/min/mg 163.4 µmol/min/mga
a
Azúcar reductor liberado.
Datos de Merlos, 2007.

Bajo las condiciones de acidez (pH 4.5) y temperatura (85ºC) empleadas, al dejar la
reacción en incubación con la enzima por 1.5 h se encuentra una inversión (degradación) de
la sacarosa mayor del 90%. Estos resultados indican que la proteína BrfA de T. maritima
puede ser una importante alternativa para su uso a nivel industrial. En la actualidad, nos en-
contramos haciendo estudios de ingeniería de proteínas, para tratar de aumentar la activi-
dad de la enzima por medio de mutaciones sitio-dirigidas, y del diseño de reactores con
enzimas inmovilizadas, para buscar reducir los costos generados por el empleo de la enzi-
ma.

Ciencia Nicolaita No. 48 61 Octubre de 2007

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Agradecimientos
La investigación de nuestros laboratorios es apoyada por la CIC (UMSNH) y el
COECYT.

Bibliografía
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