Está en la página 1de 8

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR EN LA INDUSTRIA CERVECERA

F. X. CASTA SITJAS 1, M. VERA SOLER 1, C. ESCUDERO PREZ 2


2

S.A. DAMM - BARCELONA. INSTITUTO QUMICO DE SARRI - BARCELONA.


1

RESUMEN La electroforesis capilar es una tcnica de separacin que se est utilizando cada vez ms en los laboratorios de anlisis, ya que ofrece grandes ventajas. Esta tcnica tiene mltiples aplicaciones en la industria cervecera, especialmente en el anlisis de sustancias inicas o fcilmente ionizables. En el presente artculo se describen mtodos adecuados para el anlisis, mediante esta tcnica, de aniones, cationes, cidos orgnicos y azcares en cerveza, en mosto y en aguas empleadas para su fabricacin. Asimismo, tambin se han realizado los correspondientes ensayos para validar estos mtodos en lo que respecta a precisin, exactitud, linealidad y recuperacin, obtenindose resultados satisfactorios que muestra que es una tcnica eficaz y apropiada para este tipo de anlisis.

SUMMARY The capillary electrophoresis is a separation technique which is more frequently used on all the analytical laboratories, because it has big advantages. It has numerous applications on the brewing industry, specially on the analysis of ionic compounds or easily ionizables ones. In this paper we describe the methods for the analysis , using this technique, of anions, cations, organic acids and sugars from beer, wort and production waters. We have also validated the methods according their accuracy, precision, linearity and recovery, obtaining satisfactory results.

INTRODUCCIN QU ES LA ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis capilar es una tcnica de separacin que actualmente est adquiriendo cada vez mayor importancia en la industria alimentaria. Esta tcnica se basa en la diferente movilidad (movilidad electrofortica) de las sustancias en solucin bajo la accin de un campo elctrico. La separacin de las sustancias se lleva a cabo en el interior de un tubo capilar, normalmente de slice fundida, cuyas dimensiones oscilan entre 10-100 cm de longitud y 25-100 m de dimetro interno, lleno de una solucin tampn. Una fuente de alimentacin de corriente continua suministra un elevado potencial (varias decenas de kV), y gracias a la conductividad elctrica del tampn se origina una diferencia de potencial entre los extremos del capilar. Cada sustancia introducida en el capilar se desplaza por su interior a una velocidad que depende de su carga elctrica global, su estructura y el potencial aplicado, que son los responsables principales de la separacin. Los dos extremos del capilar se sumergen en dos viales que contienen el tampn. En estos viales tambin estn sumergidos los electrodos conectados a la fuente de energa, que al aplicar el potencial crean un flujo de cargas positivas que van del nodo al ctodo: el flujo electroosmtico. Al inyec-

tarse la muestra, por el extremo del capilar correspondiente al nodo, el potencial hace que los analitos cargados positivamente (cationes) migren hacia el ctodo, primero los ms cargados y de menor tamao, y luego los menos cargados y de mayor tamao, y poco antes de llegar al extremo del ctodo sern captados por el detector. Los analitos neutros no se vern influenciados por el potencial pero se movern hacia el ctodo, arrastrados por el flujo electroosmtico, a la misma velocidad que ste, y por tanto, sern detectados despus de los cationes. Por ltimo, los analitos cargados negativamente (aniones) migrarn hacia el nodo, pero el flujo electroosmtico puede arrastrarlos, a todos o a algunos de ellos, hacia el ctodo, siendo detectados, por tanto, al final del anlisis, despus de los analitos neutros, siendo los aniones ms cargados y de menor tamao los ltimos en llegar. El orden de llegada al detector, y por tanto, el orden en el electroferograma ser: cationes, neutros y aniones. Pero cuando lo que nos interesa analizar son aniones tenemos la posibilidad de invertir la polaridad del sistema (polaridad negativa), de manera que los analitos y el flujo electroosmtico ahora irn del ctodo al nodo, y el orden de llegada ser al revs: aniones, neutros y cationes. La separacin electrofortica depende, en gran medida, de las cargas de los analitos, y por consiguiente, est muy influenciada por el pH del tampn, ya que cambios en el pH pueden convertir analitos neutros en cargados, y viceversa, variando as su movilidad. Esta tcnica, por sus caractersticas de funcionamiento basadas en la carga de las molculas, es adecuada para el anlisis de sustancias inicas o fcilmente ionizables, tales como cationes y aniones orgnicos e inorgnicos, cidos orgnicos, azcares o aminocidos, siendo de las pocas tcnicas que permiten el anlisis de molculas de elevado peso molecular, como las protenas. Esto supone una gran variedad de compuestos, algunos de los cuales son estudiados en este artculo. Para establecer un mtodo que permita separar y cuantificar una serie de analitos en una matriz determinada, se deben optimizar las diferentes condiciones que influyen en la separacin, hasta obtener la selectividad y sensibilidad deseadas. Las principales condiciones a optimizar son el voltaje

CERVEZA Y MALTA

47

XL (4), 160, 2003, 47-54

aplicado, la temperatura del capilar, el volumen de muestra inyectado, la longitud del capilar, el tampn y el pH del tampn. El tampn y su pH son posiblemente los factores ms importantes a considerar, y de su correcta eleccin depende, en gran parte, el xito de la separacin, ya que para poder separar dos analitos similares, el pH del tampn debe encontrarse entre el valor de pKa de uno y el del otro, y de esta manera se consigue que uno est ionizado y el otro no. La electroforesis capilar puede llegar a lmites de deteccin de mg/l a g/l, dependiendo del tipo de detector utilizado. El detector UV-Visible, que es el que nosotros utilizaremos, est en el rango de mg/l, y requiere que los analitos tengan capacidad de absorber la luz de esta zona del espectro (UV-Visible). Pero si esta condicin no se da en los analitos, como pasa en nuestro caso, se puede hacer una deteccin por fotometra indirecta, en la que el tampn es el que absorbe y lo que se detecta es la disminucin de absorcin cada vez que un analito pasa por la zona de deteccin. APLICACIONES EN LA INDUSTRIA CERVECERA EQUIPOS Y MATERIAL La electroforesis capilar cuenta con muchas aplicaciones en la industria alimentaria. Hasta la fecha se han realizado varias investigaciones que muestran como esta tcnica puede utilizase para la determinacin de aniones, cationes, cidos orgnicos, azcares, aminocidos, protenas, colorantes, edulcorantes, flavonoides y vitaminas en alimentos. De todas ellas cabe destacar los trabajos realizados por T. Soga et al., en los cuales mediante la utilizacin del tampn de cido 2,6-piridindicarboxlico y bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) se consigue una correlacin de hasta 0,999 entre la electroforesis capilar y otros mtodos de separacin cromatogrfica. Concretamente, vemos como en el sector del vino se ha determinado el sulfito, con las siguientes condiciones: capilar de slice fundida 1 = 72 cm, id = 75 m tampn Organic Acids Buffer for HPCE (pH=5,6) de Agilent Technologies inyeccin: 100 mbars, V = -25 kV, T = 20 C deteccin: seal = 350 nm (Bw: 20 nm), ref = 200 nm (Bw: 10 nm) Tambin se ha determinado la concentracin de los cidos caproico y caprlico, con las mismas condiciones descritas antes pero con tampn de 5mM cido 2,6-piridindicarboxlico y 0,5mM bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) a pH de 5,6. De forma anloga, en la industria cervecera encontramos mltiples aplicaciones de la electroforesis capilar, especialmente para el anlisis de sustancias inicas o fcilmente ionizables. Se obtienen muy buenos resultados en la utilizacin de esta tcnica para la cuantificacin de los diferentes aniones inorgnicos y cationes, especialmente til en el control de cervezas y aguas que son materia prima para la fabricacin de la cerveza. Tambin es una aplicacin de gran inters la determinacin de los cidos orgnicos presentes en la cerveza, ya que permite elaborar una relacin de las rutas metablicas durante el transcurso de la fermentacin y una correlacin de stas con el aroma y sabor final de la cerveza. La cuantificacin de los azcares presentes en el mosto y cervezas, que era realizada habitualmente por HPLC, tambin se puede resolver por electroforesis capilar, siendo sta una forma fiable y de bajo coste para evaluar un perfil elemental del mosto. Adems, la cuantificacin de ciertas sustancias, como el calcio y el oxalato, es de gran utilidad debido a su relacin con la estabilidad de la cerveza. En este artculo se describen los mtodos para el anlisis de aniones, cationes, cidos orgnicos y azcares, en cerveza, en el mosto y en las aguas empleadas para su fabricacin, as como los resultados obtenidos en las validaciones realizadas de dichos mtodos.
CERVEZA Y MALTA 48

Es una tcnica joven en la que se estn continuamente desarrollando nuevos mtodos y cuya principal ventaja consiste en el bajo coste invertido en el anlisis, comparado con otras tcnicas.

Todos los experimentos se han llevado a cabo utilizando un equipo de Electroforesis Capilar (CE) de Agilent Technologies (Waldbronn, Alemania), que incluye la unidad de CE, con un detector UV-Vis diode array, y el software Chemstation para el control del sistema, adquisicin de datos y procesado de datos. El agua utilizada ha sido previamente tratada mediante un sistema purificador Milli-Q, de Millipore (Bedford, USA). MTODOS A continuacin se presentan cuatro mtodos de anlisis por electroforesis capilar de aplicacin en la industria cervecera. 1. ANIONES EN AGUAS Y CERVEZA 1.1. Mtodo Este mtodo permite cuantificar la concentracin a la que se encuentran los principales aniones (cloruros, nitratos, sulfatos y fosfatos) en la cerveza y en las aguas utilizadas para su fabricacin. 1.1.1. Preparacin de la muestra Las muestras de agua no requieren de ningn tratamiento previo a su inyeccin en el sistema de electroforesis capilar. Sin embargo, en las aguas de algn pozo, en las descalcificadas o en las de red, se ha observado que su alto contenido en algunos de los aniones da lugar a picos excesivamente grandes que se superponen entre ellos o que incluso llegan a eclipsar picos contiguos de otros aniones que se encuentran en menor concentracin, impidiendo su cuantificacin. Por este motivo conviene, en algunos casos, diluir estas muestras con agua ultrapura, siendo conscientes de que esto supondr un aumento de los lmites de cuantificacin y de la incertidumbre en los resultados obtenidos del anlisis. Por tanto, las muestras se diluyen desde 1:1 hasta, a veces, 1:10, en aquellas aguas muy salinas. Conviene, por consiguiente, un mtodo robusto para minimizar esta incertidumbre, y tener en cuenta que se debe diluir siempre lo mnimo posible. Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el anlisis, y luego se diluyen o no, en funcin de la concentracin de sus sales. 1.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrn de concentracin 1000 mg/l, en agua ultrapura, con las sales de cada uno de los aniones

XL (4), 160, 2003, 47-54

a analizar: cloruro de sodio (NaCl), nitrato de potasio (KNO3), sulfato de sodio decahidrato (Na2SO4.10H2O) y fosfato de dihidrogenopotasio (KH2PO4). A partir de estas soluciones se preparan, por dilucin, las soluciones patrn que se utilizarn para la cuantificacin de las muestras, mediante recta de calibracin. Estas soluciones patrn contienen todos los aniones a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l. Para la cuantificacin del nitrato en cerveza, debido a la baja concentracin en que se encuentra, la concentracin de este anin en los patrones ser de 1, 2, 5, 10 y 20 mg/l. 1.1.3. Condiciones electroforticas Para la separacin y anlisis de los aniones, las condiciones son las siguientes: Capilar: capilar de slice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 m de dimetro interno, con celda de deteccin de burbuja de 150 m (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies Tampn: Inorganic Anion Buffer for HPCE, pH 7.7 (p/n: 8500-6797) de Agilent Technologies Inyeccin: 200 mbar (50mbar*4seg) Polaridad: negativa (para que los aniones, que son los analitos, salgan en primer lugar) Voltaje: 25 kV Temperatura: 30 C Deteccin: fotometra indirecta, tomando como seal = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia = 245 nm (Bw: 10 nm), ya que los analitos no absorben en el UV-Visible, pero el tampn s, y por tanto cuantificamos la disminucin de la absorcin al pasar los analitos por la zona de deteccin. Antes de cada inyeccin se hace fluir tampn durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El anlisis durar unos 10 minutos.

tiene una forma ancha y poco simtrica que en algunas ocasiones puede hacer algo ms difcil su cuantificacin. Esto es debido a que el mtodo est adaptado para el anlisis de los aniones cloruros, sulfato y nitrato, que se pueden determinar satisfactoriamente con un tiempo de anlisis de tan slo 4 minutos. Alargando el tiempo de anlisis hasta 10 minutos el anin fosfato tambin se determina. Los ensayos de precisin, recuperacin, exactitud y linealidad estudiados muestran que el mtodo es totalmente vlido para estas determinaciones. Otra opcin sera analizar los cloruros, sulfatos y nitratos siguiendo este mtodo, y analizar el fosfato mediante otro mtodo ms especfico para este anin, para acortar tiempos de anlisis.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:10.

Se ha realizado una validacin del mtodo a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza y agua de red, calculndose los parmetros de precisin, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperacin de patrn aadido a la muestra para comprobar que la matriz no interfiere en el resultado. Los resultados obtenidos en la validacin se muestran en las siguientes tablas: % Recuperacin: El estudio de la recuperacin de cada anin en la matriz real se ha llevado a cabo mediante la adicin a tres alcuotas de 5 ml de muestra, de 100, 250 y 500 l de un patrn que contiene los cuatro aniones estudiados en una concentracin tal que las concentraciones finales de estas alcuotas con la adicin sean un 20%, un 50% y un 100% superiores, respectivamente, a la concentracin original de cada anin en la muestra. Despus a estas alcuotas con adicin se les realiza la misma dilucin que a las de muestra sin adicin y se analizan del mismo modo. Los resultados que se muestran en las tablas son los promedios de los porcentajes de recuperacin obtenidos con cada adicin. En todos estos aniones la recuperacin supera el 90%, indicando esto que, tanto en la cerveza como en las aguas estudiadas, la matriz no interfiere en el anlisis de dichos aniones y que, por tanto, la calibracin puede realizarse mediante recta de patrones externa. Precisin:

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:10.

1.2. Resultados Los tiempos de migracin promedio de los aniones analizados han sido los siguientes: Anin cloruro sulfato nitrato fosfato tM 2,82 2,95 3,16 7,84 min min min min

Se observa que el pico correspondiente al fosfato tiene un tiempo de migracin mucho mayor que los otros aniones y
CERVEZA Y MALTA 49

La precisin del mtodo para cada anin se ha determinado a partir del anlisis de 10 alcuotas procedentes de la misma muestra, calculndose el coeficiente de variacin entre las concentraciones obtenidas en cada alcuota. Segn los coeficientes de variacin mximos aceptados por Kolthoff y Horwitz para cada orden de concentracin de analito en las muestras, el mtodo cumple los requisitos de

XL (4), 160, 2003, 47-54

2. CATIONES EN AGUAS Y CERVEZA 2.1. Mtodo Siguiendo este mtodo se cuantifica la concentracin a la que se encuentran los cationes sodio, potasio, calcio y magnesio, en la cerveza y en las aguas utilizadas para su fabricacin. Del mismo modo, tambin se comprueba la ausencia del catin amonio, tanto en la cerveza como en las aguas. 2.1.1. Preparacin de la muestra Las muestras de agua no requieren de ningn tratamiento previo a su inyeccin en el sistema de electroforesis capilar. Sin embargo, al igual que en el mtodo para la determinacin de los aniones, algunas de las aguas presentan un alto contenido en algunos cationes, lo que hace necesario diluir las muestras con agua ultrapura para evitar que los picos del electroferograma se solapen. Normalmente, una dilucin 1:5 es suficiente, como en el caso del anlisis de muestras de agua de red que ha dado lugar a la tabla de resultados presentada ms adelante, pero en aguas como las descalcificadas, que tiene una alta concentracin en sodio, o las de pozo, pueden ser necesarias diluciones mayores, y en aguas como las osmotizadas y las mezcladas no suele ser necesario realizar ninguna dilucin. As pues, se precisa un planteamiento previo al tratamiento de muestra. Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el anlisis, y luego se diluyen 1:5 con agua ultrapura, por el mismo motivo que en las aguas. 2.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrn de concentracin 1000 mg/l, en agua ultrapura, con las sales cloruro de cada uno de los cationes a analizar: cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl), cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de magnesio (MgCl2) y cloruro de amonio (NH4Cl). A partir de estas soluciones se preparan, por dilucin, las soluciones patrn que se utilizarn para la cuantificacin de las muestras, mediante recta de calibracin. Estas soluciones patrn contienen todos los cationes a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l. 2.1.3. Condiciones electroforticas Para la separacin y anlisis de los cationes, las condiciones son las siguientes: Capilar: capilar de slice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 m de dimetro interno, con celda de deteccin de burbuja de 150 m (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies Tampn: Cation Buffer for HPCE (p/n: 5064-8203) de Agilent Technologies Inyeccin: 200 mbar (50mbar*4seg) Polaridad: positiva Voltaje: 30 kV Temperatura: 30 C Deteccin: fotometra indirecta, tomando como seal = 340 nm (Bw: 80 nm) y como referencia = 210 nm (Bw: 20 nm). Antes de cada inyeccin se hace fluir tampn durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El anlisis durar 5 minutos. 2.1.4. Mtodo especfico para el potasio En aquellas aguas con un contenido muy bajo en potasio, este catin se determina siguiendo un mtodo de electroforesis capilar diferente especfico para el potasio, que es ms sensible a este catin, para hacer posible su cuantificacin (siempre que su concentracin sea superior al lmite de cuantificacin que es de 2 mg/l). En este caso, la mues
50 XL (4), 160, 2003, 47-54

precisin exigidos, manteniendo una buena repetitividad con todos los aniones estudiados. En el caso del fosfato, su ausencia en agua de red no ha permitido el clculo de este parmetro en esta matriz. En cervezas s que se ha podido calcular, ya que en ellas s que encontramos este anin, procedente de la materia mineral de otras materias primas empleadas en su elaboracin. Linealidad: La linealidad en el rango de concentraciones trabajo se obtiene mediante el clculo del coeficiente de regresin cuadrado de la recta de calibracin de cada anin. Este coeficiente deber ser mayor de 0,99 para que se considere que la relacin entre las concentraciones y las reas de pico es lineal. Exactitud: La exactitud del mtodo se ha calculado a partir del error relativo entre la concentracin de los patrones obtenida por la cantidad pesada, y la concentracin calculada de cada uno de estos patrones mediante la interpolacin en las rectas de calibracin obtenidas. En las tablas se muestra el % error relativo promedio para cada anin. Para las concentraciones de los lmites inferior y superior de cada anin, se ha comprobado que cumplen el test de la t de Student para un intrvalo de confianza del 95%, calculando la t experimental segn la siguiente frmula: texp= (Xp Xc *n)/SR. Puesto que las concentraciones de los lmites son las que suelen presentar una mayor distorsin, podemos decir que el mtodo cumple los requisitos de exactitud en todo el rango de concentraciones de trabajo. Rango de trabajo: El rango de trabajo es el intervalo de concentraciones entre el patrn de menor concentracin y el de mayor concentracin. La concentracin de las muestras analizadas (una vez hecha la correspondiente dilucin) debe encontrarse dentro de este rango de trabajo, para que su concentracin pueda calcularse por interpolacin en la recta. El mtodo permite bajar el rango de concentraciones de trabajo siempre que sea necesario, sin sobrepasar los lmites de cuantificacin, que son de 1 mg/l para nitratos y sulfatos, de 3 mg/l para cloruros y de 5 mg/l para fosfatos. Esto se ha realizado sin problemas para la determinacin del nitrato (NO3-) en algunos tipos de aguas y cervezas, bajndose el rango a 1-20 mg/l, ya que en ellas este anin est ausente o en concentraciones extremadamente bajas. Estos resultados de la validacin indican que el mtodo ofrece resultados fiables y es vlido para la determinacin de la concentracin de cloruros, sulfatos, nitratos y fosfatos en cerveza y en aguas. Hay que tener presente que las muestras se deben diluir lo mnimo posible.
CERVEZA Y MALTA

tra no se diluye, ya que el mtodo est pensado para que ningn otro catin interfiera con el pico del potasio, y siendo la concentracin de potasio tan baja, si se diluyese la muestra no sera posible cuantificarlo. Para hacer la recta de calibracin se preparan patrones de potasio solamente, de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l en agua ultrapura, a partir de la solucin patrn de 1000 mg/l. Para la separacin y anlisis electroforticos, se utiliza el mismo capilar que para los cationes, y un tampn de preparacin propia 10 mM para-aminopiridina y 5 mM 18Crown, ajustado a pH de 6,1 con cido fosfrico. Las condiciones electroforticas son: inyeccin de 700 mbar (50mbar*14seg), polaridad positiva, voltaje de 30 kV, temperatura de 25 C y deteccin por fotometra indirecta, tomando como seal = 340 nm (Bw: 80 nm) y como referencia la = 210 nm (Bw: 20 nm). Antes de cada inyeccin se hace fluir tampn durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo, y el anlisis durar 3,8 minutos. 2.2. Resultados

El anlisis de cada inyeccin dura 5 minutos, pero se puede observar cmo en menos de 3 minutos (ms los 3 minutos de acondicionamiento del capilar) se obtiene el anlisis de cinco cationes. Con el mtodo especfico para el potasio, ste tiene un tiempo de migracin promedio de 1,255 minutos. En cerveza:

En agua de red:

Siguiendo la misma pauta que en el mtodo de los aniones, se ha realizado una validacin del mtodo a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza y agua de red, calculndose los parmetros de precisin, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperacin del patrn aadido a la muestra. Los resultados obtenidos se estn en las tablas que se muestran en esta pgina. En el agua de red analizada, el potasio se ha encontrado en concentraciones no cuantificables, es decir, por debajo de su lmite de cuantificacin, que con este mtodo es de 2 mg/l. Por este motivo, a pesar de haber sido analizado siguiendo el mtodo especfico para el potasio, que es ms sensible para este catin, no se ha detectado pico correspondiente al potasio que pudiese distinguirse bien del ruido de fondo. El clculo de la precisin, en este caso se ha realizado mediante el anlisis de 10 alcuotas del agua de red a la que se le haba adicionado patrn de potasio de forma que su concentracin final fuera de 5 mg/l. El estudio de la recuperacin muestra que la matriz no interfiere en el anlisis de estos cationes, siendo las recuperaciones medias de entre un 96,4% y un 99,9%. Las rectas de calibracin tienen unos coeficientes de regresin cuadrados superiores a 0,999 , lo cual indica una buena linealidad en el rango de concentraciones de trabajo de estos cationes, y los coeficientes de variacin estn dentro de los mximos aceptados por Kolthoff y Horwitz para su orden de concentracin, indicando esto una buena repetitividad del mtodo con todos los cationes estudiados. Respecto a la exactitud, cumple satisfactoriamente el test de Student para un intrvalo de confianza del 95% en todos los cationes estudiados, excepto en el sodio y en el potasio en cerveza, en los que el test no se ha cumplido para las concentraciones ms bajas. En el caso del potasio, esto queda solucionado al determinarlo mediante el mtodo especfico para l, tal como se ha hecho en el anlisis de las muestras de aguas. Y en el caso del sodio, esto coincide con la mayor variabilidad que ha presentado este catin en el anlisis de las aguas, pudiendo estar ambos hechos relacionados con el aumento de error que se genera al diluir las muestras. No se debe despreciar el hecho de que en las concentraciones altas el sodio s que cumple el test de Student, y de que, adems, cuenta con un error relativo bajo, pudindose considerar, en conjunto, como un resultado aceptable. En el caso de que interese obtener resultados de mayor exactitud en este catin, se puede optimizar el mtodo para este fin, disminuyendo el volumen de inyeccin para no tener que diluir las muestras o bajando el voltaje aplicado para aumentar la separacin

51 XL (4), 160, 2003, 47-54

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluida 1:5.

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de agua diluida 1:5.

Los tiempos de migracin promedio de los cationes analizados han sido los siguientes: Catin amonio potasio sodio calcio magnesio
CERVEZA Y MALTA

tM 1,43 1,57 1,85 2,00 2,11 min min min min min

entre los picos y as evitar que se solapen, an a costa de aumentar el tiempo de anlisis. Los lmites de cuantificacin alcanzados con este mtodo son de 5 mg/l para el sodio y de 1-2 mg/l para el calcio y para el magnesio. El anlisis del amonio se realiza con el nico objetivo de comprobar su ausencia, tanto en las aguas como en la cerveza. Igualmente, se ha estudiado su recuperacin, su exactitud y su linealidad en el rango de concentraciones de trabajo (de 5 a 100 mg/l), mediante patrones, para tener la certeza de que el anlisis de este catin es fiable. En ambas matrices se han obtenido unos resultados satisfactorios, con recuperaciones superiores al 90%, coeficiente de regresin cuadrado superior a 0,99 y una buena exactitud que cumple el test de Student para un intrvalo de confianza del 95%. Hay que sealar que en las muestras de cerveza aparece un pico en el electroferograma muy cerca del correspondiente al amonio, pero con un tiempo de migracin de 1,38 minutos, menor que el del amonio, que es de 1,43 minutos. Este pico proviene de otros componentes de la matriz de la cerveza, y no tiene nada que ver con el amonio, por lo que en este caso hay que fijarse cuidadosamente en los tiempos de migracin para que no haya confusiones. En el estudio de la recuperacin se pueden distinguir estos dos picos consecutivos en el electroferograma: el primero es el de la matriz y el segundo el del amonio aadido a la muestra.

bin se puede hacer una dilucin 1:10, para muestras que tengan una alta concentracin de alguno de estos cidos. 3.1.2. Patrones. Se preparan soluciones patrn de concentracin 1000 mg/l, en agua ultrapura, con cada uno de los cidos orgnicos libres, o sus correspondientes sales de sodio, que suelen encontrarse en la cerveza: cido oxlico, cido mlico, cido ctrico, cido succnico, cido lctico, piruvato de sodio y acetato de sodio. A partir de estas soluciones se preparan, por dilucin, las soluciones patrn que se utilizarn para la cuantificacin de las muestras, mediante recta de calibracin. Estas soluciones patrn contienen todos los cidos orgnicos a analizar y corresponden a las concentraciones de 5, 10, 25, 50 y 100 mg/l. 3.1.3. Condiciones electroforticas. Para la separacin y anlisis de los cidos orgnicos, las condiciones son las siguientes: Capilar: capilar de slice fundida de 48,5 cm de longitud efectiva y 50 m de dimetro interno, con celda de deteccin de burbuja de 150 m (p/n: G1600-60232) de Agilent Technologies Tampn: Organic Acids Buffer for HPCE (p/n: 8500-6785) de Agilent Technologies Inyeccin: 100 mbar (50mbar*2seg) Polaridad: negativa Voltaje: 20 kV Temperatura: 30 C Deteccin: por fotometra indirecta, tomando como seal = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia = 220 nm (Bw: 10 nm). Antes de cada inyeccin se hace fluir tampn durante 4 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El anlisis durar unos 7 minutos. 3.2. Resultados Los tiempos de migracin promedio de los cidos orgnicos analizados han sido los siguientes:

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza con una adicin de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio de 51.2, 500, 60, 32.5 y 100 mg/l respectivamente, y diluida 1:5.

cido Orgnico cido cido cido cido cido cido cido oxlico mlico ctrico succnico pirvico actico lctico

tM 2,00 2,45 2,51 2,66 2,82 3,02 3,12 min min min min min min min

Los resultados de la validacin indican que estos mtodos ofrecen resultados fiables y son vlidos para la determinacin de la concentracin de potasio, sodio, calcio y magnesio en cerveza y en aguas, teniendo en cuenta que para llegar a una mayor exactitud en el sodio debe optimizarse el mtodo para este fin especfico, al igual que se ha hecho con el potasio, estableciendo un mtodo especfico ms sensible para este catin que permite determinarlo a concentraciones ms bajas. Al igual que en el mtodo de los aniones, para evitar aumentos en la variabilidad, conviene diluir las muestras lo mnimo posible. 3. CIDOS ORGNICOS EN CERVEZA 3.1. Mtodo Este mtodo nos permite determinar de forma rpida los principales cidos orgnicos que suelen encontrarse en la cerveza ya elaborada. 3.1.1. Preparacin de la muestra Las muestras de cerveza se desgasifican antes de realizar el anlisis, y se diluyen 1:5 y 1:2 con agua ultrapura, para poder cuantificar correctamente todos los analitos sin que se solapen y por encima del lmite de cuantificacin. TamCERVEZA Y MALTA 52

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de cerveza diluda 1:5.


XL (4), 160, 2003, 47-54

Con este mtodo, el anlisis de cada inyeccin dura 7 minutos (ms los 4 minutos de acondicionamiento del capilar), sin embargo, en vista de los tiempos de migracin de los analitos, este tiempo se podra reducir a 5 minutos. Se ha dejado en 7 minutos ante la posibilidad de que alguno de los picos que salen despus del lctico pudiera ser de inters. Siguiendo la misma pauta que en los mtodos anteriores, se ha realizado una validacin del mtodo a partir de patrones de los analitos y muestras de cerveza, calculndose los parmetros de precisin, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperacin del patrn aadido a la muestra. Los resultados obtenidos en la validacin se muestran en la siguiente tabla:

4.1.1. Preparacin de la muestra Antes de realizar el anlisis, las muestras de mosto deben centrifugarse. El sobrenadante se debe pasar a travs de un cartucho Sep-Pak C18 y a continuacin a travs de un filtro de 0,45 m. Debido a la alta concentracin a que se encuentran algunos azcares en este tipo de mostos, las muestras se diluirn 1:100 con agua ultrapura, con el objetivo de que los picos no se solapen entre ellos y de que los azcares mayoritarios no eclipsen a los minoritarios. En algunos casos puede ser necesario realizar tambin una dilucin 1:25 para facilitar la cuantificacin de la fructosa y la sacarosa, que son los azcares minoritarios. 4.1.2. Patrones Se preparan soluciones patrn de concentracin 1000 mg/l, en agua ultrapura, con cada uno de los azcares a analizar: glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa y maltotriosa. A partir de estas soluciones se preparan, por dilucin, las soluciones patrn que se utilizarn para la cuantificacin de las muestras, mediante recta de calibracin. Estas soluciones patrn contienen todos los azcares a analizar y corresponden a las concentraciones de 50, 100, 250, 500 y 750 mg/l. 4.1.3. Condiciones electroforticas Para la separacin y anlisis de los azcares, las condiciones son las siguientes:

Excepto en el caso del cido actico, los resultados obtenidos en recuperacin, precisin y linealidad son satisfactorios, cumpliendo los lmites de aceptacin mencionados antes. En lo que se refiere a exactitud, el cido oxlico ha dado un error relativo medio algo alto, debido a que su factor de respuesta es muy pequeo. Sin embargo, este cido cumple el test de Student para un intrvalo de confianza del 95%, tanto en la concentracin alta como en la baja. Hay que sealar que los cidos ctrico, succnico, pirvico y actico, cumplen este test de Student en las concentraciones altas, pero no en las ms bajas, a pesar de que sus errores relativos no son muy grandes. Teniendo en cuenta que esta concentracin que sufre ms distorsin corresponde al lmite inferior del rango de trabajo, 5 mg/l, y todos los cidos estudiados se han encontrado a concentraciones superiores a los 25 mg/l, se puede considerar que esto no supondr un inconveniente para realizar el anlisis de estos cidos de forma satisfactoria. Los lmites de cuantificacin alcanzados con este mtodo son de 2-3 mg/l para el mlico y el ctrico, y de 4-5 mg/l para los otros, siendo estos lmites ampliamente superados por las concentraciones a las que estos cidos suelen encontrarse en la cerveza. El cido actico debe de analizarse mediante otro mtodo, ya que los resultados obtenidos de este cido no son tan buenos como los de los otros, debido a que en los patrones ms concentrados su cuantificacin se ve notablemente dificultada por lo que puede ser un desdoblamiento del pico o un pico interferente. Esto, sin embargo, no ocurre en las muestras de cerveza, en las que el pico del actico se puede distinguir con claridad y se cuantifica sin dificultad. A la vista de los resultados obtenidos, podemos concluir que este mtodo permite determinar las concentraciones a la que se encuentran los cidos oxlico, mlico, ctrico, succnico, pirvico y lctico en la cerveza, de manera simultnea en menos de 7 minutos de anlisis. A pesar de que en algunos de estos cidos el mtodo pierde algo de exactitud en las concentraciones ms bajas, esto no supone problema a la hora de evaluar los productos metablicos de la fermentacin para correlacionarlos con el sabor de la cerveza. 4. AZCARES EN MOSTO 4.1. Mtodo Este mtodo permite determinar la concentracin a la que se encuentran los azcares presentes en el mosto generado en el proceso de elaboracin de la cerveza y que acabar dando lugar a la cerveza.
CERVEZA Y MALTA 53

Capilar: capilar de slice fundida de 56 cm de longitud efectiva y 50 m de dimetro interno, con celda de deteccin de burbuja de 150 m (p/n: G1600-61232) de Agilent Technologies Tampn: 20 mM cido 2,6-piridindicarboxlico y 0,5 mM bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), ajustado a pH=12,3 con hidrxido de sodio 1N. Inyeccin: 200 mbar (50mbar*4seg) Polaridad: negativa Voltaje: 10 kV Temperatura: 20 C Deteccin: por fotometra indirecta, tomando como seal = 350 nm (Bw: 80 nm) y como referencia = 275 nm (Bw: 30 nm). Antes de cada inyeccin se hace fluir tampn durante 3 minutos por el capilar, para acondicionarlo. El anlisis durar unos 45 minutos. 4.2. Resultados Los tiempos de migracin promedio de los azcares analizados han sido los siguientes: Azcar fructosa glucosa maltosa maltotriosa sacarosa tM 24,11 25,63 26,27 26,69 33,65 min min min min min

Electroferograma obtenido a partir del patrn que contiene los cinco azcares a 250 mg/l.
XL (4), 160, 2003, 47-54

CONCLUSIONES Los resultados presentados en este artculo demuestran que la electroforesis capilar permite una buena linealidad y repetitividad en sus mtodos de anlisis, y alcanza lmites de cuantificacin suficientemente bajos, de entre 1 y 5 mg/l en aniones, cationes y cidos orgnicos. Comparndola con otras tcnicas habitualmente utilizadas para este tipo de anlisis, como el HPLC, las volumetras y las colorimetras, la electroforesis capilar ofrece grandes ventajas: Rapidez, con tiempos de anlisis muy cortos y anlisis simultneo de varios compuestos en una misma inyeccin, siendo capaz de determinar 4 aniones en 10 minutos, 5 cationes en 3 minutos y 7 cidos orgnicos en menos de 5 minutos. Sencillez, ya que prcticamente no requiere preparacin de la muestra, a diferencia de otras tcnicas como HPLC o las colorimetras. Alto grado de automatizacin. Prcticamente no tiene problemas de interferencia de la matriz. No genera residuos txicos ni perjudiciales para el medio ambiente, al contrario que el HPLC, que genera grandes cantidades de residuos de costosa y difcil eliminacin. Bajo coste, gracias a su automatizacin, a que consume muy poca cantidad de reactivos y a que no genera residuos txicos. Por tanto, la conclusin es que la electroforesis capilar es una tcnica rpida, sencilla y de bajo coste, fcilmente adaptable a las exigencias analticas de la industria cervecera. BIBLIOGRAFA DABRIO, M.V. et al. Cromatografa y electroforesis en columna. Springer. 2000. El estudio de la recuperacin muestra que la matriz no interfiere en el anlisis de estos azcares, siendo todas las recuperaciones medias superiores a un 90%. Las rectas de calibracin tienen unos coeficientes de regresin cuadrados superiores a 0,99, lo cual indica una buena linealidad en el rango de concentraciones de trabajo de estos azcares. Respecto a la exactitud, cumple satisfactoriamente el test de Student para un intrvalo de confianza del 95% en los cinco azcares estudiados, excepto en la maltotriosa, en la que el test no se ha cumplido para las concentraciones ms bajas, coincidiendo tambin con la obtencin de un mayor error relativo medio en este mismo azcar. Esto es debido a que el pico correspondiente a la maltotriosa est muy cercano al de la maltosa, produciendo esto un ligero error en su determinacin, despreciable a concentraciones medias y altas, pero algo ms significativo en las ms bajas. Sin embargo, esto no afectar a la correcta determinacin de la maltotriosa, ya que este es un azcar mayoritario en los mostos y normalmente lo encontramos a concentraciones bastante altas. Los cinco azcares cumplen los requisitos de precisin exigidos para su orden de concentracin, aunque la maltotriosa y la sacarosa estn en el lmite, debido a la proximidad entre el pico de la maltotriosa y el de la maltosa, y al elevado tiempo de migracin de la sacarosa, que implica una mayor variabilidad. Una menor dilucin de la muestra, por ejemplo 1:25, permitir una mejor cuantificacin de los dos azcares minoritarios, fructosa y sacarosa, y por tanto, al ser sus picos ms grandes, se obtendr mayor precisin y exactitud en sus resultados. Los resultados obtenidos muestran que el mtodo permite una correcta cuantificacin de estos cinco azcares (fructosa, glucosa, maltosa, maltotriosa y sacarosa) en los mostos. SOGA, T., WAKAURA, M Determination of Inorganic and Organic Anions in Beer and Wort by Capillary Electrophoresis. J.Am.Soc.Brew.Chem. 55 (2), 44-46, 1997 SOGA, T. Analysis of Inorganic and Organic Anions by Capillary Zone Eletrophoresis. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5965-5744E, 1996. SOGA, T., ROSS, G.A. Capillary Electrophoretic Determination of Inorganic and Organic Anions using 2,6-pyridinedicarboxylic acid: Effect of Electrolytes Complexing Ability. J. Chromatogr. A, 767 (1997) 223-230. SOGA, T. Simultaneous Analysis of Inorganic Anions, Organic Acids, Amino Acids and Carbohidrates using the Agilent Basic Anion Buffer. Agilent Technologies Application Note, Publication Number 5968-7715E, 2000. SOGA, T., SERWE, M. Rapid Monitoring of Carbohydrates in Food with Capillary Electrophoresis. Agilent Technologies Application Note, Publication Number 5968-69855E, 1999. SOGA, T. Capillary Zone Electrophoresis of Carbohydrates by Borate Complexation Utilizing EOF Reversal. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5964-1817E, 1995. SOGA, T. Protein Characterization by Peptide Mapping Using Capillary Electrophoresis. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 5962-9801E, 1993. HEIGER, D., WEINBERGER, R. Determination of Small Ions by Capillary Zone Electrophoresis with Indirect Photometric Detection. Hewlett-Packard Application Note, Publication Number 12-5963-1138E, 1994. ROSS, G.A. Instrumental Validation in Capillary Electrophoresis and Checkpoints for Method Validation Accred. Qual. Assur. (1997) 2:275-284.
54 XL (4), 160, 2003, 47-54

Electroferograma obtenido a partir de una muestra de mosto diluida 1:100.

Siguiendo la misma pauta que en los mtodos anteriores, se ha realizado una validacin del mtodo a partir de patrones de los analitos y muestras de mosto, calculndose los parmetros de precisin, exactitud, linealidad en el rango de concentraciones de trabajo y recuperacin del patrn aadido a la muestra. Los resultados obtenidos en la validacin se muestran en la siguiente tabla:

CERVEZA Y MALTA