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CROMATOGRAFIA EN PLACA FINA

CTEDRA:
ANALISIS DE ALIMENTOS

CATEDRTICO:
ING. JOSE LUIS

INTEGRANTE:
CRISTOBAL ORE BEATRIZ

SEMESTRE:
VI
HUANCAYO PER
2012

ANALISIS DE ALIMENTOS

I.- INTRODUCCIN
En esta prctica se pretenden identificar los componentes de una disolucin.

Esta

puede

estar

formada por compuesto desconocidas para nosotros siendo la mezcla completamente aleatoria. Para ello el
mtodo a utilizar ser la cromatografa.

Con este mtodo experimental podremos separar los componentes de una disolucin desconocida para
luego compararlos con diferentes disoluciones patrn. La tcnica a utilizar no se corresponde de manera
especfica con su nombre, puesto que no apreciaremos ninguna diferencia de color entre los diferentes
componentes. El nombre de la tcnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de
plantas como la clorofila, los cuales tienen colores definidos. Estos primeros pasos los dio el botnico ruso de
origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas.

La tcnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una
fase mvil sobre una estacionaria que puede ser slida o liquida. Esta diferencia ser la que nos permita tanto
identificar cuantos componentes tiene una disolucin como separarlos.

Objetivos de la prctica.

Aprendizaje de la tcnica de cromatografa en capa fina

Conocimiento de conceptos cromatogrficos: polaridad, fase mvil, fase estacionaria, factor de


retencin, etc.

Determinacin de los componentes orgnicos presentes en una muestra usando sustancias patrn.

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II.- FUNDAMENTO TERICO


La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de
desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o
gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser slida o lquida.

Las tcnicas cromatogrficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, en
ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatogrfico con el de sustancias
conocidas empleadas como patrn.

La base de la tcnica es que cuando un determinado soluto interacta con dos fases, una de ellas,
habitualmente slida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorcin en fase slida,
solubilizacin en cada fase, arrastre por la fase mvil, etc.) que, en ltimo extremo, llevan a que el soluto se
reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es
constante, y se denomina coeficiente de reparto. Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente de
reparto diferente del de los otros, la separacin ser buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la
naturaleza de las fases, as como de las condiciones de la cromatografa.

Una de las tcnicas cromatogrficas ms sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada as porque la
fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de slice, almina, etc.) extendida para su manejo
mecnico sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que
emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra ms o menos a
los componentes de una mezcla en funcin de sus mayores o menores coeficientes de reparto.

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El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su lugar, y relacionado con l, se emplea el
denominado Rf, caracterstico de cada sustancia, definido como la relacin entre la distancia que recorre dicha
sustancia y la que recorre la fase mvil. Las ms insolubles tendrn, en el disolvente empleado, un Rf prximo a
cero, mientras las ms solubles se acercarn a uno.

La cromatografa es una tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras de mezclas
complejas. Esta tcnica depende del principio de adsorcin selectiva (no confundir con absorcin). La
cromatografa fue descubierta por el botnico ruso, de origen italiano, Mikhail Tswett en 1906, pero su uso no se
generaliz hasta la dcada de 1930. Tswett separ los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de
hojas verdes en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta.
A medida que la solucin va filtrndose por la columna, cada componente de la mezcla precipita a diferente
velocidad, quedando la columna marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas.
Cada banda corresponde a un pigmento diferente.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a cualquier mezcla
soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatogrficas y
no cromatogrficas. La eleccin de una tcnica cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de
la muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible. Para explicar el
fenmeno cromatogrfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y
otro prximo

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico
qumicas de los analtos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos),
volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en
una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por
duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa liquido - liquido.
Deben cumplirse las condiciones siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.

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Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten
cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico
dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica.
Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las dos fases en un equilibrio dinmico,
se tiene la realidad del fenmeno cromatogrfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases,
denominada fase mvil, fluye a travs de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece inmvil,
y que, al menos en una extensin esta en equilibrio con la fase mvil.
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so movilidad entre si y con respecto a
la fase mvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los componentes de
la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia
en la velocidad de migracin de los mismos.
La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a cualquier
mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin suelen dividirse en dos grandes grupos:
cromatogrficas y no cromatogrficas. La eleccin de una tcnica cromatogrfica concreta depender de la
naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo
asequible
Puede hacerse una primera distincin entra las tcnicas cromatogrficas atendiendo a la integracin
continua o no del sistema de deteccin. As, la cromatografa no conlleva a un sistema de deteccin, mientras
que cualquier cromatgrafo de lquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, autnticos
instrumentos.
Clasificaciones:
Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficos es necesario atender a dos criterios bsicos:
Fundamento del proceso cromatogrfico, lo que conduce a los tipos de cromatografas

Forma de realizar el proceso cromatogrfico , es decir, lo que constituye las distintas tcnicas

cromatogrficas

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Tipos de cromatografas:
Si es un slido, cabe distinguir entre:
Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o
gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals)
Cromatografa de cambio inico: el slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas)
Cromatografa de exclusin (o de geles ), el slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que
retienen a las molculas de soluto segn su tamao.
Cromatografa de afinidad: es un tipo especial de cromatografa de absorcin, utilizada especialmente en
bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un
indicador enzimtico o un anticuerpo
Si es un lquido que se encuentra soportado en un slido inerte, se trata de la Cromatografa de particin.
El soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o gas) y la fase estacionaria.
Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el nombre de
dicha fase mvil:
Si es un lquido, cromatografa liquida, cabe distinguir:

Cromatografa liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de una
cromatografa de particin.

Cromatografa liquido-slido (CLS) en la que la fase estacionaria es slida (adsorcin, cambio inica,
exclusin, afinidad).

Si es un gas, cromatografa de gases, puede ser:

Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.

Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.

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Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crtica, pero
simultneamente comprimido a una presin mayor que su presin critica), se trata de la cromatografa de fluidos
supercrticos (CFS), que puede ser de particin o de adsorcin.
Tcnicas cromatogrficas:
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el dispositivo utilizado
para conseguir entre la fase mvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en
columna y plana.
Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria
y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se
consigue: 1)por presin, 2)por capilaridad, 3) por gravedad.
Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el trmino de cromatografa en columna
suele aplicarse a la cromatografa liquida para distinguirla de la cromatografa plana ya que, obviamente la
cromatografa de gases solo puede realizarse en columna.
Cromatografa plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es
tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimensional.
Se divide en dos tipos generales:

Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografa de
particin).

Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografa de
particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio.
El flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografa horizontal y

ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente). En la cromatografa plana queda


excluido el uso de un gas como fase mvil, por lo que sta siempre es lquida.

CROMATOGRAFA PLANA:

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La cromatografa plana es un tipo de cromatografa liquida en la que la fase estacionaria esta extendida
sobre la superficie de un plano y la fase mvil fluye a travs de ella. La fase mvil siempre es un lquido,
mientras que la fase estacionaria puede ser un lquido soportado en un slido (cromatografa de particin) o un
slido solvente (cromatografa de adsorcin, cambio inico o exclusin). El flujo de la fase mvil se produce:
Por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente)
Por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente)

Esta clase de cromatografa es considerada la ms simple de todas las tcnicas cromatogrficas. La


diferencia principal con la cromatografa en columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar
la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenmeno en que se fundamenta la separacin, es el mismo para
ambas tcnicas. En la cromatografa plana, la disolucin de la muestra a separar se sita sobre el plano que
contiene la fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de
dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone en contacto con
la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en una cmara cerrada. La separacin se produce por
migracin diferencial de los componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil.

Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa plana el analito no


abandona el lecho cromatogrfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase mvil ha alcanzado una
determinada zona del plano.
Cabe distinguir dos tipos de cromatografa plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).

La cromatografa en papel tuvo su mximo desarrollo en, os aos cincuenta pero en la actualidad se
encuentra prcticamente eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografa en capa
fina. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas tcnicas cromatogrficas se dedican a

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la cromatografa en papel. En esta tcnica, la celulosa acta como soporte de la fase estacionaria que suele ser
agua (cromatografa de particin). No obstante, tambin existen en el comercio papeles impregnados (v.i. como
gel de slice o almina, con silicona para separaciones en fase invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas
qumicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la
aplicabilidad de esta tcnica.

En cromatografa en capa fina, un slido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de
capa sobre el plano de una superficie rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de forma que la fase
mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de
particin, adsorcin, cambio inico o exclusin.

Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una tcnica cualitativa simple y rpida,
para separar mezclas no demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa
frente a otras tcnicas cromatogrficas como la CLAR. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios
introducidos en esta tcnica, en lo que se refiere a la calidad de los solventes, equipos para aplicar y la muestra y
sistemas de deteccin, el inters por la CCF ha vuelto a renacer, siendo considerada una tcnica til para separar
y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. Estos cambios han llevado a
modificar el nombre de la tcnica, denominada cromatografa en capa fina de alta resolucin (CCFAR o HPTLC
en la bibliografa inglesa), al igual que ocurri cuando se mejoro la capacidad de resolucin de la cromatografa
liquida en columna, pasando a denominarla cromatografa liquida de alta resolucin (CLAR o HPLC)

La cromatografa en capa fina de adsorbentes se ha mejorado (Stahl y Kaltenbach; 1961) usando


sustancias pulverizadas que se adhieren al vidrio. Esto ha permitido usar otros soportes con diferentes
propiedades, por ejemplo slice y kieselguhr. Se dispone de aparatos para recubrir placas de vidrio para la CCF*,
pero ahora se estn usando ampliamente placas de vidrio pre recubiertas, pelculas plsticas rgidas y hojas
delgadas de aluminio, existentes en el comercio. La CCF* es mas sensible, adaptable y rpida que la
cromatografa en papel y las separaciones cromatogrficas son ms eficientes y pueden ser semicuantitativas.

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Se pueden preparar o adquirir en el comercio placas que no contengan materia orgnica y produciendo la
visualizacin de las manchas por carbonizacin con acido sulfrico. Puede ser muy efectiva la visualizacin bajo
luz UV despus de haber rociado la placa con un reactivo fluorescente, cuando los compuestos que se han
separado destruyen o modifican la fluorescencia. La CCF es el mtodo mas barato y a menudo el mejor para
aislar e identificar componentes menores de los alimentos. El componente separado puede ser raspado de la
placa, extrado del material de sta y despus sometido a anlisis por espectrometra o por cromatografa gas
liquido. ** La CCF puede ser totalmente cuantitativa, como en la determinacin de acido erucico. Se cuenta con
una revisin reciente de la cromatografa en capa fina.

Ms recientemente se ha aplicado la tecnologa usada en la preparacin del empaque con microparticulas


para columna en la cromatografa liquida a alta presin a la CCF introduciendo la llamada Cromatografa en
Capa Fina Alta Presin (HPTLC)* (CCFAP) . Se cuenta con placas pre recubiertas para CCFAP que presentan
resolucin y sensibilidad ms elevadas que las placas normales. Estas placas requieren cargas menores de la
muestra y se pueden realizar ms pruebas por placa con menores corridas de desarrollo (30 a 60 mm) y los
anlisis son mas rpidos. La alta resolucin de los geles de slice con microparticulas que se usan, posibilitan la
CCF cuantitativa directa. Ha aparecido una revisin

El uso de la cromatografa en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el nmero y
la cantidad relativa de los diferentes aminocidos presentes en una muestra (anlisis cualitativo), aunque para los
anlisis cuantitativos es necesaria la cromatografa de gases o un analizador de aminocidos.

Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina es la de servir como gua para el desarrollo
de las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna. Proporciona
una idea rpida de los aminocidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son
la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinin
de que los ensayos en capa fina deberan preceder siempre al uso de la columna.

En la cromatografa de papel se pueden aplicar grandes volmenes de muestra, lo que permite la elucin
posterior de un aminocido en particular para su posterior purificacin y anlisis, factor que tiene gran
importancia en la identificacin de un constituyente desconocido de la muestra.

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Antes de la realizar la cromatografa, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como
protenas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio inico. Los aminocidos
retenidos pueden eluirse a continuacin aadiendo a la columna un pequeo volumen de amoniaco y lavando
despus con agua destilada. La separacin de los aminocidos se basa en que stos se reparten de modo
diferencial entre la fase mvil y la fase estacionaria.

Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa


cromatogrfica en el eluyente que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la
superficie del la placa.

La identificacin de un aminocido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retraso: cociente


entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el
origen), con otros tomados como referencia, debindose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos
para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.

La naturaleza de los aminocidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los
diferentes solventes pueden permitir una mejor resolucin de los componentes cidos, bsicos o neutros. En
general, aumentando la proporcin de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e
introduciendo pequeas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminocidos
bsicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso
rutinario.

La composicin qumica del disolvente puede tambin limitar el rango de reactivos de localizacin que
pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el cido sulfanlico no puede utilizarse con disolventes
fenlicos.

El poder de resolucin de la cromatografa de capa fina puede aumentarse empleando tcnicas


bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la
utilizada generalmente para la separacin cromatogrfica de una dimensin (aproximadamente el triple) en una
esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensin. Entonces el cromatogramas se seca completamente

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al aire, se gira un ngulo de 90 y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el
reactivo de localizacin elegido. En la cromatografa de dos dimensiones, la composicin de los dos disolventes
es la que determina el orden en que debe utilizarse.

Las separaciones bidimensionales permiten la resolucin de un gran nmero de aminocidos presentes


en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensin se separan en la segunda.
Esto es muy til en la deteccin de los componentes que estn en muy baja concentracin y pueden quedar
enmascarados por otros compuestos que tengan una concentracin alta cuando se utiliza la cromatografa en una
dimensin.

Aplicacin de las muestras


Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente orgnico que tenga un
punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin, lo ms comn es usar
acetona. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g
de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga
puede llegarse a observar un 5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la
muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta
del capilar (micropipeta, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centmetro
aproximadamente. El punto de aplicacin de la muestra se denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo
quedar la muestra a analizar.

Eleccin del eluyente


La eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del material en que la separacin
se lleva a cabo. Un mtodo que se emplea para la seleccin del eluyente es una cromatografa en capa fina con
distintos disolventes y unas muestras patrn.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

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Eter de petrleo. Eter dietlico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.*
Etanol. Cloroformo.* Metanol. Diclorometano. Agua. cido actico.

compuestos cancergenos.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:


Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). No utilizar compuestos muy voltiles. Evitar
que contengan trazas de metales (catalizadores). La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que
estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.


b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.

Al aplicar en primer lugar eluyente poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros
eluyente ms polares, hasta dar con el ms apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas
suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyente sobre el centro de cada muestra. Esto permite
desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la
separacin se realiza de una manera ms eficaz. la cromatografa

Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el mtodo ascendente, esto es, al
permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa
se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las paredes
se impregnan del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la
saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa
preparativa puede llegar a un par de horas.

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Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a
una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia
es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del desarrollo, las placas pueden
secarse rpidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del
eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del
eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos, para ello
existen dos tipos de mtodos:

Mtodos qumicos Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes
separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes
orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente
sealar las manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los componentes
orgnicos produciendo manchas negras.
Tambin es utilizado el permanganato potsico, que deja unas manchas de color amarillo. El tamao de las
manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos. El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al
colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen
manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa
fluorescente excepto donde hay componentes.

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Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados
directamente en una lmpara de ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una
placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como: RF= Distancia de la
muestra desde el origen/Distancia del eluyente desde el origen

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los clculos
se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de RF que
se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.

Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con
varios eluyente. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad
que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales
o no serlo.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u
otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores
qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indicador ultravioleta.

Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga una
posicin de desarrollo conveniente; todos los dems compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta
manera se tiene el , RX , ya que: Rx= Distancia recorrida por el compuesto de referencia(X)/Distancia recorrida
por el eluyente.

Proceso de Adsorcin
La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas
electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la

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capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del
adsorbente y la sustancia con el solvente.
Adsorbentes
Los adsorbentes ms utilizados en la Cromatografa de Capa Fina son:

Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)

Tierra Silcea Kieselguhr

Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas:

Tamao de Partcula

Volumen de Poro

Dimetro de Poro

rea Superficial

Homogeneidad

Pureza

Preparacin de la Placa Cromatogrfica

Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (Ej.: Aluminio). Los

tamaos de la placa para TLC convencional son: 20 cm. x 20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm.


Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia: F 254 F366. El nmero que aparece como
subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado.

Aplicacin de la muestra
La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en:

Banda

Punto Mancha

Desarrollo de la Placa
Es un proceso mediante el cual son trasportados a travs de la fase estacionaria por la fase mvil.
Cmaras para Desarrollo
Existen varios tipos de cmaras:

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Normal

Horizontal

Doble Compartimiento

Vario KS

Sndwich

Deteccin Visualizacin

Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los)
componente(s) presentes. Tambin se conoce este procedimiento como Revelado.

Estos mtodos son:

Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen derivados coloreados o fluorescentes

Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacin UV

Evaluacin de un Cromatograma de Capa Fina

Anlisis Cualitativo

Medida de Rf

Comparacin Visual de Color/Intensidad

Propiedades UV/IR/MS/NMR

Anlisis Cuantitativo
Semi-cuantitativo
Comparacin visual del dimetro y la intensidad del color de la mancha contra una serie de
manchas patrones de concentracin conocida

Cuantitativo

Indirecta

Directa

Densitometra

Medida de Transmisin. Medida de luz transmitida a travs de la substancia.

Medida de Emisin. Medida de luz reflejada desde la substancia

Espectrofotometra
Fluorescencia

ANALISIS DE ALIMENTOS
Fluorescencia con "quenching"

III.- MATERIALES Y MTODOS

Materiales:

4 placas de cromatografa

1 probeta de 10 ml

2 vasos de precipitado de 100ml

Varillas de vidrio

2 Placa Petri

Reactivos:

Acetona de lavar

Acetato de etilo

Hexano

Patrn 1: Mentol

Patrn 2: Acetoacetato de etilo

Patrn 3: Pirogalol

Patrn 4: Floroglucina

Patrn 5: Benzofenona

Muestra problema P1

Muestra problema P2

Revelador anisaldehdo (225 ml etanol + 12 ml anisaldehdo + 13 ml H 2SO4)

Obtencin de capilares:

Para la realizacin de la prctica se deben de obtener 7 capilares de 10 cm aproximadamente,

uno para cada muestra ya sea patrn o problema. Se podra hacer solo un capilar para las 7 muestras, pero ello
conllevara que fuese limpiado el capilar cada vez que lo usemos con una muestra distinta a la anterior, con lo
que se iran arrastrando errores.

ANALISIS DE ALIMENTOS

Para la realizacin de los capilares, se tomar una varilla de vidrio de unos 15 cm

aproximadamente, esta ser calentada en un mechero Bunsen hasta q se reblandezca la seccin que estamos
calentando. Llegado a este punto, apartamos la varilla de la llama y rpidamente estiramos axialmente.

Realizacin de la cromatografa en capa fina:

En este apartado se realizaran 4 placas de cromatografa 4'5 x 5 cm, las cuales solo se podrn

coger por los bordes y nunca tocar la parte de celulosa (la blanca), porque ello acarreara errores en la medicin.

Una vez obtenidas las placas, marcamos a lpiz una lnea a 1 cm de la base. Sobre esa lnea

marcamos 7 puntos, donde se depositaran con los capilares pequeas cantidades de las muestras.

En los vasos de precipitado, que actan como tanque de elucin, se pondrn las disoluciones.

Utilizaremos 4 disoluciones de acetato de etilo (Ae) y hexano (Hex), cuyas composiciones sern del 20, 40, 60 y
80 % de Ae/Hex. Solamente utilizaremos 5 ml de cada disolucin, la cual no debe sobrepasar la lnea dibujada a
lpiz.

Finalmente se revelarn las placas usando dos agentes reveladores:

Revelador fsico, usaremos una lmpara de rayos UVA, donde pondremos con unas pinzas las placas
cromatogrficas. Las marcas que aparezcan se sealarn con lpiz.

Revelador qumico, una vez pasada la placa por los rayos UVA, se introducir con una pinza en un
revelador anisaldehdo y posteriormente ser colocada en una placa calefactora a 100 C. Finalmente
anotamos los colores obtenidos.

ANALISIS DE ALIMENTOS

IV.- RESULTADOS

Para el clculo del factor de retencin, Rf, se usar la siguiente expresin:

Rf = distancia recorrida por el compuesto; distancia recorrida por el disolvente

Se tomar como distancia del compuesto la distancia comprendida entre la lnea trazada donde se ha
depositado el compuesto y el centro de la mancha.

Placa 1

Sistema eluyente: 20% Ae/Hex

Distancia recorrida por el disolvente: 35 mm

Patr

Recorrido

(mm)

Rf

24

0.685

17

0.485

0.057

27

Placa 2

0.771

U
V

Color

Azul

Rojo

N
o

S
i

S
i

S
i

S
i

Nombre

Mentol
Acetoacetato
de etilo

Violeta

Pirogalol

Amarillo

Floroglucina

Incoloro

benzofenona

ANALISIS DE ALIMENTOS

Sistema eluyente: 40% Ae/Hex

Distancia recorrida por el disolvente: 36 mm

Patr

Recorrido

(mm)

Rf

30

0.833

26

0.722

0.250

0.111

31

0.861

Placa 3

Sistema eluyente: 60% Ae/Hex

Distancia recorrida por el disolvente: 37 mm

Patr

Recorrido

(mm)

Rf

34

0.918

30

0.810

21

0.567

14

0.378

35

0.945

U
V

Color

Azul

Rojo

N
o

S
i

S
i

S
i

S
i

S
i

Pirogalol

Incoloro

benzofenona

Color

Azul

Rojo

Violeta

de etilo

Floroglucina

Acetoacetato

Mentol

Amarillo

Nombre

Nombre

Mentol
Acetoacetato
de etilo

Violeta

Pirogalol

Amarillo

Floroglucina

Incoloro

benzofenona

ANALISIS DE ALIMENTOS

Placa 4

Sistema eluyente: 80% Ae/Hex

Distancia recorrida por el disolvente: 37 mm

Patr

Recorrido

(mm)

Rf

34

0.918

32

0.864

28

0.756

23

0.621

35

0.945

U
V

Color

Azul

Rojo

N
o

S
i

S
i

Nombre

Mentol
Acetoacetato
de etilo

Violeta

Pirogalol

Amarillo

Floroglucina

Incoloro

benzofenona

S
i

V.- DISCUSIONES

En algunas placas no se ve el mentol, esto es debido a que es posible q hayan habido otras reacciones las
cuales impiden poder valorarlas.

En el factor de retencin, las distancias han sido medidas con una regla a simple vista, por lo que los
valores de polaridad no son exactos sino una simple aproximacin.

ANALISIS DE ALIMENTOS

VI.- CONCLUSIONES

La tcnica de cromatografa en capa fina (CCF) tiene numerosas ventajas, aparte de ser rpida, sencilla,
barata... tiene tambin la ventaja de utilizar poca cantidad de muestra.

Las muestras problemas P1 y P2 son mezclas de muestras patrn, siendo P1 una mezcla de floroglucina
y mentol, y P2 una mezcla de Pirogalol y Benzofenona. Esto lo hemos averiguado gracias a las muestras
patrn, ya que al ser las muestras problema mezclas entre ellas, al meterlas en el tanque de elucin, el
disolvente subir por la placa e ir separando la mezcla, dejando abajo el patrn ms polar. Luego,
gracias a los reveladores fsicos y qumicos, se ve que esta compuesta la mezcla problema.

A partir del factor de retencin sabremos que sustancia es ms polar, siendo el mas polar aquel que tenga
un Rf menor.

benzofenona > mentol > acetoacetato de etilo > pirogalol > floroglucina

+ Polar - Polar

VII.- BIBLIOGRAFIA
http://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.shtml
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin.htm
http://html.rincondelvago.com/cromatografia_2.html

ANALISIS DE ALIMENTOS

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Medicina/PracticasLaboratori
o/Practica05.htm

VIII.- ANEXOS

Caractersticas y beneficios

ANALISIS DE ALIMENTOS

Estndares de calidad estrictos que garantizan un nivel consistente de resolucin, precisin y


reproducibilidad

Apto para el proceso de varias muestras y estndares simultneamente bajo condiciones idnticas.

Amplio rango de qumica para responder a sus necesidades

Preparacin de muestra simplificada en placas desechables

Compatibilidad entre fase mvil sin necesidad de detector

Disponible con o sin indicador fluorescente