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Construcción y optimización de rutas sintéticas en ingeniería
metabólica
Dokyun-na1, Tae Yong Kim1y Sang Yup Lee1,2
La ingeniería metabólica nos ha permitido desarrollar cepas adecuadas para
su uso como fábricas microbianas de productos químicos y materiales de
fuentes renovables. Recientemente se ha vuelto más poderoso con los
avances en biología sintética, lo que nos permite crear circuitos metabólicos
y reguladores novedosos y bien controlados que maximizan los flujos
metabólicos a los productos deseados en la cepa que se está desarrollando.
Esto nos permite diseñar microorganismos anfitriones para mejorar sus
capacidades metabólicas innatas o para obtener nuevas capacidades en la
producción de compuestos objetivo. Aquí revisamos las vías sintéticas
construidas recientemente que se han aplicado con éxito para producir
productos químicos no innatos y también discutimos los enfoques recientes
desarrollados para aumentar la eficiencia de las vías sintéticas para lograr
una mayor productividad de los bioproductos deseados.
direcciones
1Laboratorio Nacional de Investigación de Ingeniería Metabólica y
Biomolecular, Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular (Programa
BK21), Centro de Investigación de Ingeniería de BioProcesos, Centro de
Sistemas y Biotecnología Sintética, Instituto para el BioCentury, Instituto
Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST), Daejeon 305- 701,
República de Corea
2Departamento de Bioingeniería y Cerebro, Departamento de Ciencias
Biológicas y Centro de Investigación de Bioinformática, KAIST, 335
Gwahangno, Yuseong-gu, Daejeon 305-701, República de Corea
Autor para correspondencia: Lee, Sang Yup (leesy@kaist.ac.kr)
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
Esta revisión proviene de una edición temática sobre
Biología de Sistemas
Editado por Jens Nielsen y Marc Vidal
Disponible en línea el 10 de marzo de 2010
1369-5274/$ – ver portada
# 2010 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
DOI10.1016/j.mib.2010.02.004
Introducción
En ingeniería metabólica, el metabolismo celular, representado
por redes metabólicas, reguladoras de genes y de señalización,
se modifica alterando los flujos metabólicos para aumentar las
concentraciones, rendimientos y productividades de
bioproductos innatos y no innatos.1–4]. La capacidad de
producir el producto objetivo está determinada principalmente
por las características fisiológicas del microorganismo; Es
posible que el microorganismo huésped no posea la capacidad
de producir los productos objetivo debido a la falta de las
enzimas metabólicas necesarias o que sea incapaz de soportar
el estrés durante la metabolización.
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la sobreproducción resulta en perturbaciones metabólicas
inevitables que reducen los rendimientos totales de producción.
En los últimos años, la biología sintética ha ganado prominencia
en la ingeniería metabólica debido a su capacidad para crear
nuevos sistemas sintéticos que permiten a los microorganismos
modificados obtener nuevas habilidades que no son inherentes
al microorganismo. Además, permite el ajuste fino de los
circuitos metabólicos y reguladores de genes para lograr un
fenotipo metabólico deseado.5–7]. Aunque hay muchas
definiciones de biología sintética [8], su objetivo es crear nuevas
partes funcionales, módulos, sistemas y, en última instancia,
nuevos organismos mediante el uso integrado de técnicas
biológicas y metodologías matemáticas empleadas en diseños
de ingeniería. Durante la última década, se han desarrollado
una serie de módulos funcionales para redirigir los flujos
metabólicos para producir nuevos compuestos, para calcular
operaciones booleanas de acuerdo con las señales de entrada,
para realizar un comportamiento biológico específico, como el
interruptor ON/OFF y la oscilación, y para permitir la
comunicación. entre las células [9,10-,11–16]. A pesar de los
logros prometedores en biología sintética, el número aún
limitado de componentes estandarizados que interactúan con
otros módulos funcionales para construir sistemas sintéticos y
la falta de una metodología sistemática para optimizar los
sistemas sintéticos para operar de manera confiable en el
organismo huésped de producción son los obstáculos que
deben superarse para el aplicaciones a la ingeniería metabólica
[17]. No obstante, se han desarrollado con éxito vías
metabólicas sintéticas creativas que redirigen los flujos de las
vías metabólicas a la formación de nuevos compuestos diana
para la producción de productos no innatos como combustibles,
productos terapéuticos y plásticos a partir de fuentes
renovables.18--,19-,20-,21-,22–24].
El intento inicial de emplear rutas sintéticas podría mostrar una
productividad relativamente baja porque los flujos en las rutas
metabólicas naturales se han optimizado a través de la evolución
para funcionar de manera eficiente hacia el crecimiento y la
supervivencia celular. Además, las rutas sintéticas compuestas por
enzimas heterólogas que podrían no funcionar juntas en la
naturaleza deben optimizarse para facilitar la conversión de un
metabolito precursor en un producto no innato y, en consecuencia,
mejorar la productividad.
Aquí revisamos los enfoques recientes adoptados para desarrollar
vías sintéticas que permitan a un organismo huésped obtener una
nueva capacidad metabólica que de otro modo no podría lograrse, y
también revisamos los enfoques recientes de optimización de vías
sintéticas, que se han empleado o posiblemente
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
364Biologia de sistemas

tabla 1

Rutas metabólicas sintéticas establecidas en dos cepas huésped favoritas,E. coliyS. cerevisiae

Producto objetivo organismo huésped Enzimas heterólogas incorporadas y productos intermedios Referencia s
utilizado para el metabolitos en rutas sintéticas construidasa
producción de la
producto objetivo

ácido artemisínico S. cerevisiae [31]

1. Isomerasa IPP-DMAPP (idi, S. cerevisiae)

2. FPP sintasa (ispA,S. cerevisiae)
3. Amorfadieno sintasa (ADS, Artemisia annua)
4.CYP71AV1/RCP,ADNc de CYP71/citocromo P450 oxidorreductasa (A. anual)
A. Difosfato de isopentenilo (IPP)
B. Difosfato de dimetilalilo (DMAPP)
C. Farnesil pirofosfato (FPP)
D. Amorfadieno
E. Ácido artemisínico

isopropanol E. coli [19-]

1. Acetoacetil-CoA tiolasa (thl, C. acetobutylicum)

2. Acetoacetil-CoA-transferasa (atoAD, E. coli)
3. Acetoacetato descarboxilasa (adc, C. acetobutylicum)
4. Alcohol deshidrogenasa secundaria (adh, C. beijerinckii)
A. Acetil-CoA
B. Acetoacetil-CoA
C. Acetoacetato
D. Acetona
E. Isopropanol

butanol E. coli [27]

1. Acetoacetil-CoA tiolasa (thl, C. acetobutylicum)

2. 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (hbd, C. acetobutylicum)
3. Crotonasa (crt,C. acetobutylicum)
4. Butiril-CoA deshidrogenasa y flavoproteína de transferencia de electrones (bcd y etf, C. acetobutylicum)
5. Aldehído/alcohol deshidrogenasa (adhE2, C. acetobutylicum)
A. Acetil-CoA
B. Acetoacetil-CoA
C. 3-hidroxibutiril-CoA
D. Crotonil-CoA
E. Butiril-CoA
F. Butiraldehído
G. 1-Butanol

butanol S. cerevisiae [30]

1. Acetoacetil-CoA tiolasa (erg10, S. cerevisiae)

2. 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (hbd, Clostridium beijerinckii)
3. Crotonasa (crt,C. beijerinckii)
4. Butiril-CoA deshidrogenasa (ccr, Streptomyces collinus)
5. Aldehído deshidrogenasa (adhE2, C. beijerinckii)
A. Acetil-CoA
B. Acetoacetil-CoA
C. 3-hidroxibutiril-CoA
D. Crotonoil-CoA
E. Butiril-CoA
F. Butiraldehído
G. Butanol

alcoholesb E. coli

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 Construcción y optimización de rutas sintéticasNa, Kim y Lee 365

Tabla 1 (Continuación)
Producto objetivo organismo huésped Enzimas heterólogas incorporadas y productos intermedios Referencias
utilizado para el metabolitos en rutas sintéticas construidasa
producción de la
producto objetivo

1. 2-cetoácido descarboxilasa (kivd, Lactococcus lactis) [32]

2. Alcohol deshidrogenasa (adh2, S. cerevisiae)
A. Precursores de 2-cetoácidos
B. Diversos intermediarios
C. Alcoholes superiores

Éster de cera (combustible lipídico)E. coli [29]

1. Acil-CoA reductasa (Simmondsia chinensis)

2. Cera éster sintasa (atfA,Acinetobacter baylyi)
A. Ácido graso
B. Alcohol graso
C. Éster de cera
D. Coenzima A tioéster de ácidos grasos

Ácido polilactico E. coli [18--,26]

1.b-Cetotiolasa (phaA, Cupriavidus necator)

2. Acetoacetil-CoA reductasa (phaB, C. necator)
3. PHA sintasa 1 diseñada (phaC1, Pseudomonassp. MBEL 6-19)
4. propionato CoA-transferasa modificada (pct, Clostridium propionicum)
A. Acetil-CoA
B. Acetoacetil-CoA
C. 3-hidroxibutiril-CoA
D. Poli(3-hidroxibutirato-co-lactato)
E. Lactato (CoA de acetil-CoA)
F. Lactil-CoA
G. Homopolímero de ácido poliláctico

ácido glucárico E. coli [28]

1.mio-Inositol-1-fosfato sintasa (INO1, S. cerevisiae)

2. Inositol monofosfatasa (suhB, E. coli)
3.mio-Inositol oxigenasa (MioX, Mus musculus)
4. Uronato deshidrogenasa (ud, Pseudomonas syringae)
A. Glucosa-6-fosfato
B.mio-Inositol-1-fosfato
C.mio-inositol
D.D-ácido glucurónico
MI.D-ácido glucárico

aLas reacciones enzimáticas catalizadas por enzimas endógenas se muestran en una flecha azul oscuro y las catalizadas por enzimas heterólogas se muestran en rojo.

bLa ruta sintética puede convertir 2-cetoácidos (intermedios en las rutas biosintéticas de aminoácidos) en alcoholes superiores: 2-cetobutirato en 1-
propanol, 2-cetovalerato en 1-butanol, 2-ceto-3-metil-valerato en 2-metil -1-butanol, 2-cetoisovalerato a isobutanol, fenilpiruvato a 2-feniletanol y 2-
ceto-4-metil-pentanoato a 3-metil-1-butanol.

aplicable para mejorar la capacidad del microorganismo
huésped para la producción mejorada del producto objetivo.
Construcción de rutas sintéticas
Uno de los enfoques fácilmente utilizables para desarrollar vías
sintéticas es combinar genes de diferentes organismos y
diseñar un nuevo conjunto de vías metabólicas para producir
varios productos naturales y no naturales. El anfitrión
organismo proporciona precursores de sus propios
metabolismos primario y secundario, que posteriormente se
convierten en el producto deseado a través de la expresión de
los genes heterólogos. Como se muestra entabla 1, tales vías
sintéticas heterólogas se han establecido por primera vez con
éxito en los microorganismos bien caracterizados, como
Escherichia coliySaccharomyces cerevisiae,para la producción
de productos industriales y medicamentos [18--,25–32].

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366Biologia de sistemas
Muchos policétidos y péptidos no ribosómicos se utilizan como
fármacos antibióticos, antitumorales e inmunosupresores. Para
producirlos en huéspedes heterólogos comoE. colioS.
cerevisiae,El ensamblaje de todos los genes necesarios que
componen las rutas sintéticas es esencial.33]. Los sistemas
metabólicos para la síntesis de policétidos se componen de
múltiples módulos, en los que un módulo individual consta de
una policétido sintasa (PKS) o una péptido sintetasa no
ribosómico (NRPS). Cada módulo tiene un conjunto específico
de dominios catalíticos que, en última instancia, determinan la
estructura del producto metabólico y, por lo tanto, su función.
Recientemente, Bumpuset al. [34] presentó una estrategia
proteómica para identificar nuevos grupos de genes para la
producción de policétidos y péptidos no ribosómicos y sus vías
biosintéticas mediante la adaptación de la proteómica basada
en espectrometría de masas. Este enfoque permitió la
identificación de genes que se utilizan en la producción del
producto objetivo en una especie, para la cual no se dispone de
una secuencia genómica completa. Esto ejemplifica que las
fuentes de nuevas vías no se limitan a las especies con genomas
completamente secuenciados. Estas nuevas vías identificadas
pueden luego copiarse en una nueva cepa huésped que sea
más adecuada para producir policétidos y péptidos no
ribosómicos a escala industrial.
En los últimos años, los biocombustibles, distintos del bioetanol,
han atraído un renovado interés por su producción eficiente
mediante ingeniería metabólica potenciada por la biología
sintética. Incluyen biodiesel, alcoholes superiores, isoprenoides
y biohidrocarburos.25]. Aunque muchos microorganismos
nativos poseen vías nativas para la conversión de diversos
sustratos en biocombustibles, estas cepas aisladas suelen sufrir
la falta de herramientas genéticas y de biología molecular. Por
lo tanto, la estrategia que combina genes de varios organismos
diferentes para crear la ruta sintética para la producción de
biocombustibles en cepas bien establecidas, comoE. coli,ha sido
perseguido. En particular, se ha prestado una atención creciente
a la producción de alcoholes superiores como sustitutos
potenciales del bioetanol. Elnorte-producción de butanol en un
huésped heterólogoE. coliutilizando la vía tradicional
dependiente de CoA originada a partir deClostridium
acetobutylicumHa sido reportado [27]. También se ideó una
estrategia sintética para producir alcoholes superiores enE. coli
que aprovecha las vías biosintéticas de aminoácidos de cadena
ramificada para generar varios 2-cetoácidos empleando la
amplia gama de sustratos 2-cetoácidos descarboxilasas (KDC),
que son comunes en plantas, levaduras y hongos, y alcohol
deshidrogenasas (ADH) [32].
Otro enfoque importante para establecer vías sintéticas exitosas
que conduzcan a la producción de productos no naturales es la
combinación de ingeniería enzimática e ingeniería metabólica.
20-,22,26,35]. Las enzimas involucradas en las rutas sintéticas
diseñadas a veces pueden ser eficientes, pero en muchos casos
son ineficientes para realizar la bioconversión deseada. En este
último caso, están sujetos
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
a la ingeniería de proteínas y la evolución dirigida para la
mejora de la actividad y la estabilidad de las enzimas y para la
alteración de la especificidad del sustrato y las características
cinéticas. En informes recientes, se investigó la producción
eficiente en un solo paso de base biológica de ácido poliláctico
(PLA) utilizando esta estrategia [18--,26]. Además, se realizaron
estudios sobre la producción de copolímeros que contienen
lactato [18--,26,35]. PLA es un polímero derivado de biomasa
prometedor, pero actualmente se sintetiza mediante un
proceso de dos pasos en el que la producción fermentativa de
ácido láctico es seguida por la polimerización química de lactida,
un dímero de ácido láctico con estructura de anillo. Las enzimas
propionato CoA-transferasa y polihidroxialcanoato sintasa se
tomaron deClostridium propionicumyPseudomonassp. MBEL
6-19, respectivamente, y se sometieron a evolución enzimática
para mejorar su rendimiento de bioconversión; conversión de
lactato a lactil-CoA por el primero y polimerización de lactil-CoA
por el segundo. De este modo,en vivoSe podrían establecer
rutas biosintéticas para la producción de PLA y polímeros que
contienen lactato enE. coli.Dado que el título de polímero era
bastante bajo, las vías metabólicas enE. colifueron diseñadas
racionalmente en base a laen silicosimulación a escala del
genoma para que los precursores adicionales estén disponibles
para la síntesis de polímeros. Este enfoque debería ser
generalmente útil en el desarrollo de cepas modificadas
genéticamente que produzcan bioproductos de interés no
naturales o no innatos.
Optimización de rutas sintéticas
Cuando se construye una vía metabólica sintética compuesta de
enzimas heterólogas y se introduce en una cepa huésped,
normalmente carece de los mecanismos reguladores que controlan
los flujos metabólicos. Además de la distribución del flujo
metabólico global, el desequilibrio del flujo dentro de la vía sintética
puede observarse debido a la presencia de una enzima controladora
de la velocidad (cuello de botella) que puede tener una actividad
catalítica inherente relativamente baja o se expresa a un nivel más
bajo en comparación con otras enzimas. en el mismo camino, lo que
en consecuencia reduce la productividad [36]. El empleo de un
casete de expresión de proteína alternativo con diferente fuerza de
promotor es un enfoque ampliamente utilizado para controlar la
producción de proteína, pero a menudo no funciona como se
esperaba debido a la alteración de la estructura secundaria en el
sitio de unión del ribosoma por la secuencia de codificación de la
proteína. La alteración de la estructura da como resultado un
aumento o disminución de la eficiencia de unión al ribosoma y, por
lo tanto, afecta la eficiencia de la traducción del ARNm.37].
Recientemente, se desarrolló un método computacional para
predecir la tasa de expresión de ARNm y diseñar genes para
producir niveles balanceados de proteínas para la operación
confiable de sistemas sintéticos.38--]. El método computacional
se basa en el modelo termodinámico estadístico que describe el
proceso de traducción y, más específicamente, el proceso de
iniciación de limitación de velocidad.
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 Construcción y optimización de rutas sintéticasNa, Kim y Lee 367
Recuadro 1 Predicción de la tasa de traducción
La traducción del ARNm consta principalmente de tres pasos: iniciación,
elongación y terminación. Entre estos pasos, el inicio de la traducción es el paso
limitante de la velocidad que determina las tasas generales de producción de
proteínas y se procesa mediante varias interacciones moleculares, incluida la
hibridación del ARNr 16S con la secuencia del sitio de unión al ribosoma (D
GRAMOARNm: ARNr), la unión de tRNAfMetal codón de inicio (DGRAMOcomenzar), la
distancia entre el sitio de unión del ARNr 16S y el codón de inicio (DGRAMO
espaciado), y la presencia de estructuras secundarias de ARN alrededor del sitio de
unión al ribosoma (DGRAMOapoyaryDGRAMOARNm) evitando el reclutamiento de
ribosomas en el ARNm. Las interacciones representadas como energía libre
termodinámica de Gibbs cambian para cuantificar las interacciones sobre la
unión del ribosoma (verFigura 1C):
DGRAMOtotal¼DGRAMOARNm: ARNrþDGRAMOcomenzarþDGRAMOespaciado
- protegiendo metabolitos lábiles.39,40--]. El andamio está
DGRAMOapoyarþDGRAMOARNm
La energía liberada que favorece la unión del ribosoma se suma para reducir la
energía libre total de Gibbs, mientras que la energía liberada que ocluye la
unión del ribosoma penaliza la energía libre total de Gibbs. De este modo,D
GRAMOtotal< 0 indica que se favorece la unión del ribosoma al ARNm mediado
por el ARNr 16S y, por lo tanto, aumenta la tasa de traducción resultante,
mientras queDGRAMOtotal> 0 indica que la unión al ribosoma no está favorecida
y la tasa de traducción resultante disminuye. A partir de la energía libre de
Gibbs total estimada de las interacciones moleculares involucradas en el inicio
de la traducción, se puede predecir la eficiencia de traducción general,
proporcional a la tasa de producción de proteína.
que consiste en las interacciones moleculares de mRNA-16S
rRNA, la afinidad de unión de tRNAfMetal codón de inicio, la
distancia entre el sitio de unión del ARNr 16S y el codón de
inicio, y la estabilidad de las estructuras secundarias alrededor
del sitio de unión del ribosoma, incluida una parte de la
secuencia de codificación Nterminal, que ocluye la unión del
ribosoma (verCaja 1yFigura 1c para los detalles) [38--]. Usando
este método computacional, se confirmó que la reutilización de
secuencias idénticas del sitio de unión del ribosoma fusionadas
con la proteína de fluorescencia roja (RFP) con diferentes
secuencias de codificación (LacI, TetR y AraC) da como resultado
diferentes niveles de expresión, lo que indica que simplemente
reemplazando la proteína casete de expresión no garantiza el
logro de los niveles de expresión de proteínas deseados, lo que
resulta en el fracaso en el equilibrio de los niveles de expresión
de proteínas en la vía sintética. Este método computacional
predijo con precisión los niveles de expresión determinados
experimentalmente de más de 100 secuencias de ARNm enE.
coliy los sitios de unión al ribosoma reutilizados también se
fusionaron con diferentes secuencias de codificación (LacI, TetR
y AraC). El método se aplicó con éxito para hacer que el
funcionamiento de un circuito sintético (la puerta AND) fuera
fiable equilibrando la expresión de proteínas en el circuito.
Aunque este sistema no se aplicó directamente para estudiar las
rutas metabólicas, el método podría aplicarse para diseñar las
secuencias genéticas óptimas de las enzimas cuello de botella
para equilibrar el flujo metabólico. El método de diseño
computacional en combinación con la información cinética
disponible sobre las enzimas en la vía sintética nos permitiría
determinar computacionalmente los niveles óptimos de
expresión.
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de todas las enzimas heterólogas en la vía sintética y sus
secuencias genéticas que maximizan el flujo hacia los
productos objetivo.
Además del problema del desequilibrio del flujo, la pérdida
de intermediarios metabólicos por difusión o por rutas
competidoras puede disminuir la eficiencia general de la
ruta sintética. Inspirándose en el mecanismo de túnel de
sustrato de varias enzimas bien estudiadas, se desarrolló
una estrategia creativa de emplear andamios de proteínas
sintéticas capaces de reclutar enzimas espacialmente en
proximidad, reduciendo o evitando la pérdida de
metabolitos por difusión o vías competitivas, y posiblemente
compuesto por dominios de interacción de proteínas,
dominio de unión a GTPasa (GBD), dominio SH3 y dominio
PSD95/DlgA/Zo-1 (PDZ), que reclutan proteínas fusionadas
con sus correspondientes ligandos peptídicos (Figura 1b). El
andamio compuesto por los dominios GBD-SH3-PDZ mostró
una mejora de 2,6 veces en el título de mevalonato en
comparación con la vía del mevalonato sintético sin el
andamio. Estos resultados indican que lograr la proximidad
espacial de las enzimas lideradas por el andamio que imita
el túnel del sustrato mejoró el rendimiento de la ruta
sintética y, por lo tanto, la estrategia del andamio sintético
puede servir como otra forma de optimización de la ruta
sintética. Además, la proporción de enzimas reclutadas en el
andamio podría alterarse de manera controlada variando
las proporciones de los dominios de unión (GBDX-SH3y-PDZ
z)para equilibrar las actividades enzimáticas en el andamio.
Entre las diversas combinaciones de proporciones de
dominio examinadas, GBD1–SH32–PDZ2mejoró
drásticamente el título de producción de mevalonato en 77
veces, incluso cuando las enzimas de la vía sintética se
expresaron en niveles bajos. La cooptimización de la
proximidad espacial y la relación relativa de las enzimas
reclutadas mejoró la eficiencia de la vía sintética que
condujo a un título mucho más alto de un producto objetivo.
Por lo tanto, los andamios de proteínas sintéticas
proporcionan un marco programable para el ajuste fino de
los flujos de vías sintéticas y se espera que se apliquen para
la optimización de otras vías metabólicas sintéticas en otros
microorganismos huésped, gracias a las características de
plegamiento estable de los dominios de interacción.
Las estrategias presentadas anteriormente permiten mejorar la
eficiencia intrínseca de las rutas sintéticas, pero no recuperan
los mecanismos de regulación en un contexto metabólico
global. Las vías desreguladas, aunque optimizadas localmente,
podrían conducir a perturbaciones metabólicas desfavorables
en el microorganismo huésped y, en consecuencia, a títulos y
productividad subóptimos de un producto deseado. Por lo
tanto, será un gran desafío para los ingenieros metabólicos
desarrollar estrategias para incorporar los circuitos reguladores
que controlan las vías sintéticas de la manera deseada. De
hecho, ha habido varios informes que abordan este desafío. Por
ejemplo, un circuito sintético tiene
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
368Biologia de sistemas

Figura 1

Construcción y optimización de rutas sintéticas. Las vías sintéticas construidas se introducen en una cepa huésped para la producción de bioproductos no innatos o no naturales de interés. Cifra (a)representa un
proceso general para la construcción de rutas sintéticas y las figuras (b)y (C)muestran dos ejemplos emocionantes de optimización de rutas sintéticas. (a) Se ensambla una ruta sintética que convierte un
metabolito intracelular en un producto diana no innato utilizando las enzimas heterólogas o incluso evolucionadas (genes) en una cepa huésped de interés. (b) Los efectos beneficiosos del empleo de andamios de
proteínas sintéticas en el funcionamiento óptimo de la ruta del mevalonato sintético. Debido a la baja actividad catalítica de la hidroxil-metilglutaril-CoA reductasa (HMGR), la vía desequilibrada del mevalonato
acumula un metabolito intermedio hidroxil-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), inhibe el crecimiento celular y, en consecuencia, reduce la producción de mevalonato. Los andamios de proteínas sintéticas proporcionan
un marco que acerca las enzimas metabólicas mediante el uso de dominios de interacción de proteínas y, por lo tanto, crea el llamado túnel de sustrato en el que los intermediarios metabólicos se mueven
rápidamente entre los sitios activos de las enzimas. El dominio GBD recluta elE. coliacetoacetil-CoA tiolasa (AtoB), mientras que los dominios SH3 y PDZ reclutan hidroxil-metilglutaril-CoA sintasa (HMGS) y HMGR de
Saccharomyces cerevisiae,que fueron optimizados por codones para una expresión eficiente enE. coli.Se informó que los andamios con un solo dominio GBD-SH3-PDZ mejoran el título de producción en
aproximadamente 2,6 veces y la optimización de la proporción de enzimas reclutadas (GBD-SH3X2–PDZX2) aumentó drásticamente el título de producción hasta 77 veces. (c) El enfoque de la biología sintética hacia
la optimización de las regiones aguas arriba de los genes para que se expresen como una vía sintética. Las figuras en la parte inferior derecha muestran los términos de energía libre de Gibbs que representan las
interacciones moleculares implicadas en el inicio de la traducción y que se utilizan para la predicción de los niveles de expresión de la proteína. A la izquierda se muestra el complejo ribosomal 30S y una parte del
rRNA 16S complementario a la secuencia Shine-Dalgarno. La figura también ilustra la aplicación ejemplar del método para optimizar el flujo metabólico de una vía sintética. En la vía desequilibrada, los niveles
relativos de enzimas (denominados E1, E2 y E3) no están equilibrados y el título del producto resultante puede ser bajo. Más específicamente, la actividad catalítica de E1 (representada como la escala del cilindro)
es lo suficientemente alta como para impulsar el flujo a E2, pero el E2 menos activo no puede entregar suficientes intermediarios metabólicos a E3, lo que resulta en la acumulación del metabolito intermedio y la
reducción de la formación del producto. El método computacional descrito en el texto permite la optimización del flujo global a lo largo de la vía sintética. En este ejemplo, las secuencias genéticas óptimas con los
niveles de expresión deseados se implementan para reducir el nivel de expresión de E1 mientras se aumenta el nivel de E2 para compensar su baja actividad catalítica. El método computacional descrito en el texto
permite la optimización del flujo global a lo largo de la vía sintética. En este ejemplo, las secuencias genéticas óptimas con los niveles de expresión deseados se implementan para reducir el nivel de expresión de
E1 mientras se aumenta el nivel de E2 para compensar su baja actividad catalítica. El método computacional descrito en el texto permite la optimización del flujo global a lo largo de la vía sintética. En este ejemplo,
las secuencias genéticas óptimas con los niveles de expresión deseados se implementan para reducir el nivel de expresión de E1 mientras se aumenta el nivel de E2 para compensar su baja actividad catalítica.

ha sido desarrollado para controlar dinámicamente la Conclusión

expresión de enzimas clave en la vía metabólica para la
producción de licopeno en respuesta al acetil fosfato
intracelular (ACP) como indicador de la disponibilidad de
glucosa. El circuito permitió una mejora exitosa de la
producción de licopeno mientras reducía la producción del
subproducto acetato. Se espera que todos estos enfoques y
nuevas estrategias a desarrollar permitan el diseño, la
síntesis y la implementación de rutas sintéticas optimizadas
para la producción eficiente de diversos bioproductos.12].
Los microorganismos se han convertido en una plataforma cada vez
más importante para la producción de productos químicos,
combustibles y materiales a partir de recursos renovables. Los
avances en biología sintética capaces de diseñar circuitos celulares
para proporcionar a las células nuevas capacidades metabólicas o
fisiológicas están abriendo un nuevo camino para rediseñar
microorganismos y desarrollar cepas industrialmente atractivas
para la producción de productos no innatos o incluso productos no
naturales. Durante la última década, numerosos módulos
regulatorios sintéticos prometedores han sido construidos y

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 Construcción y optimización de rutas sintéticasNa, Kim y Lee
incluso muchos más están en marcha. Se espera que estos
módulos sean capaces de regular dinámicamente los flujos
metabólicos generales en respuesta a diversas perturbaciones
intracelulares y extracelulares, optimizando así los flujos para la
producción mejorada de un producto deseado. Es necesario
desarrollar un marco de aplicación general para construir
sistemas más complejos conectando los módulos al
microorganismo huésped para un uso más generalizado de
dicho enfoque. Sin embargo, se espera de los ejemplos exitosos
anteriores que la integración de la biología sintética con la
ingeniería metabólica permita la construcción de
microorganismos ideales que posean muchas capacidades
metabólicas nuevas y optimizadas que están ausentes en los
microorganismos huéspedes utilizados en el pasado y, en
consecuencia, sirva como una estrategia esencial para
desarrollar fábricas ideales de células microbianas.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Investigación de Biología de
Sistemas de Corea (20090065571) del Ministerio de Educación, Ciencia y
Tecnología (MEST) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea
(NRF). Se agradece el apoyo adicional del Programa Universitario de Clase
Mundial (R32-2008-000-10142-0) del MEST a través de NRF, la cátedra LG
Chem, el programa IBM SUR y Microsoft. Nos gustaría agradecer al Dr. Jin
Hwan Park por su ayuda en la redacción del manuscrito.
Referencias y lecturas recomendadas
Los artículos de particular interés, publicados dentro del período de revisión, se
han destacado como:
- de especial interés
- - de interés pendiente
1. Lee SY, Papoutsakis ET:Ingeniería Metabólica.Nueva York: Marcel
Dekker; 1999.
2. Park JH, Lee SY, Kim TY, Kim HU:Aplicación de la biología de sistemas para
el desarrollo de bioprocesos.Tendencias Biotecnología2008, 26:
404-412.
3. Lee KH, Park JH, Kim TY, Kim HU, Lee SY:Ingeniería metabólica de
sistemas deEscherichia coliparaL-producción de treonina.Mol Syst
Biol2007,3:149.
4. Otero JM, Nielsen J:Biología de sistemas industriales.Biotecnología
Bioeng2010,105:439-460.
5. Weber W, Fussenegger M:El impacto de la biología sintética en el descubrimiento
de fármacos.Descubrimiento de drogas hoy2009,14:956-963.
6. Picataggio S:Impacto potencial de la biología sintética en el desarrollo
de sistemas microbianos para la producción de combustibles
renovables y productos químicos.Curr Opin Biotecnología2009, 20:
325-329.
7. Salvaje DF, Vía J, Plata PA:Combustible de desfosilización: cómo la biología sintética
puede transformar la producción de biocombustibles.ACS Chem Biol2008, 3:13-16.
8. Nueva característica: ¿Qué hay en un nombre?Nat biotecnología2009, 27:
1071-1073.
9. Sorokina O, Kapus A, Terecskei K, Dixon L, Kozma-Bognar L, Nagy F,
Millar A:Un sistema conmutable de entrada y salida de luz
modelado y construido en levadura.J Biol Ing2009,3:15.
10. Fung E, Wong WW, Suen JK, Bulter T, Lee SG, Liao JC:A
- Oscilador metabólico genético sintético.Naturaleza2005,435:
118-122. Se informa sobre el desarrollo de un oscilador sintético que
incluye reacciones transcripcionales y metabólicas. En presencia de acetil
fosfato el circuito induce la expresión delacgen que transforma el fosfato
de acetilo en acetil-CoA y reprime la expresión deptagen que convierte
acetil-CoA en acetil fosfato. En ausencia de acetil-CoA, el circuito induce la
expresión de laptagene. a diferencia de otros
www.cienciadirecta.com
369
osciladores informados basados en la regulación de la transcripción, este circuito
integra regulaciones transcripcionales y metabólicas.
11. Elowitz MB, Leibler S:Una red oscilatoria sintética de
reguladores transcripcionales.Naturaleza2000,403:335-338.
12. Granjero WR, Liao JC:Mejorar la producción de licopeno en
Escherichia colipor ingeniería de control metabólico.Nat
biotecnología2000,18:533-537.
13. Basu S, Mehreja R, Thiberge S, Chen MT, Weiss R: Control
espaciotemporal de la expresión génica con redes generadoras de
pulsos.Proc Natl Acad Sci EE. UU.2004,101:6355-6360.
14. Ashkenasy G, Ghadiri MR:Funciones lógicas booleanas de
una red peptídica sintética.J Am Chem Soc2004, 126:
11140-11141.
15. Leonard E, Nielsen D, Solomon K, Prather KJ:Microbios de
ingeniería con marcos de biología sintética.Tendencias
Biotecnología2008,26:674-681.
16. Voigt CA:Piezas genéticas para programar bacterias.Curr Opin
Biotecnología2006,17:548-557.
17. Iglesia GM:De la biología de sistemas a la biología sintética.Mol
Syst Biol2005,1:0032.
18. Jung YK, Kim TY, Park SJ, Lee SY:ingeniería metabólica de
- - Escherichia colipara la producción de ácido poliláctico y sus
copolímeros.Biotecnología Bioeng2010,105:161-171.
Una vía metabólica sintética fue desarrollada e introducida enE. coli para la
producción de prometedores plásticos derivados de biomasa, ácido poliláctico
y sus copolímeros. Requirió la creación de nuevas enzimas y el diseño de rutas.
El metabolismo del organismo huésped se optimizó aún más eliminando
genes innecesarios y optimizando la expresión de genes necesarios con la
ayuda deen silicoanálisis de flujo a escala del genoma.
19. Hanai T, Atsumi S, Liao JC:Vía sintética diseñada para
- producción de isopropanol enEscherichia coli.Appl Environ
Microbiol2007,73:7814-7818.
Una vía sintética para la producción de isopropanol enE. coliesta reportado. La
vía sintética que convierte acetil-CoA en isopropanol a través de varias
reacciones catalíticas de enzimas originadas a partir deC. acetobutylicum, C.
beijerinckiiyTermoanaerobacter brockiiactivadoE. colipara superar a los
organismos productores de isopropanol nativos.
20. Zhang K, Sawaya MR, Eisenberg DS, Liao JC:En expansión
- metabolismo para la biosíntesis de alcoholes no naturales.Proc Natl
Acad Sci EE. UU.2008,105:20653-20658.
Se informa sobre un nuevo enfoque de empleo de la ruta de la isoleucina para la producción
de nuevos alcoholes C5-C8 junto con la ingeniería de enzimas clave relacionadas con el
alargamiento y la descarboxilación de la cadena de carbono. Este trabajo presentó bien los
enfoques que se pueden tomar para diseñar nuevas vías metabólicas para la producción de
productos químicos, incluidos los alcoholes presentados como ejemplos en este documento.
21. Chang MCY, Eachus RA, Trieu W, Ro DK, Keasling JD:
- IngenieríaEscherichia colipara la producción de terpenoides
funcionalizados usando plantas P450s.Nat Chem Biol2007,3:274-277. Los
autores presentaron el primer ejemplo de producción de terpenoides,
importantes precursores de productos farmacéuticos, enE. coli.Por ello, la
dificultad de expresar funcionalmente el citocromo P450s vegetal enE. colifue
superada con éxito.
22. Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, del Cardayre SB,
Keasling JD:Producción microbiana de combustibles derivados de ácidos
grasos y productos químicos a partir de biomasa vegetal.Naturaleza2010,
463:559-562.
23. Kizer L, Pitera DJ, Pfleger BF, Keasling JD:Aplicación de la genómica
funcional a la optimización de vías para aumentar la producción
de isoprenoides.Appl Environ Microbiol2008, 74:3229-3241.
24. Nielsen DR, Leonard E, Yoon SH, Tseng HC, Yuan C, Prather KLJ:
Ingeniería de plataformas alternativas de producción de butanol en
bacterias heterólogas.metab ing2009,11:262-273.
25. Alper H, Stephanopoulos G:Ingeniería para biocombustibles: ¿explotación de la
capacidad microbiana innata o importación del potencial biosintético?
Nat Rev Microbiol2009,7:715-723.
26. Yang TH, Kim TW, Kang HO, Lee SH, Lee EJ, Lim SC, Oh SO, Song AJ,
Park SJ, Lee SY:Biosíntesis de ácido poliláctico y
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
370Biologia de sistemas
sus copolímeros utilizando propionato CoA transferasa evolucionada y
PHA sintasa.Biotecnología Bioeng2010,105:150-160.
27. Atsumi S, Cann A, Connor M, Shen C, Smith K, Brynildsen M, Chou K,
Hanai T, Liao J:ingeniería metabólica deEscherichia colipara la
producción de 1-butanol.metab ing2008,10:305-311.
28. Moon T, Yoon S, Lanza A, Roy-Mayhew J, Prather K:Producción de
ácido glucárico a partir de una ruta sintética en recombinante
Escherichia coli.Appl Environ Microbiol2009,75:589.
29. Kalscheuer R, Stoveken T, Luftmann H, Malkus U, Reichelt R, Steinbuchel
A:Biosíntesis de lípidos neutros en ingeniería Escherichia coli:ésteres de
cera similares al aceite de jojoba y ésteres de butilo de ácidos grasos.
Appl Environ Microbiol2006,72:1373-1379.
30. Steen E, Chan R, Prasad N, Myers S, Petzold C, Redding A, Ouellet M,
Keasling J:ingeniería metabólica deSaccharomyces cerevisiaepara la
producción denorte-butanol.Hecho de células microbianas 2008,7:36.
31. Ro DK, Paradise EM, Ouellet M, Fisher KJ, Newman KL, Ndungu JM, Ho KA,
Eachus RA, Ham TS, Kirby Jet al.:Producción del precursor del fármaco
antipalúdico ácido artemisínico en levadura modificada.Naturaleza
2006,440:940-943.
32. Atsumi S, Hanai T, Liao JC:Vías no fermentativas para la síntesis de
alcoholes superiores de cadena ramificada como biocombustibles.
Naturaleza2008,451:86-89.
33. Khosla C, Kapur S, Cane D:Revisando la modularidad de las policétido
sintasas modulares.Curr Opin Chem Biol2009,13:135-143.
34. Bumpus S, Evans B, Thomas P, Ntai I, Kelleher N:Un enfoque
proteómico para descubrir productos naturales y sus
rutas biosintéticas.Nat biotecnología2009,27:951-956.
35. Taguchi S, Yamada M, Matsumoto Ki, Tajima K, Satoh Y, Munekata
M, Ohno K, Kohda K, Shimamura T, Kambe Het al.:A
Opinión actual en microbiología2010,13:363–370
fábrica microbiana para poliésteres a base de lactato utilizando una enzima
polimerizadora de lactato.Proc Natl Acad Sci EE. UU.2008, 105:17323-17327.
36. Pitera DJ, Paddon CJ, Newman JD, Keasling JD:Equilibrar una vía
heteróloga de mevalonato para mejorar la producción de
isoprenoides enEscherichia coli.metab ing2007, 9:193-207.
37. De Smit M, Van Duin J:La estructura secundaria del sitio de unión
del ribosoma determina la eficiencia de la traducción: un análisis
cuantitativo.Proc Natl Acad Sci EE. UU.1990,87:7668.
38. Salis HM, Mirsky EA, Voigt CA:Diseño automatizado de sintético
-- sitios de unión al ribosoma para controlar la expresión de proteínas.Nat
biotecnología2009,27:946-950.
Los autores presentaron un método computacional para predecir la tasa de
iniciación de la traducción que es proporcional a la tasa de producción de
proteínas. El método se basa en el modelo termodinámico estadístico que
considera las interacciones moleculares implicadas en el inicio de la traducción
para predecir la tasa de inicio de la traducción que puede verse afectada por la
secuencia de codificación aguas abajo aunque se utilice el mismo casete de
expresión.
39. Millas EW, Rhee S, Davies DR:La base molecular de la canalización
de sustrato.J Biol Chem1999,274:12193-12196.
40. Dueber JE, Wu GC, Malmirchegini GR, Moon TS, Petzold CJ,
-- Ullal AV, Prather KLJ, Keasling JD:Los andamios de proteínas sintéticas
proporcionan un control modular sobre el flujo metabólico.Nat biotecnología
2009,27:753-759.
Los autores presentaron andamios de proteínas sintéticas que reclutan enzimas
metabólicas implicadas en la vía biosintética del mevalonato, inspirados en el
mecanismo de tunelización de sustratos mediante el cual los sustratos se mueven
rápidamente de un sitio activo a otro sin pérdida por difusión o degradación. Los
andamios juntan físicamente las enzimas en proximidad e imitan el túnel del
sustrato, lo que da como resultado un aumento espectacular de la producción de
mevalonato.
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