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1. Fundamentos de la Cromatografía
La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos
basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al
ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho
cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las
propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con
respecto a la fase móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la
diferencia en la migración de los mismos.
2. Tipos de fase estacionaria y móvil.
3. Interacción analito-fase estacionaria.
4. Velocidad de migración.
5. Tiempo de retención.
6. Soportes de fase estacionaria.
7. Diseño general del Instrumental:
carriers
inyectores
columnas
detectores
procesadores
transductores de señal.
Cromatografía de gases
1. Manejo de muestras sólidas, líquidas y gaseosas.
2. Proceso de Análisis:
1) Inyección de la muestra.
2) Elección de la columna adecuada.
3) Sistema de detección.
4) Información Analítica
5) Aplicación Ambiental del Método.
1.1.3.5.2. Principios
La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los
componentes separados eran colorantes. Se
define como una técnica o método físico de
separación basado en las diferentes
velocidades con que se mueven los solutos
disueltos en un disolvente llamado eluente
(fase móvil) a través de un medio
estacionario o fijo. Los componentes a
separar se distribuyen entre la fase
estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa
a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como
los componentes de
la mezcla presentan
diferente tendencia a
permanecer en
cualquiera de las
fases, la separación
se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria
y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas
que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido que
las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que
tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separación
entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o
gaseosa
Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son
la adsorción y la absorción. El primero queda delimitado a la superficie
interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia
entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de la
naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El
segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de
la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.
1.1.3.5.3.6. Cromatografía de
intercambio iónico.
La Fase Estacionaria es una resina de
intercambio iónico que contiene grupos
cargados, teniendo la propiedad de
separar especies ionizadas (Cationes o
Aniones); la Fase Móvil es generalmente
una solución amortiguadora de pH. En
proteínas la cromatografía de
intercambio iónico se basa en las
diferencias en signo y magnitud de la
carga eléctrica neta de las proteínas a
un valor de pH determinado. La afinidad
de cada proteína a los grupos cargados
de la columna esta influenciada por el
pH y por la concentración de iones en
solución (concentración salina) que
compiten con la proteína en la
interacción con la matriz. La separación
de la
proteína
de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH
y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere
un gradiente de concentración.
Tipos de cromatografía
Naturaleza de fase
estacionaria
Cambio iónico
Afinidad
Líquido Partición
Gas-sólido (CGS)
Cromatografía de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de
naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas)
denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a
los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las
separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.
Fundamento de la
cromatografía de
afinidad
En la figura se
muestra de forma
esquemática el
fundamento de las
separaciones mediante
cromatografía de
afinidad. Un volumen no
excesivamente grande
de muestra de
naturaleza biológica se
introduce en la columna
que contienen un
soporte polimérico
inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de
afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la
muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes
de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se
introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios
activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de
pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez
finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace
mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de
otros tipos de cromatografía líquidas
Ligandos de afinidad
Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido
inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse
dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien
moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas,
respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que
condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos:
Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los
ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas
y nucleótidos.
Esquema de un cromatograma de afinidad.
Soportes
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de
afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable,
porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de
proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
Inmovilización de ligandos
La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene
connotaciones específicas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces
químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos
posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando
bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:
- Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de
los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la
gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz
de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e
imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa
produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando
que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte
activado.
Metodos de elución
Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta
la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución
como:
Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado
inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que
interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el
ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución
por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el
sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica
la normal y la invertida.
La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente.
El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso
molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por
el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la
lectina.
La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una
biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil
provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar
glucoproteína.
En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del
soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo,
de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de
las causas que la provocan.
TERMINO
Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras
que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.
Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.
Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la
concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en
el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama"
puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la
pared interior de la columna.
Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre
la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras
un recubrimiento.
Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida.
Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico
(Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas
Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la
expresión Eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los
componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan
abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografía plana.
Efluente. La fase móvil que abandona la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el
lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser
retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a
tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito
para un componente de la muestra
Métodos principales
Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma
continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional
Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el
desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La
muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o
a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una
pequeña cantidad en un tiempo breve.